基質細胞評分的胃癌臨床意義及胃復春膠囊干預機制

陳春 祁大慶 潘靖文

摘要：采用生物信息學方法分析基質細胞與胃癌的臨床特征關聯，預測胃復春膠囊的干預機制。從TCGA數據庫下載胃癌活檢數據，基于ESTIMATE計算基質細胞評分（stromal score，STRS）并以中位數為分組依據，分析STRS與患者臨床信息關聯并篩選DEGs（differentially expressed genes）作為潛在干預靶點。基于胃復春膠囊入血成分預測藥物靶點，DEGs與藥物靶點取交集并通過PPI網絡及MCODE篩選核心子網絡及基因，分析生存預后及不同分期表達。構建藥味-入血成分-靶點網絡篩選核心成分并進行ADMET預測及分子對接驗證。交集靶點進行GO（gene ontology）、KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集。結果表明：STRS與生存時間顯著相關且隨Stage及T分期顯著升高，分析得DEGs 1 975個；胃復春膠囊入血成分75個，對應靶點663個，交集靶點107個；核心子網絡4個，其中VCAM1、SERPINE1、TLR4、FGF1為核心靶點，SERPINE1、PDGFRB表達與生存時間相關極顯著（P<0.01），VCAM1、NOX4、PDGFRB、ITGAL等在不同Stage分期表達差異極顯著（P<0.01）；異金雀花素B、香茶菜素O、藍萼甲素等為核心成分，ADMET特性及核心靶點蛋白結合活性良好；GO富集于鈣離子濃度調節、鈣離子穩態等條目，KEGG富集于鈣信號通路、神經活性配體-受體相互作用等通路。基質細胞與生存時間、分期密切相關，胃復春膠囊可能通過調控基質細胞發揮抑制腫瘤生長、轉移及延緩耐藥性等作用。

關鍵詞：基質細胞評分；胃癌；臨床特征；胃復春膠囊；網絡藥理學

中圖分類號：R285?? 文獻標志碼：A?? 文章編號：1002-4026（2023）06-0038-10

Clinical significance of stromal cell score in gastric cancer

and intervention with Weifuchun capsules

CHEN Chun1， QI Daqing2， PAN Jingwen1*

（1. Department of Pharmacy， The Eighth People′s Hospital of Qingdao， Qingdao 266000， China;

2. Hangzhou Huqingyutang Pharmaceutical Co.， Ltd.， Hangzhou 311100， China）

Abstract∶Bioinformatics methods were used to analyse the association between stromal cells and clinical characteristics of gastric cancer， and to predict the intervention mechanism of Weifuchun capsule. Gastric cancer biopsy data were downloaded from TCGA database， the stromal score （STRS） was calculated based on ESTIMATE， and the median was used as the basis for grouping， and the association between STRS and patients′ clinical information was analysed， and the DEGs were screened as the potential intervention targets. Based on the blood components of Weifuchun capsule， we predicted the drug targets， intersected DEGs with drug targets， and screened the core sub-networks and genes through PPI network and MCODE， and analysed the expression of differentially expressed genes in terms of survival prognosis and different stages of the disease. The drug-taste-intake component-target network was constructed to screen the core components， and ADMET prediction and molecular docking validation were performed. The intersecting targets were enriched by GO and KEGG. The results showed that STRS was significantly correlated with survival time and increased significantly with Stage and T stage， and 1 975 DEGs were analysed; 75 components of Weifuchun capsule into the blood， corresponding to 663 targets， and 107 intersecting targets; and 4 core sub-networks， of which VCAM1， SERPINE1， TLR4， FGF1 were the core target， and SERPINE1， PDGFRB expression correlated with survival time was highly significant （P<0.01）， and the differences in the expression of VCAM1， NOX4， PDGFRB， ITGAL， etc. in different Stage phases were highly significant （P<0.01）; isocryptoxanthin B， geranylgeranyl O， and bluocalyx methylin were the core components， with good ADMET properties and core target protein binding activity. GO was enriched in calcium ion concentration regulation， calcium ion homeostasis and other entries. KEGG is enriched in calcium signalling pathway， neuroactive ligand-receptor interaction and other pathways. Stromal cells are closely related to survival time and stage， and Weifuchun capsule may inhibit tumour growth， metastasis and delay drug resistance by regulating stromal cells.

Key words∶stromal cell score; gastric cancer; clinical features; Weifuchun capsules; network pharmacology

胃癌為國內第二大好發癌癥及致死性癌癥［1］，是全球癌癥致死的主因之一。早期癥狀不明顯、保守手術切除后易復發等原因導致胃癌5年生存率較低，因此尋找預測、診斷、治療胃癌的標志物，干預靶點及抑制惡化的藥物有重要意義。胃惡性實體瘤組織由腫瘤細胞、正常上皮細胞、基質細胞、免疫細胞等細胞以及細胞因子和胞外基質蛋白共同組成，浸潤性基質細胞和免疫細胞作為腫瘤組織中正常細胞的主要部分，在干擾腫瘤信號方面有重要作用。研究顯示基質細胞與腫瘤生長抑制劑逃避、維持增殖信號、細胞死亡耐受、細胞能量代謝重編程、血管生成啟動、免疫監管逃避、侵襲和轉移等特征相關［2］。 ESTIMATE（estimation of stromal and immune cells in malignant tumor tissues using expression data）［3］利用癌癥樣本轉錄譜的獨特性質來推斷腫瘤細胞的內容以及不同的浸潤正常細胞。通過單樣本基因集富集分析（ssGSEA），計算基質和免疫評分來預測基質細胞和免疫細胞的水平，推斷腫瘤組織中的腫瘤純度，分析與腫瘤組織中基質和免疫細胞浸潤相關的特異性基因特征。研究顯示，基質細胞與患者生存惡化和治療耐藥性相關，并通過激活基質重塑、代謝效應和可溶性分泌因子促進腫瘤侵襲［4］。腫瘤相關成纖維細胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）占基質細胞50%以上，通過分泌各種細胞因子來調節腫瘤生長和炎癥反應，促進腫瘤生長。因此，在未分化胃癌活檢中通常表現出過度纖維化和大量CAFs浸潤［5］。基質細胞作為構成腫瘤微環境的重要成分［6］，探究其相關特征基因并尋找干預方法對腫瘤微環境調節具有現實意義。

天然藥物具有多成分、多靶點的作用特點，在腫瘤微環境的調節方面有巨大潛力。胃復春膠囊主要成分包括紅參細粉及香茶菜、枳殼提取物等，具有健脾益氣、活血解毒的功效，臨床上用于胃癌前期病變及胃癌術后的輔助治療［7］。胃復春膠囊療效確切，但對其作用機制及其對應物質基礎的研究尚不多見。目前基于腫瘤基質細胞組成探究復方作用機制的研究鮮有報道，因此，本文采用生物信息學技術探究腫瘤基質細胞與胃癌臨床特征的關聯及胃復春膠囊的干預作用機制。

1 材料與方法

1.1 數據庫及分析軟件

TCGA數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）、中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）；SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）；STRING數據庫（https：//string-db.org）、R 3.6.3、ClusterProfiler 3.14.3、ggplot 2.3.3.0、DOSE 3.12.0、Enrichplot 1.6.1、Cytoscape 3.7.2、Discovery studio 2019等。

1.2 表達及臨床數據下載及分析

從TCGA數據庫中下載胃癌RNA FPKM（fragments per kilobase per million）表達數據及患者的臨床信息。數據包含407例胃癌活檢數據，其中32例患者樣本包含正常胃組織和癌組織，剔除正常組織剩余343例樣本備用。采用ESTIMATE計算基質細胞得分并以中位數為標準將患者分為高基質細胞組和低基質細胞組。分析基質細胞得分與生存時間、年齡、Stage分期、T（原發性腫瘤）、N（區域淋巴結轉移）、M（遠處轉移）關系。2組數據采用wilcox.test函數進行秩和檢驗，分組大于2組的數據則采用kruskal.test函數進行檢驗。采用Limma包對高、低基質細胞組進行差異表達分析，并以Log FC值>1、FDR值<0.05（FC為fold change，FDR為false discovery rate）為標準篩選差異表達基因（differentially expressed genes， DEGs）作為潛在干預靶點。

1.3 胃復春膠囊入血成分及靶點信息

檢索文獻整理得胃復春膠囊入血成分，于TCMSP、SwissTargetPrediction檢索及預測靶點，基于UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）標準化靶點名稱，得到胃復春膠囊作用靶點。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用及拓撲網絡分析

將藥物作用靶點與潛在干預靶點交集得干預靶點，導入STRING數據庫，設置物種為“Homo sapiens”進行檢索，設定置信度為“high confidence >0.7”，刪除游離節點，得蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，保存為TSV格式文件并導入Cytoscape 3.7.2繪圖，并采用MCODE（molecular complex detection）插件分析核心子網絡（degree cutoff=2，node cutoff =0.2，kcore=2，max.depth=100），分析子網絡基因生存預后及不同Stage中表達。構建藥材-入血成分-靶點關聯網絡圖，根據節點獲得每個靶點與其他靶點互相作用，以degree中位數為標準篩選核心入血成分并分析ADMET（藥物的吸收、分布、代謝、排泄、毒性）特性。

1.5 生物富集分析

將篩選的潛在作用靶點采用ClusterProfiler包進行基因本體（gene ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of gene and genomics，KEGG）富集分析，采用enrichplot、ggplot2包對富集結果進行可視化，從細胞組分、分子功能、生物過程、通路分析胃復春膠囊干預胃癌基質細胞的作用機制。

1.6 分子對接驗證

從PDB（https：//www.rcsb.org/）數據庫下載關鍵靶點蛋白及晶體構象，通過前處理與核心化合物進行分子對接驗證。受體前處理為去原配體、去除溶劑、補充氨基酸殘基等。配體前處理為加氫及合適的電荷等。選擇晶體結構中配體所在的位置作為結合位點（無原配體的晶體則采用預測位點），選擇距離該位點一定半徑內的球集為活性結合位點。采用LibDockScore評價小分子化合物與蛋白靶點的結合活力。

2 結果

2.1 TCGA數據分析

利用ESTIMATE算法評分，以中位數（n=132.699 3）將其分為低、高基質細胞組，關聯臨床數據分析結果如圖1、OSID科學數據與內容附圖1 所示。圖1顯示基質細胞評分與胃癌患者生存時間顯著相關，表明基質細胞為潛在的有效干預機制。不同性別，年齡，N、M分期與基質細胞評分無顯著差異。不同Stage分期及T分期基質細胞評分存在顯著差異（P=7.80×10-4，P=8.44×10-7），基質細胞評分在Stage Ⅰ到Ⅱ階段及T Ⅰ到Ⅱ階段中迅速增加，在后續階段中增長不明顯（OSID科學數據與內容附圖2），表明早期干預腫瘤微環境中的基質細胞增長有一定價值。采用Limma包進行差異分析得1 975個 DEGs作為潛在干預靶點，熱圖及火山圖詳見OSID科學數據與內容附圖3（a）～3（b）所示。

2.2 常用復方入血成分

胃復春膠囊臨床上用于胃癌前病變及胃癌輔助治療，療效確切。基于已公開文獻整理得胃復春膠囊入血成分75個［8］，其中香茶菜入血成分38個，分析結構以二萜類化合物為主，其次為歸屬于紅參及枳殼的黃酮和皂苷，基于TCMSP、SwissTargetPrediction數據庫檢索、去重、標準化得胃復春膠囊入血成分作用靶點663個。主要入血成分見表1，全表見OSID科學數據與內容附表1。

2.3 PPI網絡構建及核心靶點預測

將藥物作用靶點與潛在干預靶點取交集，得到107個潛在藥物作用靶點（OSID科學數據與內容附圖4）導入STRING數據庫中分析，共獲得107個節點，141條邊，平均節點度為 2.64，PPI富集P<1×10-16，結果導出至Cytoscape中可視化，并采用MCODE插件分析核心子網絡及靶點，結果見OSID科學數據與內容附圖5。分析得核心子網絡4個，其中血管細胞黏附因子1（VCAM1）、人纖溶酶原激活物抑制劑1（SERPINE1）、toll樣受體4（TLR4），成纖維生長因子（FGF1）為核心子網絡的seed靶點，18個靶點為聚集靶點，分別對這18個靶點進行生存分析及不同階段的表達量分析，結果見OSID科學數據與內容附圖6～7。SERPINE1、PDGFRB表達與患者生存時間相關極顯著（P<0.01），TGFB1、FGF1、MPO表達與胃癌患者生存時間顯著相關（P<0.05），VCAM1、NOX4、PDGFRB、ITGAL、TGFB1、ITGA4、CCR5在Stage分期差異表達極顯著（P<0.01），CCR2、PDGFRA、ITGB2、MMP2、SELL差異表達顯著（P<0.05）。

2.4 核心入血成分分析

采用Cytoscape 3.7.2軟件構建藥材-入血成分-靶點調控網絡（OSID科學數據與內容附圖8），節點為靶點或化合物，連線表示成分與靶點之間互作關系。由附圖8可知胃復春膠囊通過多成分、多靶點干預胃腫瘤基質細胞組成。異金雀花素B、香茶菜素O、香茶菜素U、藍萼甲素、橙桑黃酮F、去甲基川陳皮素、熊果酸、橙皮素、Sudachinoid A、異橙黃酮、槲皮素等為潛在核心入血成分（degree值大于4倍中位數），ADMET預測分析結果如表2所示，核心成分水溶性均介于良好和低，表現出良好的腸道吸收性以及良好的血漿蛋白結合率。

2.5 生物功能注釋分析

采用“ClusterProfiler”軟件包對交集靶點進行生物功能注釋。分別選取GO富集結果BP/CC/MF前10 GO term繪圖（OSID科學數據與內容附圖9（a）），交集靶點富集于胞漿鈣離子濃度調節、鈣離子穩態、細胞鈣離子穩態、胞漿鈣離子濃度的正調控、細胞二價陽離子穩態、磷脂酶活性的調節等生物過程，以及質膜膜筏、神經元細胞體、膜小凹、軸突末梢等細胞組成以及前列腺素受體活性、G蛋白偶聯肽受體活性、肽受體活性、類二十烷酸受體活性、跨膜受體蛋白激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性、細胞因子結合等分子功能。

KEGG前20富集結果繪圖（OSID科學數據與內容附圖9（b）），交集靶點通過作用于鈣信號通路、神經活性配體-受體相互作用、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路、人類表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑耐藥、Ras信號通路、Rap1信號通路、磷脂酶 D 信號通路等通路發揮平滑肌收縮調節、晚期糖基化終末產物代謝調節、炎癥信號傳導調節、細胞存活生長、免疫細胞轉移和聚集、機體低氧濃度或缺氧應答等作用。

2.6 分子對接驗證

將潛在核心入血起效成分作為分子對接配體，將子網絡核心靶點蛋白作為分子對接受體，采用Libdock對其進行分子對接，對接得分值如表3所示，圖2為各核心靶點與入血成分對接結果2D呈現（Libdock Score>70為對接活性良好）。

3 討論與結論

腫瘤細胞行為受腫瘤微環境中基質細胞相互作用影響［9］，腫瘤基質中CAF、MSCs等細胞分泌HGF、FGF、ISF-1、IGF-2等因子可促進血管的形成及腫瘤細胞的浸潤；周圍基質細胞分泌TGF-β誘導內皮細胞向瘤性間質細胞轉化從而利于腫瘤細胞浸潤；基質細胞可調節組織間隙液壓影響藥物跨越毛細管以及能直接降低腫瘤細胞對化學藥物、酪氨酸激酶抑制劑的敏感性，從而降低了藥物療效。基質細胞隨著癌癥周期進展含量顯著升高，尤以Ⅰ/Ⅱ期變化明顯，生存分析顯示基質細胞含量低組患者生存時間顯著延長，表明基質細胞增長可加快胃癌進展，縮短患者生存時間，因而早期針對基質細胞進行干預有重大意義。此外，低、高基質細胞含量組存在大量基因表達顯著失調，而化療藥物由于成分單一、對應靶點少難以覆蓋，故中藥復方的多成分、多靶點干預策略合理。

潛在藥物作用靶點的PPI網絡分析得到以VCAM1、SERPINE1、TLR4、FGF1為核心的4個子網絡，核心靶點及子網絡靶點表達與患者生存時間顯著相關。VCAM1為免疫球蛋白超家族成員之一，廣泛存在于活化內皮細胞、平緩肌細胞、骨髓基質細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞集成纖維細胞等表面，入血成分干預其表達進而調節炎癥反應、細胞和組織的分化及腫瘤的擴散、轉移等生物過程［10］。SERPINE1為絲氨酸蛋白酶抑制劑（SERPIN）家族的重要成員，是尿激酶和組織蛋白酶原激活劑（uPA和tPA）的主要抑制劑，在細胞外基質重塑中起關鍵作用，研究顯示其可促進血管生成、抗凋亡、誘導腫瘤血管化、激活炎癥反應等，與腫瘤進展及轉移緊密相關［11-12］。TLR4為toll樣受體家族重要成員，通過識別病原相關分子模式而激活相應的信號傳導通路，進一步促進NF-κB的激活，TLR4在多種惡性腫瘤組織中呈高表達狀態，可促進惡性腫瘤的增殖、抑制腫瘤細胞凋亡及誘導免疫逃逸等［13］。FGF1為成纖維細胞生長因子家族的成員，通過與種內皮細胞表面受體相互作用促進血管生成，而且能夠促進多種類型細胞的有絲分裂增殖，促進血管生成以及腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移等，研究顯示多種惡性癌癥中FGF1均存在異常高表達［14-15］。結合生存時間及不同分期表達量統計分析，核心靶點及其子網絡靶點表達與臨床預后密切相關，可能為胃復春膠囊發揮調節基質細胞、抑制癌癥進展的作用靶點。

胃癌在中醫學并無具體對應名稱，根據患者癥狀可將其歸入“積聚”“胃脘痛”“噎膈”等范疇［16］，醫家以為“正氣虧損、邪毒侵襲”與之相關，屬于本虛標實之證，基本病機是正虛、血瘀、痰阻、癌毒蘊結于胃，導致胃失和降，病因為情志因素、飲食因素、濕熱蟲毒感染等［17-18］。胃復春膠囊方中紅參可補元氣、益氣攝血、復脈固脫，香茶菜可清熱利濕、活血散淤、解毒消腫，枳殼可健脾開胃、理氣寬中、行滯消脹，共奏健脾益氣、活血解毒之功，減輕幽門螺桿菌及致癌物質對胃黏膜的損害，抑制癌細胞增生，促進癌細胞凋亡等［19-20］。

藥味-靶點-入血成分網絡分析得異金雀花素、香茶菜素O、香茶菜素U、藍萼甲素、橙桑黃酮F、去甲基川陳皮素等為核心起效物質。歸屬于香茶菜中的活性成分如異金雀花素、香茶菜素O、香茶菜素U、藍萼甲素等有抗菌消炎、促進組織修復、抑制血小板聚集、血管內皮細胞保護作用，能夠減輕微血管內皮功能障礙及損傷，促進受損的胃組織黏膜修復與再生，抑制腫瘤細胞增生及轉移等［21-22］。歸屬于枳殼、紅參的成分如橙皮素、Sudachinoid A、異橙黃酮、去甲基川陳皮素等可促進胃腸道運動、抑制胃癌細胞增殖，具有抗炎、抑菌等作用［23-24］。采用藥代動力學特性分析顯示核心入血成分生物藥劑學效應良好，分子對接顯示核心入血成分與核心靶點蛋白結合活性良好，篩選所得入血成分可能為發揮基質細胞調節的物質基礎來源。

KEGG通路分析顯示潛在藥物作用靶點與多條通路相關。鈣離子信號是細胞遷移和侵襲的重要調節因子，與幽門螺桿菌誘導的胃癌細胞遷移和侵襲有關，作用于該通路可抑制幽門螺桿菌通過Wnt/β-catenin/TRPC6/Ca2+信號通路誘導的胃癌細胞遷移和侵襲［25-26］。神經活性配體-受體相互作用是質膜上所有與細胞內外信號通路相關的受體和配體的集合，作用于該通路可調節多種神經遞質及其受體結合［27］。晚期糖基化終產物 （AGEs） 是由蛋白質、脂質和核酸的非酶糖基化和氧化產生，AGE/RAGE信號傳導引發涉及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶、蛋白激酶 C 和絲裂原活化蛋白激酶的多個細胞內信號通路的激活，進而導致核轉錄因子-κB活化［28］。研究顯示RAGE可促進幽門螺桿菌對細胞的黏附性，同時幽門螺桿菌可促進胃癌細胞RAGE的表達，兩者通過協同增加炎性反應因子的釋放促進胃癌進展［29］。PI3K-AKT信號通路的激活與腫瘤的發生發展密切相關［30-31］，可促進腫瘤細胞的生長、增殖和轉移，抑制凋亡，促血管生成及誘導化療和放療抗性［32］。活性物質通過調節PI3K和AKT磷酸化水平影響腫瘤細胞的增殖、凋亡甚至化療和放療抗性，從而在胃癌的輔助性治療中發揮作用。EGFR與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲密切相關，其過表達或組成性激活在腫瘤細胞常見，與配體EGF結合后活化受體的酪氨酸激酶，再將活化后的信號向下游傳遞誘導激活下游的VEGF高表達，并與其主要配體VEGFR2結合，促進腫瘤組織的血管生成［33-34］，活性物質靶向腫瘤細胞、微環境細胞，從而調節微環境的平衡作用，可抑制腫瘤生長［35］。MAPK信號通路從細胞周期、分化、凋亡、自噬、侵襲轉移及耐藥等多維度調控腫瘤的發生和發展，活性物質可通過激活MAPK通路，誘導細胞凋亡，發揮其抗腫瘤藥理作用［36-37］。磷脂酶D具有促進癌細胞的存活增殖及細胞遷移、侵襲的作用，活性物質通過作用磷脂酶D下調Wnt信號通路的活性抑制癌細胞增殖和轉移，抑制β-catenin蛋白入核進轉錄而抑制Wnt信號通路靶基因的表達，抑制癌細胞增殖和轉移過程［38］。生長因子如EGF、PDGF、FGF等激活受體酪氨酸激酶后，可活化由原癌基因FaS編碼的Ras蛋白，催化其底物蛋白的酪氨酸磷酸化反應，引發蛋白磷酸化的級聯反應，調節一系列與細胞生長、分化、凋亡有關的重要功能［39］。Rapl是Ras癌基因家族成員之一，調節細胞黏附和腫瘤發生［40］，活性物質作用于Ras、Rap1信號通路可直接或間接調節細胞分化、增殖和凋亡過程。胃癌患者約35%～60%伴隨不同程度的幽門螺桿菌感染［41-42］，不同類別白細胞如中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞、肥大細胞等可在感染部位激活和募集，分泌炎癥因子、趨化因子、生長因子等，如IL-6、TNF、PDGF、EGF、FGF、VEGFA等，組成炎癥-腫瘤微環境，并刺激腫瘤細胞生長，血管和淋巴管生成以及腫瘤的浸潤轉移［43-44］。活性物質通過作用于白細胞跨內皮遷移、中性粒細胞胞外陷阱形成、TRP通道的炎癥介質調節、趨化因子等通路干預慢性炎癥過程，輔助抗癌治療，抑制癌癥復發。

綜上所述，本研究通過生物信息學分析基質細胞含量與胃癌臨床特征關聯，發現基質細胞為潛在的胃癌干預策略，并闡述了胃復春膠囊干預基質細胞的潛在物質基礎、作用靶點及信號通路。由于本研究未能進一步進行體外、體內實驗驗證，后續將進一步完善，為胃癌干預策略及胃復春作用機制及物質基礎研究提供參考依據。

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