發光細菌測試水質生物毒性影響因素研究

◇天津市環鑒環境檢測有限公司 宋靜靜

天津市生態環境監測中心 鞏元帥

在水質監測中，發光細菌法測定生物毒性，操作簡單、反應快速，該方法廣泛應用于毒性檢測。本文分析了鹽度、溫度、pH、溶解氧、反應體系、菌液狀態、表征方式及擬合模型等因素對發光細菌法測定生物毒性的影響，以期為發光細菌法測定水質生物毒性提供參考。

在我國水環境保護工作中，評價江、河、湖泊等各類水體水環境健康程度，主要依靠常規理化監測分析方法，雖然通過理化監測在主要污染物濃度評價及總量控制方面取得了顯著成效，水質得到了明顯改善，但在以生物監測為主的水生態環境健康方面，國內尚未在水生態環境保護工作中深入開展這項工作。目前，在環境健康監測中采用的生物監測技術主要包括人體內暴露監測、遺傳毒性監測及生物毒性監測，其中，生物毒性監測技術被廣泛應用于各國家環境污染評價中[1]。

生物毒性監測是基于生態毒理學研究有毒有害物質對微生物、植物、動物等損害情況的監測方法，可以實現分子、細胞、個體等不同水平的毒性檢測[2]。根據不同生物檢測原理，水環境安全監測中常用的毒性檢測方法有魚法、水蚤法、藻法、發光細菌法以及微生物燃料電池法等[3]。在微生物毒性檢測中，發光細菌法應用最為廣泛，且國內現行的標準規范GB/T 15441也選用此方法。因此，為更好地利用發光細菌法測試生物毒性，本文總結分析了發光細菌法的主要影響因素，以期為水質生物毒性監測提供參考。

1 環境因素

1.1 鹽度

發光細菌在生長過程中，所處環境需要保持一定的鹽度，超過或低于臨界值，則會影響細菌生長代謝，抑制細菌活性。對于青海弧菌等淡水發光菌，在檢測水質毒性時，水樣采集后可直接測定，不需要調整溶液鹽度；費氏弧菌等海洋發光菌，則需要在測定條件下加入一定量的鹽分。羅巔輝等[4]在海洋費氏弧菌培養條件的研究中，對費氏弧菌生長的鹽度進行了探索，實驗結果顯示，鹽度在1%-5%期間菌株生長較好；余露軍等[5]在費氏弧菌急性毒性微孔板檢測方法優化實驗中，鹽度控制在1.5%-3.5%最適宜費氏弧菌生長，活性較高。

1.2 溫度

發光強度與發光細菌活性的影響，主要是由于細胞壁、細胞膜、核酸及蛋白質等物質的活性隨溫度變化而改變，低溫活性降低，高溫則會發生變性、凝固，導致活性消失。趙洋甬等[6]研究了活化溫度對費氏弧菌發光的影響，結果表明環境溫度需控制在10℃-25℃之間。此外，同一溫度條件下，培養時間不同，細菌的發光強度也不相同。陳水松等[7]在3%NaCl條件下測試了20℃、25℃、30℃三個溫度梯度下細菌發光強度，在25℃條件下費氏弧菌培養15-22h發光度高且穩定。

1.3 pH

在毒性測試時，主要在于改變細胞膜電荷和營養物的離子化程度，進而改變細胞的活性。研究表明，當水樣pH控制在6-9之間時，即pH不超標的情況下，發光細菌的發光強度基本不受pH的影響，無需調節水樣pH值。當研究特定物質毒性時，在不同pH條件下其分子電離形態不同，毒性隨著pH的變化而變化，須根據監測需要，調節水樣pH值。銅、鉛等重金屬隨著pH的升高而增大[7]，苯酚類化合物毒性隨著pH的升高而減小[8]。

1.4 溶解氧

發光細菌細胞內生命代謝所引起的各種生物化學反應伴隨著物質的氧化及還原，因此水體中須保持一定的含氧量。費氏弧菌等發光細菌作為好氧菌，須要有氧分子的參與[9]。在毒性測試過程中，溶解氧濃度需要大于3.0mg/L[10]。為減小溶解氧對發光細菌發光強度的影響，可通過攪拌等方式來增加溶解氧含量。

2 樣品處理方式

2.1 反應體系

在利用發光細菌測試樣品生物毒性前，需要確定實驗反應體系即菌液與樣品反應比例，以保證每次監測結果的可比性。國內大多按照菌液與溶液總體積1:10反應體系[11-12]進行測試，也有學者對不同比例反應體系進行了比較。余露軍等[5]在研究在微孔板發光測定中比較了硫酸鋅對1:1、1:5、1:10等不同反應體系半數抑制濃度EC50的影響，實驗結果表明，反應體系1:10時費氏弧菌毒性效應最強，且測試結果變異系數相對較小，此外由實驗結果可以看出，反應體系比值越大，測得的EC50濃度越高。

2.2 菌液狀態

發光細菌測試水樣時，無論是利用凍干粉還是新鮮培養液制備菌懸液，在加入樣品測試前，需要保持良好的菌液活性，以提高生物毒性測試的靈敏度和準確度。目前，用于測量菌液活性的檢測方法主要有發光強度檢測法和吸光度法。對于菌液發光強度，在標準物質測量時變化范圍在20%-80%之間，則認定菌液活性好，測定結果有效[10]。吸光度法則是通過測定光密度值，指示菌體細胞密度來反映菌種活性。王娜等[13]以600nm處紫外吸收光度值（OD600）表征菌密度，分別測定了不同化學物質的急性生物毒性，結果表明菌懸液OD600控制在2.0左右時，檢測靈敏度最高。

3 結果處理

3.1 結果測定

有毒物質對發光細菌的毒性效應主要體現在對細菌發光強度的抑制，雖然在實驗中使用的發光細菌菌液是混勻的懸濁液，但隨著時間推移，受環境因素及發光菌自身代謝影響，菌液的發光變化情況也不完全一致，測定發光強度時易引起誤差，因此提高細菌發光測定準確度尤為重要。馬勇等[11]在發光強度測定過程中，利用發光菌空白發光強度與原始發光強度的比值來校正測定結果，并與傳統方法進行了比較，結果表明在計算當量苯酚濃度時線性相關系數優于傳統方法。

3.2 表征方式

在發光細菌生物毒性測試中，基于發光強度測試結果的毒性表征方式主要有EC50、最低無效應稀釋度、當量氯化汞或苯酚濃度、發光抑制率等。前兩種表征方式歐美國家應用較多，強調無毒或低毒效應，國內則主要采用當量氯化汞或苯酚濃度、發光抑制率等，用于反映污染物風險[14]。孫成華等[15]在污染源監測中對不同表征方式進行了探討比較，結果表明對于發光抑制率小于60%且無法求出EC50的水樣，采用當量毒性參照物濃度表征，對大于60%的水樣，采用最低無效應稀釋度表征更直觀可靠。

4 結束語

在生物毒性監測中，發光細菌法與其他生物監測方法相比，具有快速、簡單、靈敏的特點，但發光細菌作為微生物，在測定過程中容易受到擾動，從而影響測定結果，因此在以后的應用中，還需做好以下幾方面工作：①在菌液培養中，優先選擇品質好的菌種，減小菌液本身產生的誤差；②根據菌液活性劑存儲時間，在監測過程中發現菌液活性不滿足要求時，及時進行更換；③在數據擬合模型應用中，研究非線性模型數據擬合方法，提高監測結果準確性。

隨著“十四五”期間水生態評價及生物多樣性評價的日益關注，生物監測已成為水環境質量監測的發展方向，生物毒性監測作為生物監測的一種，在評價水體水質安全中得到了廣泛應用。利用生物毒性監測數據，結合其他水質及生物監測指標，建立水生態評價體系開展評價將是水生態環境管理發展的重點方向。