蜜生假絲酵母LGL-2 發酵油菜蜂花粉酵素工藝優化及品質評價

廖 湘，鄧俊霞，白衛東，肖更生，賴秋萍，王 宏,*，劉功良,*

（1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東省嶺南特色食品科學與技術重點實驗室，農業農村部嶺南特色食品綠色加工與智能制造重點實驗室，廣東廣州 510225；2.廣東桂嶺蜂業科技股份公司，廣東梅州 514199）

蜂花粉是蜜蜂從蜜粉源植物花蕊內采集的花粉粒與其自身腺體分泌物加工而成的一種混合物，富含豐富的酚類化合物，具有降血脂、促進免疫和抗菌等活性[1-2]。此外，植物來源和地理位置不同的蜂花粉組分不同，有報道表明可通過酚類化合物的組成辨別蜂花粉的植物來源和地理位置[3]。油菜蜂花粉外觀為淡黃色，多呈長球形或圓球形，是中國目前產量占比最高的蜂花粉，同時也是中國開發利用最多的蜂花粉品種[4-5]，具有較好的開發基礎。

近年來，酵素產品越來越受消費者歡迎。食品原料經發酵制備成食用酵素，不僅可以提高食品原料的活性成分，而且還能賦予特殊的發酵香氣[6]。蘇春雷等[7]發現發酵后的余甘子酵素總酚含量比發酵前高；Tohamy 等[8]觀察到發酵埃及蜂花粉制品具有較強的體外抗氧化活性；王印壯等[9]將葡萄果實發酵成酵素后，發現原料風味物質更為豐富；Yan 等[10]研究表明酵母菌在改善蜂花粉營養特性方面具有優勢。目前油菜蜂花粉已被中國衛生部以普通食品管理辦法納入“食品新資源名單”，具有較大的開發潛力[11]，利用源自蜂蜜的酵母LGL-2 將油菜蜂花粉制成酵素有望提升蜂花粉品質和附加值。

目前，蜂花粉產品品類單一，關于油菜蜂花粉發酵制品風味分析的報道較少。因此，為豐富蜂花粉發酵菌種資源，提高蜂花粉產品品類以及質量，本實驗以油菜蜂花粉為原料，采用響應面法探究影響油菜蜂花粉酵素總酚含量的因素，制備品質優良的油菜蜂花粉酵素，并對油菜蜂花粉及其酵素的酚類化合物、揮發性成分與抗氧化活性進行分析比較，以期為蜂花粉產品的發酵工藝優化、風味品質評價以及綜合性開發提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油菜蜂花粉 廣州市譚山蜂業有限公司；蜜生假絲酵母LGL-2（CCTCC M 2016787） 保藏于中國典型培養物保藏中心，采用酵母浸出粉胨葡萄糖培養基（YPD）活化培養；沒食子酸、對香豆酸、鞣花酸、丁香酸、芥子酸、蘆丁和槲皮素（標準品） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所有限公司；無水乙醇、乙腈、甲酸等 均為國產分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

7890A-5975C 氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent 公司；57328-U 萃取纖維頭 美國Agilent 公司；LC-20AT 高效液相色譜儀、M20A 二極管陣列檢測器 日本Shimadzu 公司；FD-1D-50 真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司；722 型紫外-可見分光光度計 上海佑科儀器儀表有限公司；SWCJ-1F 超凈臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZX-50FBS 高壓滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；ZQZY-98CES 振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司；1508X高速冷凍離心機 上海力申科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 油菜蜂花粉酵素發酵工藝 油菜蜂花粉酵素的制作工藝如圖1 所示，主要包括殺菌、接種、發酵等步驟，將發酵制得的油菜蜂花粉酵素經真空冷凍干燥后置于-20 ℃冰箱保存備用。

圖1 油菜蜂花粉酵素發酵工藝流程Fig.1 Fermentation process of rape bee pollen jiaosu

1.2.2 菌種的活化與擴培 蜜生假絲酵母LGL-2 的活化參照張敏倩等[12]的方法。將活化后的蜜生假絲酵母LGL-2 按照體積分數2%接種至液體YPD 培養基中，28 ℃恒溫振蕩培養48 h，備用。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 發酵時間對油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響 在發酵溫度30 ℃、接種量10%、底物含量25%條件下，180 r/min 恒溫培養，收集不同發酵時間（0、6、12、18、24、30、36、42、48、54、60 h）的油菜蜂花粉酵素，待測。

1.2.3.2 發酵溫度對油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響 以10%接種量將蜜生假絲酵母LGL-2 接種在25%底物含量培養液中，分別在24、26、28、30、32、34 和36 ℃和180 r/min 的搖床中培養42 h，收集樣品待測。

1.2.3.3 接種量對油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響

分別以體積分數為5%、10%、15%、20%、25%和30%的接種量，將蜜生假絲酵母LGL-2 接種在底物含量25%的培養液中，在30 ℃，180 r/min 的搖床中培養42 h，收集樣品待測。

1.2.3.4 底物含量對油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響 以10%接種量將蜜生假絲酵母LGL-2 分別接種在5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%和40%底物含量培養液中，于30 ℃和180 r/min 恒溫搖床中培養42 h，收集樣品待測。

1.2.4 Box-Behnken 試驗設計 選取發酵時間、發酵溫度、接種量和底物含量作Box-Behnken 設計，并且以油菜蜂花粉酵素總酚含量作為響應值，試驗設計見表1。

表1 Box-Behnken 試驗因素水平設計Table 1 Factors and levels of Box-Behnken test

1.2.5 酚類化合物的提取 在2 g 樣品凍干粉末中加入100 mL 蒸餾水，超聲波（100%，70 ℃）輔助提取2 h，離心后取上清液作為樣品溶液用于隨后試驗。

1.2.6 總酚含量測定 油菜蜂花粉及其酵素的總酚含量測定參照王小超等[13]與田文禮等[14]的方法，并稍作修改。配制0.1 mg/mL 的樣品溶液，精密吸取1.0 mL 樣品溶液于試管中，分別加入0.5 mL 福林酚，2 mL 超純水，充分搖勻，1 min 后加入7.5%無水碳酸鈉溶液5 mL，充分混勻，在暗處放置50 min，以不添加樣品溶液為空白，在760 nm 波長處測定吸光度，以沒食子酸為標準品，得到標準曲線y=0.0109x+0.0268（R2=0.9986）。總酚含量表示為mg 沒食子酸當量（GAE）/g。根據標準曲線計算油菜蜂花粉及其酵素的總酚質量濃度，并按下式計算總酚含量。

式中：c 為稀釋樣品對應標曲的沒食子酸濃度（mg/L）；V 為樣品體積（L）；m 為樣品質量（g）；t 為稀釋倍數。

1.2.7 游離酚類化合物測定 參考徐元元等[15]的方法，采用高效液相色譜法（HPLC）測定油菜蜂花粉及其酵素的游離酚類化合物。將從油菜蜂花粉及其酵素中提取的酚類化合物過0.22 μm 濾膜后進樣，進樣量為10 μL。色譜柱型號為Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。柱溫為30 ℃，流動相A 為體積分數0.1%甲酸，流動相B 色譜級乙腈，梯度洗脫程序為0.00～5.00 min，5%～10% B；5.01～10.00 min，10% B；10.01～22.00 min，10%～17%B；22.01～50.00 min，17～50% B；50.01～75.00 min，50%～95% B；75.01～78.00 min，5% B，流速為1 mL/min。以標準品的保留時間與紫外-可見光光譜圖確定樣品酚類化合物組成。對香豆酸、槲皮素、蘆丁在320 nm波長處測定峰面積，丁香酸、鞣花酸、沒食子酸和芥子酸在280 nm 波長處測定峰面積，外標法定量。

1.2.8 揮發性香氣成分富集與分析

1.2.8.1 揮發性香氣成分富集 頂空固相微萃取方法參考程婭婭[16]并略作修改。吸取8 mL 油菜蜂花粉溶液與油菜蜂花粉酵素，分別置于20 mL 樣品瓶中并加入2.5 g 氯化鈉和磁力轉子，45 ℃平衡25 min后插入活化完全的纖維萃取頭45 ℃吸附40 min，于250 ℃解吸5 min。

1.2.8.2 GC-MS 條件 色譜條件：采用HP-INNO WAX毛細管色譜柱（60 m×250 μm×0.25 μm）；載氣（He）流速0.8 mL/min，進樣量0.5 μL，不分流進樣；進樣口溫度：250 ℃；升溫程序：起始35 ℃，保持3 min，以5 ℃/min 升溫至200 ℃，保持3 min，再以10 ℃/min的速率升溫至230 ℃，保持10 min，總運行時間約為52 min；質譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；離子源溫度為250 ℃，質譜接口溫度270 ℃；質量掃描范圍：m/z 20～450。

1.2.8.3 揮發性成分的定性與定量分析 檢測結果在圖譜庫NIST 11 上檢索解析，結合特征離子峰、基峰等信息在譜庫中篩選出相似度≥80（最大值為100）的化合物，采用峰面積歸一化法計算得到各揮發性香氣成分的相對百分含量。

1.2.9 相對氣味活度值（ROAV）計算 相對氣味活度值可以用于評定各類揮發性香氣成分對產品風味貢獻程度，貢獻程度最大的揮發性香氣成分ROAV值為100。ROAV≥1 表明該揮發性香氣成分為樣品中的關鍵揮發性風味物質，ROAV 值越大表示該成分對樣品整體風味影響越大[17]。

式中：Cmax與Tmax分別表示對貢獻程度最大揮發性香氣成分的相對含量（%）及感覺閾值（mg/kg）；C1與T1表示各待測成分的相對含量（%）和感覺閾值（mg/kg）。

1.2.10 抗氧化活性測定

1.2.10.1 DPPH 法測定抗氧化活性 吸取各梯度Trolox 標準液及樣品溶液100 μL 與100 μL DPPH反應液混合后，于室溫避光反應30 min，517 nm 處測定吸光度，Trolox 標準曲線為y=0.0016x+0.0112（R2=0.9905）。抗氧化活性以水溶性維生素E 類似物（Trolox）當量抗氧化能力表示，單位為μmol TE/g。

1.2.10.2 ABTS 法測定抗氧化活性 吸取各梯度Trolox 標準液與樣品溶液20 μL 于96 孔板中，加入180 μL ABTS 工作液，充分混勻后于37 ℃避光靜置6 min，734 nm 處測定吸光度，Trolox 標準曲線方程為：y=0.0012x+0.0518（R2=0.9888）。抗氧化活性以Trolox 當量抗氧化能力表示，單位為μmol TE/g。

1.2.10.3 FRAP 法測定抗氧化活性 吸取各梯度Trolox 標準液與樣品溶液20 μL 于96 孔板中，再加入180 μL FRAP 工作液，搖勻后避光放置于37 ℃反應15 min，593 nm 波長測定吸光度，Trolox 標準曲線方程為：y=0.0016x+0.2104（R2=0.9867）。抗氧化活性以Trolox 當量抗氧化能力表示，單位為μmol TE/g。

1.3 數據處理

試驗數據采用SPSS Statistics 22.0 和Design-Expert 8.0.6 軟件進行統計分析。所有實驗進行3 次平行，測定結果以平均值±標準差表示，組間差異采用單因素方差分析進行Duncan’s 差異分析，以P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 油菜蜂花粉酵素發酵工藝條件的單因素實驗結果

2.1.1 發酵時間對油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響

如圖2 所示，在發酵時間從0 h 增加到60 h 的過程中，油菜蜂花粉總酚含量隨發酵時間的增加而明顯提高，發酵時間達到42 h 時，總酚含量達到最大值，此時油菜蜂花粉總酚含量為8.63±0.02 mg GAE/g，在發酵過程中產生的乙醇可以提高部分酚類化合物的溶解性，進而提高測定總酚含量[18]；當發酵時間大于42 h 時，油菜蜂花粉總酚含量不再隨發酵時間的增加呈上升趨勢，蜜生假絲酵母LGL-2 在發酵50 h左右時進入發酵平穩期，此時酚類化合物水解、氧化與溶解、合成等反應達到相對平衡位點，故選取42 h作為最佳發酵時間。Kaprasob 等[19]研究發酵腰果梨發酵過程中活性成分變化時發現，發酵中后期的總酚含量變化相對平穩，與本實驗結果基本相符。

圖2 發酵時間對油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the total phenolic content of rape bee pollen jiaosu

2.1.2 發酵溫度對油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響

如圖3 所示，當發酵溫度范圍在24～30 ℃時，油菜蜂花粉酵素總酚含量隨著溫度的上升而逐漸提高，發酵溫度為30 ℃時總酚含量達到最大值8.83±0.15 mg GAE/g；當發酵溫度超過30 ℃后，總酚含量隨溫度升高而下降，因此選取30 ℃作為最佳發酵溫度。微生物發酵過程中產生的酶不僅可以水解蜂花粉的細胞壁，使其營養成分與活性成分更好地釋放[11]，也可能會抑制酵母細胞內與酚類化合物合成相關酶的活性，導致油菜蜂花粉酵素總酚含量降低，過高與過低的溫度均會抑制酶的活性。張敏倩等[12]在利用蜜生假絲酵母LGL-2 制備海藻糖時，發現蜜生假絲酵母LGL-2 的最佳發酵為28 ℃左右，與本研究結果有差異。

圖3 發酵溫度對油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on the total phenolic content of rape bee pollen jiaosu

2.1.3 接種量對油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響如圖4 所示，當LGL-2 接種量從5%提升到20%時，油菜蜂花粉酵素總酚含量隨著接種量的提高而提高，接種量為20%時總酚含量達到最大值10.94±0.20 mg GAE/g；當接種量大于20%，總酚含量隨著接種量的提高反而明顯下降，因此選取20%接種量作為LGL-2 的最佳接種量。當接種量過高時，發酵底物不足為酵母提供充足的營養，從而抑制酵母發酵。張笑瑩等[20]優化雪花梨酵素制備工藝時，同樣發現酵母菌接種量與酵素總酚含量呈現先上升后下降的峰形趨勢。

圖4 接種量對油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響Fig.4 Effect of inoculum amount on the total phenolic content of rape bee pollen jiaosu

2.1.4 底物含量對油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響

如圖5 所示，當底物含量由5%升高至30%時，油菜蜂花粉酵素總酚含量隨底物含量的升高而提高，發酵液的底物含量為30%時總酚含量達到最大值10.26±0.23 mg GAE/g；總酚含量在底物含量達到30%后隨著底物含量的提高反而呈下降趨勢，因此選取30%底物含量作為發酵最佳底物含量。底物含量過高會引起外界滲透壓增大，酵母的生長將會受到抑制，進而影響酚類化合物的釋放。張敏倩等[12]的研究中也發現底物添加量過高會反抑制蜜生假絲酵母LGL-2 的代謝的現象。

圖5 底物含量對油菜蜂花粉酵素總酚含量的影響Fig.5 Effect of substrate content on the total phenolic content of rape bee pollen jiaosu

2.2 油菜蜂花粉酵素發酵工藝條件的響應面優化試驗結果

根據Box-Behnken 的中心組合試驗設計原理，結合單因素試驗結果，采用響應面法對油菜蜂花粉酵素發酵工藝進行優化，以發酵時間（A）、發酵溫度（B）、接種量（C）和底物含量（D）為自變量，油菜蜂花粉酵素總酚含量（Y）為響應值，得出油菜蜂花粉酵素總酚含量的四因素三水平的結果如表2 所示。利用Design Expert 軟件對上述結果進行分析，得到油菜蜂花粉酵素總酚含量（Y）對發酵時間（A）、發酵溫度（B）、接種量（C）和底物含量（D）的二次多項回歸方程為：

表2 Box-Behnken 試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken design with experimental results

Y=-548.523+0.93A+29.61B+1.99C+5.02D-7.71E-3AB-3.83E-3AC-1.50E-3AD+2.50E-3BC-0.06BD+3.70E-3CD-5.69E-3A2-0.46B2-0.05C2-0.05D2

由表3 可知，模型P＜0.0001，說明該模型極其顯著；失擬項不顯著（P＞0.05），說明該模型擬合得較好；R2=0.9132，可知該模型對綜合評分的預測值與實際值的擬合程度較高；RAdj2=0.8263，說明該模型能解釋82.63%響應值的變化，具有較好預測能力。方差分析中的顯著性分析可以評價自變量對因變量的影響程度。在所有作用因素中，對總酚含量影響顯著（P＜0.05）的因素有：B 和BD；影響極顯著（P＜0.01）的因素有：A、D、B2、C2和D2。各單因素對總酚的影響順序依次為A＞D＞B＞C。

表3 回歸方差分析結果Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

根據回歸方程擬合的響應面圖能直觀反映各實驗因素的交互作用，若響應曲面的坡度越陡峭，表明交互作用越強[21]。如圖6 所示，相較于圖6A～圖6D及圖6F，圖6E 的等高線更為密集且曲面坡度陡峭，說明發酵溫度與底物含量的交互作用對響應值的影響更強，這與方差分析的結果相符合。

圖6 兩因素交互作用對總酚含量的響應面圖Fig.6 Response surface plot of the interaction between two factors on total phenol content

2.3 驗證性實驗結果

通過Design-expert 軟件分析得到油菜蜂花粉酵素發酵最優工藝條件為：發酵時間47.91 h，發酵溫度29.92 ℃，接種量20.31%，底物含量30.48%。考慮到實際性操作，將最優工藝條件調整為發酵時間48 h，發酵溫度30 ℃，接種量20%，料液比30%，以修正后的工藝條件進行3 次平行驗證試驗，結果取平均值，得到蜂花粉酵素的總酚含量為11.48±0.27 mg GAE/g，接近模型預測值11.66 mg GAE/g，兩者相對誤差為1.58%，試驗結果吻合度較高，證明該響應面方程的準確性和實用性。

2.4 油菜蜂花粉及其酵素的酚類化合物組成

多酚是蜂花粉中主要的活性物質之一[22]。HPLC檢測結果如表4 所示，在油菜蜂花粉及其酵素中共檢出5 種酚類化合物，其中包括酚酸（沒食子酸、對香豆酸和鞣花酸）與黃酮類化合物（蘆丁、槲皮素）。可以明顯地看到，油菜蜂花粉酵素中的酚類化合物含量均高于發酵前樣品。在酚酸類化合物中，沒食子酸從0.52 mg/g 提高至1.90 mg/g，提升幅度最大；黃酮類化合物中提升最明顯的是槲皮素，從0.11 mg/g 提高至0.21 mg/g。油菜蜂花粉及其酵素中蘆丁含量分別是1.79 與2.41 mg/g，由此可見蘆丁是油菜蜂花粉及其酵素中含量最高的酚類化合物之一，即油菜蜂花粉酵素的主要酚類化合物是蘆丁。此外，丁香酸和芥子酸均未檢出。

表4 油菜蜂花粉及其酵素的酚類化合物組成Table 4 Phenolic compounds of rape bee pollen and rape bee pollen jiaosu

Zhang 等[23]檢測油菜蜂花粉的酚類化合物組分時，發現油菜蜂花粉中含有異鼠李素、山奈酚、蘆丁、槲皮素等酚類化合物，其中蘆丁的含量最高，與本實驗結果相符。肖興英等[24]通過對中國不同產地油菜蜂花粉檢測發現，不同產地的同一植物來源蜂花粉所含酚類化合物存在差異。有研究報道，在微生物產生的酶解作用下，可以將原料中部分不溶性結合酚釋放[25]，與本研究中酚類化合物含量經發酵后提高的現象一致。此外，油菜蜂花粉酵素中仍可能存在其他未被檢出的酚類化合物。

2.5 油菜蜂花粉及其酵素的揮發性香氣成分

利用氣相色譜法-質譜法聯用技術（GC-MS）測定油菜蜂花粉及其酵素的揮發性香氣成分，共鑒定出26 種揮發性化合物，包括醛類（8 種）、醇類（6 種）、酯類（5 種）、酮類（4 種）、酸類（2 種）、萜烯類（1 種）（見表5）。發酵后酯類物質與醇類物質明顯增多，新增2 種酯類物質與4 種醇類物質，而醛類物質、酮類物質和酸類物質在發酵后種類均有所減少，其中醛類物質從8 種減少至1 種，酮類物質從3 種減少至2 種，酸類物質在發酵后未檢出。Yan 等[26]提出大部分產香型酵母在發酵過程中能夠合成酯類物質以改良產品風味。吳昊遠[27]采用乳酸菌將油松松花粉發酵制備成風味乳飲料，同樣檢出正戊醇、苯甲醛和正己酸等成分。Bleve 等[28]在發酵橄欖時觀察到除苯甲醛外，所有檢測到的醛類物質濃度均在發酵過程中下降。這些研究結果與油菜蜂花粉酵素中揮發性成分的變化一致。

表5 油菜蜂花粉及其酵素的揮發性香氣成分相對含量Table 5 Volatile aroma components and their relative contents of rape bee pollen and rape bee pollen jiaosu

各揮發性香氣成分被感知到的最低濃度稱為“氣味閾值”，揮發性香氣成分的含量與其閾值之比的大小反映該物質對整體香氣的貢獻程度[17]，表6顯示了發酵對油菜蜂花粉揮發性香氣成分ROAV 的影響，共有7 種物質被鑒定為油菜蜂花粉酵素的關鍵性揮發性香氣成分（ROAV≥1）。整體上，發酵前后的油菜蜂花粉中關鍵性揮發性香氣成分有較大差異，其中異戊醇對油菜蜂花粉酵素的貢獻度最大。據報道，異戊醇具有香甜氣味，在酵母發酵的葡萄糖代謝途徑中可以得到[29]。發酵前，油菜蜂花粉中醛類化合物的總ROAV 值最高，其中ROAV 值最高的醛類化合物為正己醛（64.96），其次是正辛醛（64.84），這些物質帶有青草味[30]。此外，反式-2,4-庚二烯醛和正己酸分別帶有令人不愉快魚腥味和汗臭味[31-32]。經發酵后，反式-2,4-庚二烯醛和正己酸的ROAV 值降低，而苯乙醇、辛酸乙酯、庚酸乙酯和癸酸乙酯的ROAV值明顯提高，表明發酵可有效降低令人不愉快的風味并增強油菜蜂花粉的水果香和玫瑰香氣味[33-34]。此外，蔡秋萍[35]通過HS-SPME 提取與GC-MS 分析在油菜蜂花粉中共鑒定出40 種特征揮發性香氣成分，同時結合在線嗅聞鑒定分析發現油菜蜂花粉具有甜奶脂味、花果香以及不良的膏脂油蛤味與腥味，與本實驗結論基本一致。

表6 油菜蜂花粉及其酵素的揮發性香氣成分ROAV 值Table 6 ROAV of volatile aroma compounds in rape bee pollen and rape bee pollen jiaosu

2.6 油菜蜂花粉及其酵素的抗氧化活性

通過蜜生假絲酵母LGL-2 發酵制得的油菜蜂花粉酵素采用DPPH、ABTS 和FRAP 方法分析。如表7 所示，其抗氧化活性當量分別為42.38±1.84、113.82±0.54 和89.90±0.91 μmol TE/g，相比于發酵前分別提高67.51%、13.90%和145.71%，且具有顯著性（P＜0.05）。Aylanc 等[36]對天然發酵的蜂花粉與未發酵的蜂花粉分別進行體外模擬消化，發現經天然發酵的蜂花粉在各個消化階段均具有更高的抗氧化活性，本實驗中經人工發酵制得的油菜蜂花粉酵素同樣可觀察到抗氧化活性增強的現象。研究表明，抗氧化活性與酚類物質含量呈正相關[37]，推測油菜蜂花粉酵素抗氧化活性的提高可能與酚類化合物含量提高有關。

表7 油菜蜂花粉及其酵素的抗氧化活性Table 7 Antioxidant activity of rape bee pollen and rape bee pollen jiaosu

3 結論

本文對制備油菜蜂花粉酵素的工藝及品質進行研究，在采用單因素實驗考察發酵時間、發酵溫度、接種量和底物含量對油菜蜂花粉酵素總酚含量影響的基礎上，對發酵工藝條件進行響應面優化試驗，得到最優工藝條件：發酵時間48 h、發酵溫度30 ℃、接種量20%、底物含量30%，此時總酚含量可達11.48 mg GAE/g。在此條件下發酵制備的油菜蜂花粉酵素中酚類化合物含量、揮發性酯類物質種類、醇類物質種類以及體外抗氧化活性均有所提高。此外，ROAV 值分析結果表明油菜蜂花粉經發酵后具有不良氣味的成分ROAV 值下降，同時產生風味良好的物質。綜上所述，本研究拓寬了蜜生假絲酵母LGL-2的應用場景，探究了油菜蜂花粉及其酵素的主要酚類化合物組成、揮發性風味成分以及抗氧化活性變化，為油菜蜂花粉酵素的研究及高附加值產品的開發利用提供理論依據，經蜜生假絲酵母LGL-2 發酵制得的油菜蜂花粉酵素營養價值更高、風味更佳，具有良好的開發、生產前景。目前，本文僅對油菜蜂花粉及其酵素的揮發性成分與體外抗氧化活性進行探究，為進一步闡明油菜蜂花粉酵素的風味成分及生物活性，未來可繼續探究油菜蜂花粉發酵過程產生的非揮發性風味成分組成，并開展動物實驗深入研究其體內活性。