復合富硒植物固體飲料的制備及其生物活性研究

鄭貴娟，羅建群，南占東，楊 敏，何美軍,4,*，姚廣民,2,*

（1.華中科技大學同濟醫學院藥學院，湖北武漢 430030；2.恩施硒禾生物科技有限公司，湖北恩施 445000；3.恩施硒司令生態農業科技發展有限公司，湖北恩施 445000；4.湖北省農業科學院中藥材研究所，湖北恩施 445000）

硒（Selenium，Se）是一種稀散的元素[1]，在自然界中的含量及其稀少。世界衛生組織和國內營養組織認定硒是人體必需的微量元素之一[2]，缺硒會嚴重影響人體健康，如克山病、大骨節病、免疫缺陷和甲狀腺疾病等[3-5]。硒元素在自然界中存在有機硒和無機硒兩種方式，其中有機硒包括硒蛋白、硒代氨基酸及硒多糖等，它們容易被人體吸收，但其物質成本高且成分復雜[6]。人體硒的主要來源是通過食物攝入，其中富硒農作物是人體獲取有機硒的重要途徑之一[7-8]。恩施州，譽有“世界硒都，中國硒谷”的美稱，擁有不可替代的世界級硒資源，具有發展天然富硒特色農業和硒精深加工產業的頂級資源優勢[9]。

西蘭花富含抗壞血酸、硫代葡萄糖苷等活性成分[10]，聚硒能力強[11]，具有抗衰老、防癌抗癌、增強機體免疫力等作用。葛根富含葛根素及異黃酮類物質，具有抗氧化、解酒護肝、預防骨質疏松等功效[12]。藤茶中富含多酚類物質以及兒茶素的氧化聚合成分，具有抗炎、降血壓、降血脂等作用[13-14]。黃精富含甾體皂苷、黃精多糖和黃精低聚糖，能補氣養陰，健脾潤肺，具有增強免疫功能、抗衰老、耐缺氧、抗疲勞等作用。木瓜性溫味酸，平肝和胃，具有抗氧化、增強人體免疫力等作用。西紅柿富含胡蘿卜素和番茄紅素，對抗衰老、預防癌癥、降低心血管疾病等具有積極作用[15]。恩施地區豐富的藥食同源植物因富含硒元素而具有更高的營養價值[16]，是發展有機硒產業的資源寶庫。

近年來，隨著生活水平的提高，人們醫療消費觀念也從治已病轉向“預防和保健”[17]。保健飲料越來越受到消費者青睞，具有廣闊的市場需求和發展前景。目前市售富硒固體飲料包括富硒葛桑飲、富硒黑木耳固體飲料、富硒姬松茸固體飲料、富硒麥芽粉固體飲料、富硒蛋白粉固體飲料等，配制原料通常為一種或兩種，配伍簡單，成分相對單一，且未見相關功能性研究的報道。本研究以藥食同源植物材料富硒西蘭花、葛根、藤茶、黃精、木瓜和西紅柿等六種原料合理配伍，開發一款復合富硒植物功能性固體飲料，營養成分豐富。本研究對其開展多種功能活性評價，包括抗腫瘤細胞增殖活性、抗氧化活性和鎮痛活性等，并首次報道對該類固體飲料的抗腫瘤活性和鎮痛活性研究。該富硒固體飲料的開發對于預防疾病、強身保健具有重要現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

富硒西蘭花、葛根、藤茶、黃精、木瓜、西紅柿等新鮮材料 恩施硒禾生物科技有限公司；硒標準溶液（1000 μg/mL） 國家有色金屬及電子材料分析檢測中心；3-（4,5-dimethylthiazol-2-yl）-5（3-carboxymethoxyphenyl）-2-（4-sulfopheny）-2H-tetrazolium（MTS）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、N-乙酰半胱氨酸（NAC）、2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFHDA）、順鉑（DDP）、紫杉醇（Taxol）和維生素C 等Sigma 試劑公司；Biosharp 胎牛血清、DMEM 細胞培養液、RMPI-1640 細胞培養液、PBS 緩沖鹽溶液、細胞裂解液、H2O2、DMSO、HNO3、生理鹽水和瓊脂培養基等 迪米特（武漢）生物試劑有限公司；無水乙醇、冰醋酸 分析純，國藥集團有限公司；大腸桿菌CICC10389、沙門氏菌CICC21513、志賀氏菌CICC21680 和金黃色葡萄球菌CICC21600 等微生物標準菌液 中國工業微生物菌種保藏管理中心；肺癌細胞A549、肝癌細胞SMMC-7721、乳腺癌細胞MCF-7、結腸癌細胞SW480、人肺上皮細胞BEAS-2B、人肝癌LO2 細胞等細胞 實驗室自存細胞株；昆明KM 小鼠 80 只，雌雄各半，體重約18～22 g，華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心，實驗動物使用許可證號SCXK（湖北）2021-0057，生產許可證號SCXK（湖北）2020-0018。

DHG-9240A 鼓風干燥箱 上海超鴻儀器設備有限公司；PSD 型離心機 張家港市恒安機械制造有限公司；HZ-TNG 多功能提取濃縮機組 上海輝展實驗設備有限公司；XDW-6 系列超微粉碎機 濟南達微機械有限公司；GMS 紅外干燥滅菌烘箱 常州市龍杰干燥機械有限公司；AFS-820 原子熒光光度計 北京吉天儀器有限公司；TE2000-S 熒光倒置顯微鏡 日本尼康公司；Bio-Rad680 多功能酶標儀北京東迅天地醫療儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 復合富硒植物固體飲料的研制 操作要點：

a.分選、去雜和漂洗：選取基地種植的富硒西蘭花、葛根、藤茶、黃精、木瓜和西紅柿等原料，其中干燥后的植物原料中硒含量均不低于150 μg/kg[18]。將泥土、雜質去除，原材料清洗干凈、瀝水。

b.預處理：根據物料特性將原料剪切和破碎等均勻處理。

c.干燥：將剪切后的西蘭花、黃精、藤茶、葛根、木瓜和西紅柿用鼓風干燥箱進行干燥，溫度不高于60 ℃，烘干后含水率3%～8%。

d.加熱浸提：按干燥后重量將西蘭花、葛根、藤茶、黃精、木瓜、西紅柿按照3:4:2:2:2:2 配伍，加入蒸餾水在60 ℃浸提2 h，料液比為10:1。

e.過濾、脫色：用100 目網篩的濾袋裝離心機過濾，除去廢渣、顆粒性物質以及沉淀的淀粉等，得到濾液I。將濾液I 用活性碳柱進行脫色處理，得到濾液II。

f.濃縮：將濾液II 真空濃縮，溫度60 ℃，真空度-0.06 Mpa，濃縮至相對密度為1.08～1.22，放置室溫無菌狀態下冷卻，得到提取物干膏。

g.干膏粉碎：將提取物干膏粉碎，過100 目篩，得到固體粉末，即為富硒固體復合固體飲料。

h.檢驗：對產品感官品質、微生物限度以及硒含量等進行檢驗。

1.2.2 復合富硒植物固體飲料感官評價指標測定稱取5 g 樣品于潔凈玻璃杯中，在室溫、自然光環境下用肉眼觀察其色澤和外觀形態。稱取一定量樣品按照比例在無色玻璃杯中沖溶稀釋后，立即嗅其香氣，辨其滋味，靜置2 min 后，觀察燒杯底部有無沉淀。選擇10 名有經驗的專業人員（男6 名，女4 名），年齡在20～35 之間的成員組成的品評小組，分別從色澤（25 分）、滋味（25 分）、香氣（25 分）和組織形態（25 分）等方面綜合評定復合富硒植物固體飲料的品質[14]，滿分100 分。品評指標見下表1。

1.2.3 微生物指標測定 參考國家標準GB 4789.2-2016[19]、 GB 4789.3-2016[20]和 GB 4789.4-2016[21]測定復合富硒植物復合固體飲料中菌落總數、大腸桿菌數和致病菌數。取10 g 富硒復合固體飲料裝入有100 mL 生理鹽水的無菌均質袋中，制成1:10 的樣品溶液；取1:10 的樣品溶液1 mL，沿管壁緩慢注入裝有9 mL 生理鹽水的無菌試管中，注意吸管不要觸碰稀釋液面，振搖試管混合均勻，制成1:100 的樣品溶液；取1:100 的樣品溶液1 mL，沿管壁緩慢注入裝有9 mL 生理鹽水的無菌試管中，振搖試管混合均勻，制成1:1000 的樣品溶液。根據每個活的細菌能長出一個菌落的原理設計，分別吸取1 mL 的1:10、1:100、1:1000 的樣品溶液于無菌平板中，每個濃度平行做3 個平板。同時，吸取1 mL 的空白稀釋液加入3 個無菌平板中作為空白對照，吸取1 mL標準菌液加入3 個無菌平板中作為陽性對照。加入瓊脂培養基，并混合均勻，在37 ℃下培養48 h，根據培養出的菌落數，計算活菌數。

1.2.4 復合富硒植物固體飲料硒含量的測定 采用熒光光度法測定復合富硒植物固體飲料中的硒含量[22]。使用體積分數為5% HNO3溶液，將硒標準儲備液逐級稀釋，配制系列濃度0、0.5、1、5、10、20、40 和80 μg/L，制備硒標準溶液。

稱取復合富硒固體飲料粉末0.5 g 置于石英試管中，加入5% HNO3溶液10 mL，H2O2溶液5 mL，浸泡12 h，放入微波消解儀中消解10 min（功率1000 W，溫度130 ℃）。冷卻后超聲脫氣5 min，定容至25 mL，搖勻，待測定硒含量，平行測定3 次，同時做空白實驗。

1.2.5 復合富硒植物固體飲料抑制腫瘤細胞增殖活性測定 采用MTS 法[23-26]評價該固體飲料對4 株腫瘤細胞（肺癌A549、肝癌SMMC-7721、乳腺癌MCF-7 和結腸癌SW480）和1 株正常肺上皮細胞（BEAS-2B）的細胞增殖活性的影響。設定順鉑（DDP）和紫杉醇（Taxol）為2 組陽性對照，添加劑DMSO 為陰性對照。

用含10%胎牛血清的細胞培養液（DMEM 或RMPI-1640）配成單細胞懸液種于96 孔板（1×104個/孔），每孔體積100 μL，培養24 h 后加入待測定樣品溶液。植物硒固體飲料的粉末用DMSO 溶解，以100 μg/mL 濃度初篩，每孔終體積為200 μL，每種處理均設3 個復孔。在細胞培養箱中37 ℃，5% CO2培養48 h 后，吸棄孔內培養液，每孔加20 μL MTS溶液和100 μL 培養液，繼續孵育2～4 h。使用多功能酶標儀讀取492 nm 波長下各孔光吸收值，記錄結果，處理數據。

1.2.6 復合富硒植物固體飲料抗氧化活性測定

1.2.6.1 復合富硒植物固體飲料DPPH 自由基清除力的測定 精確稱取復合富硒植物固體飲料的粉末樣品，用無水乙醇配置成濃度梯度的溶液（50、100、200、500、1000 和2000 μg/mL），取100 μL 樣品溶液，加入100 μL 0.2 mol/L DPPH 溶液、立即混勻，每種處理均設3 個復孔。室溫避光放置30 min，使用多功能酶標儀讀取517 nm 波長下各孔光吸收值[27-28]。設定維生素C 為陽性對照，無水乙醇為陰性對照組，按如下公式計算清除率。

式中：AS為DPPH 溶液加入樣品后的吸光度值；Asb為樣品本身的吸光度值（不加DPPH 溶液）；Ab為空白組吸光度值。

1.2.6.2 復合富硒植物固體飲料對H2O2誘導LO2細胞形態的影響 實驗分組：空白對照組、H2O2造模組、N-乙酰半胱氨酸（NAC）陽性藥組和待測定樣品組，每組均設定3 個復孔。設定復合固體飲料粉末濃度梯度為5、10、15、20、30 和50 μg/mL。

實驗步驟參照文獻[29]，取處于對數生長期且生長狀態良好的LO2 細胞，消化計數后接種于24 孔板（4×104個/孔），每孔體積500 μL，培養24 h 后加入待測定樣品。用培養基稀釋樣品儲備液至待測定樣品的濃度，每孔加入500 μL 樣品，其中空白對照組、H2O2造模組只加入培養基，NAC 陽性對照組加入4 mmol/L NAC，繼續培養24 h。吸棄孔內液體，用PBS 潤洗兩次，所有組加入H2O2（1 mmol/L）作用30 min。吸除H2O2，PBS 潤洗兩次，每孔加10 μmol/L DCFH-DA 染色30 min，室溫下避光。每孔用PBS 潤洗兩次，吸除PBS 后在熒光顯微鏡下拍照（放大200 倍），觀察各組LO2 細胞形態。

1.2.6.3 復合富硒植物固體飲料對H2O2誘導LO2細胞內活性氧的影響 利用DCFH-DA 熒光探針法[30-31]評價該固體飲料對H2O2誘導LO2 細胞內活性氧影響。

實驗分組和細胞培養步驟同上述1.2.6.2，設定復合固體飲料粉末濃度梯度為5、10、15 和20 μg/mL。每組細胞加入H2O2誘導后，每孔加入400 μL 裂解液，室溫下避光搖床孵育10 min，將24 孔板中的裂解液分別加至黑框透明底的96 孔板的3 個孔中（100 μL/孔）。采用熒光酶標儀檢測細胞內活性氧熒光強度，激發光波長488 nm，發射光波長520 nm。

1.2.7 復合富硒植物固體飲料鎮痛活性的測定 昆明KM 小鼠，體重約18～22 g，為避免由于性別差異造成的實驗誤差，小鼠雌雄各半分成八組，每組10只。動物實驗經華中科技大學同濟醫學院實驗動物倫理委員會批準（批準文號2021-S748），實驗人員嚴格遵守動物倫理準則。

設模型組（0.9% NaCl 溶液），陽性對照組（嗎啡溶液5、1、0.2 和0.04 mg/kg）[32-35]和復合植物固體飲料的高中低三個劑量組（250、50 和10 mg/kg[36-37]，標記為A1、A2 和A3）。

小鼠在醋酸誘導疼痛模型下會表現出比較明顯的扭體反應，而具有鎮痛效果的活性成分則會減少扭體次數[32-35]。小鼠出現腹部內凹，軀干與后肢伸張，臀部高起等行為[37]，稱為一次完整的扭體反應。實驗前小鼠禁食不禁水12 h，各組小鼠稱重。將每只小鼠單獨放在鐵網籠里獨立觀察，腹腔注射不同劑量的待測定樣品溶液30 分鐘后，腹腔注射0.8% V/V 的醋酸溶液（0.1 mL/10 g），記錄每只小鼠30 min 內的扭體次數。

鎮痛抑制率（%）= [（模型組扭體次數-給藥組扭體次數）/模型組扭體次數]×100

1.3 數據處理

各組實驗數據均以平均值±方差表示，采用統計軟件GraphPad Prism 8.0 進行統計分析并繪圖，兩組數據間比較采用t檢驗法，*P＜0.05、**P＜0.01 和***P＜0.001 表示具有顯著性差異，ns 表示無顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 感官指標

分別從色澤、滋味、香氣和組織等四方面綜合評定復合富硒植物固體飲料的感官品質，四個評定項目的權重相同，綜合品評小組10 人的打分，該樣品感官指標得分均值為92.15 分。該復合富硒植物固體飲料溶解后呈淺黃色，色澤均一；口感好，酸甜可口，后味綿長；澄清透明，組織細膩；香氣濃郁協調。

2.2 微生物指標

固體飲料中微生物指標的標準值為菌落總數≤30000 CFU/g，大腸桿菌≤900 MPN/kg，不得檢出沙門氏、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌等致病菌。按照微生物檢測方法測得該復合富硒植物固體飲料中的菌落數≤1000 CFU/g，大腸桿菌≤40 MPN/kg，且未檢測出相關致病菌，符合國家標準要求（GB 4789.2-2016、GB 4789.3-2016 和GB 4789.4-2016）。

2.3 復合富硒植物固體飲料中硒含量測定

以質量濃度（μg/L）為橫坐標，熒光強度值為縱坐標，繪制硒溶液標準曲線。硒含量在0～80 μg/L 范圍內線性關系良好，相關系數為0.9999，回歸方程為Y=112.50X-5.82（圖1）。根據湖北省制定的《富有機硒食品硒含量要求》中規定食品中的總硒含量達到150 μg/kg（固體）或75 μg/L（液體），即可稱“富含硒”或“富硒”食品。通過對復合富硒固體飲料的樣品進行硒含量檢測，其總硒含量為540±30.12 μg/kg，符合富硒要求。

圖1 硒含量標準曲線Fig.1 Standard curve of selenium content

2.4 復合富硒植物固體飲料抑制腫瘤細胞增殖作用

以細胞抑制率為縱坐標，順鉑（DDP）和紫杉醇（Taxol）的濃度為橫坐標，繪制細胞的存活率圖（圖2），應用Reed-Muench 公式計算陽性藥的IC50值（表2），表明此研究模型成立。

圖2 順鉑（DDP）和紫杉醇（Taxol）對腫瘤細胞和正常細胞的活力影響Fig.2 Effects of cis-platin and taxol on the viability of cancer cell and normal cell lines

結合植物硒固體飲料組數據可見（圖3），復方富硒固體飲料在100 μg/mL 濃度下，能夠促進人正常肺上皮細胞BEAS-2B 的增殖，增長率為12.56%±1.85%。同時，該復方富硒固體飲料能夠一定程度的抑制肺癌細胞A-549，肝癌細胞SMMC-7721，乳腺癌細胞MCF-7 和結腸癌細胞SW480 的增殖，抑制率分別為4.09%±1.36%，19.48%±3.18%，30.75%±1.45%和18.20%±1.12%，說明該復合富硒固體飲料能一定程度的體外抑制癌細胞增殖且對正常細胞沒有破壞作用。本研究結果表明該類復合固體飲料具有體外的抗腫瘤細胞增殖活性。

圖3 復合富硒植物固體飲料對癌細胞和正常細胞的活力影響Fig.3 Effects of compound selenium-enriched plant solid beverage on the viability of cancer cell and normal cell lines

2.5 復合富硒植物固體飲料抗氧化作用

2.5.1 復合富硒植物固體飲料DPPH 自由基清除活性 由圖4 可知，植物硒固體飲料在50 μg/mL 濃度下DPPH 自由基清除率為32.28%；在50～1000 μg/mL濃度范圍時，DPPH 自由基清除率隨著樣品濃度的升高而升高；在1000～2000 μg/mL 間，DPPH 自由基清除率穩定在90%以上，其IC50為435.6±27.2 μg/mL。該實驗結果表明該富硒復合固體飲料樣品有一定的DPPH 自由基清除能力，并呈現一定的量效關系，說明該富硒復合固體飲料具有抗氧化作用。

圖4 復合富硒植物固體飲料的DPPH 自由基清除能力Fig.4 DPPH radical scavenging ability of the compound selenium-enriched plant solid beverage

2.5.2 復合富硒植物固體飲料對H2O2誘導LO2 細胞形態影響 LO2 細胞用H2O2造模處理30 min，H2O2造模組的熒光強度明顯強于空白對照組，說明LO2 細胞氧化損傷模型造模成功。圖5 為復合富硒固體飲料對H2O2誘導的LO2 細胞形態圖。植物硒固體飲料樣品組的熒光強度均明顯低于造模組，且與空白對照組和NAC 陽性藥組的熒光強度接近，樣品組各濃度之間熒光強度無明顯差異，說明該復合富硒植物固體飲料具有顯著的抗氧化活性。

圖5 復合富硒植物固體飲料對H2O2 誘導的LO2細胞形態的影響Fig.5 Effects of the compound selenium-enriched plant solid beverage on morphology of H2O2-induced LO2 cells

2.5.3 復合富硒植物固體飲料對H2O2誘導LO2 細胞內活性氧的作用 DCFH-DA 在細胞內被水解為2',7'-二氯二氫熒光素（DCFH），DCFH 在細胞內與活性氧反應生成有熒光的2',7'-二氯熒光素（DCF），由此DCFH-DA 熒光強度可反映細胞內活性氧水平。如圖6 所示，植物硒固體飲料實驗組在5、10、15 和20 μg/mL 的濃度下，氧化損傷的LO2 細胞內熒光強度依次減弱，細胞內活性氧水平依次降低。該固體飲料能逆轉H2O2誘導LO2 細胞內活性氧水平升高，具有抗氧化活性。植物硒固體飲料在20 μg/mL 濃度下，其抗氧化活性與陽性藥N-乙酰半胱氨酸（NAC，4 mmol/L）活性相當。實驗結果表明該復合富硒固體飲料具有明顯的抗氧化活性。

圖6 復合富硒植物固體飲料的活性氧熒光強度Fig.6 Active oxygen fluorescence intensity of the compound selenium-enriched plant solid beverage

2.6 復合富硒植物硒固體飲料鎮痛作用的研究結果

小鼠在醋酸誘導疼痛模型下會表現出比較明顯的扭體反應。統計各實驗組數據，復合富硒固體飲料鎮痛作用結果如圖7 所示，在醋酸誘導的小鼠扭體實驗中，與模型組相比較，該復合富硒固體飲料各劑量組（A1：250 mg/kg；A2：50 mg/kg；A3：10 mg/kg）均具有顯著的鎮痛作用（P＜0.01），其鎮痛抑制率分別為92.3%、75.6%和67.5%。其中該復方固體飲料的高劑量組（250 mg/kg）的效果與陽性藥組嗎啡（5 mg/kg）的效果相當。本研究首次報道該類復合固體飲料的鎮痛活性，研究結果表明該植物硒固體飲料具有顯著的鎮痛作用。

圖7 復合富硒植物固體飲料在醋酸扭體模型中的鎮痛作用Fig.7 Analgesic activities of the compound selenium-enriched plant solid beverage in the writhing model

3 結論

本研究以藥食同源富硒西蘭花、葛根、藤茶、黃精、木瓜和西紅柿為原料，開發一款功能性的復合植物硒固體飲料，其總硒含量為540±30.12 μg/kg。該復合植物固體飲料不僅保留了植物原料的香氣，無添加劑，食用安全，而且體積小，攜帶方便，符合現代人群的快節奏生活需求。本研究首次對固體飲料類產品的抗腫瘤活性和鎮痛活性進行研究，結果表明此款復合植物硒固體飲料具有一定的體外抗腫瘤活性，在100 μg/mL 濃度下對四種腫瘤細胞株（A549、SMMC-7721、MCF-7 和SW480）的 抑 制 率 范 圍4.09%～30.75%。該固體飲料在高劑量組（250 mg/kg）具有顯著的鎮痛作用（P＜0.001），其鎮痛抑制率為92.3%，其鎮痛效果與陽性藥嗎啡（5 mg/kg）的效果相當。因此，該復合植物硒固體飲料具有廣闊的應用價值，本研究結果可為復合富硒植物固體飲料進一步開發奠定基礎，為恩施地區藥食同源植物資源的綜合利用提供了理論依據。但本實驗所得數據尚不充分，還需要更多不同的活性評價模型來開展深入研究，且該復合固體飲料的活性機制尚不明確，故對該復合固體飲料的認識還需更充分細致的研究。