酸性蛋白酶AP-10分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)

向珍蓉,余華順,龔大春

(1.三峽大學(xué)生物與制藥學(xué)院,湖北 宜昌 443002;2.安琪酵母股份有限公司,湖北 宜昌 443002)

酸性蛋白酶是適合在酸性條件下分解蛋白質(zhì)的一類蛋白水解酶,在其活性位點有2個天冬氨酸,代表性特征是將2個疏水氨基酸斷裂,通過內(nèi)切和外切作用將蛋白質(zhì)水解為小肽和氨基酸[1]。酸性蛋白酶作為酶制劑市場用量較大的一種單酶,在釀造、食品、飼料和皮革等行業(yè)具有重要的應(yīng)用價值[2-5]。目前國內(nèi)外在酸性蛋白酶的菌種選育、發(fā)酵工藝、檢驗方法、分離純化及酶學(xué)性質(zhì)[6-11]方面均有不同程度的研究,研究熱點是分離純化及酶學(xué)性質(zhì)。在此,作者以酸性蛋白酶AP-10為研究對象,采用活性炭吸附脫色、硫酸銨分級沉淀、脫鹽和凝膠層析等技術(shù)對其進行分離純化,并對其酶學(xué)性質(zhì)進行研究,以期為酸性蛋白酶AP-10的廣泛應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

酸性蛋白酶AP-10濃縮液,由安琪酵母股份有限公司酶制劑生產(chǎn)部提供。

活性炭、硫酸銨、硫酸鎳、硫酸亞鐵、硫酸銅、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸鎂、氯化鈷等均為分析純;標準蛋白,金斯瑞生物科技有限公司。

AL204型電子天平、實驗室pH計,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋,金壇杰瑞爾電器有限公司;HiTripTMDesalting、SuperdexTM75 10/300 GL、Pure 25 M1型蛋白純化儀,美國GE AKTA;UV-2802H型紫外可見分光光度計,上海尤尼柯儀器有限公司;DYY-5型電泳儀,北京六一儀器廠;Sigma 4-16KS型臺式離心機,德國Sigma。

1.2 酸性蛋白酶AP-10酶活的測定

采用分光光度法測定酸性蛋白酶AP-10的酶活。以酪蛋白為底物,在40 ℃水浴中與稀釋酶液反應(yīng)10 min,用三氯乙酸中止反應(yīng),沉淀過濾后以福林試劑顯色20 min,用10 mm比色皿測定其在680 nm處吸光度。以先加三氯乙酸為對照,計算吸光度差值。

在上述條件下,每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量,即為1個酶活力單位,以U·mL-1表示。

1.3 酸性蛋白酶AP-10的分離純化

酸性蛋白酶AP-10濃縮液經(jīng)活性炭吸附脫色、硫酸銨分級沉淀、HiTripTMDesalting 脫鹽、SuperdexTM75 10/300 GL凝膠層析后得到純組分。

活性炭吸附脫色:稱取一定量的酸性蛋白酶AP-10濃縮液于燒杯中,分別添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的活性炭,室溫下機械攪拌1 h;除去活性炭殘渣,測定脫色液在600 nm處吸光度,計算脫色率,確定最佳的活性炭用量。

硫酸銨分級沉淀:選取脫色效果最佳的脫色液,逐級加入硫酸銨,使其飽和度依次達到20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%,測定各級沉淀比酶活。

HiTripTMDesalting 脫鹽:將上述比酶活最高的沉淀用乳酸緩沖溶液溶解,上HiTripTMDesalting柱,上樣量為0.5 mL,選擇適宜流速用乳酸緩沖溶液洗脫,收集主蛋白峰,凍干保存。

SuperdexTM75 10/300 GL凝膠層析:將脫鹽凍干的樣品用乳酸緩沖溶液溶解,上SuperdexTM75 10/300 GL凝膠層析柱,上樣量為0.5 mL,選擇適宜流速用乳酸緩沖溶液洗脫,收集第1個蛋白峰,依次收集10管,冷凍干燥,即得酸性蛋白酶AP-10純組分。

1.4 酸性蛋白酶AP-10的酶學(xué)性質(zhì)研究

1.4.1 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性

將酸性蛋白酶AP-10純組分用醋酸緩沖溶液溶解,分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃下測定酶活,確定其最適反應(yīng)溫度。將酸性蛋白酶AP-10純組分分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃下靜置2 h后用醋酸緩沖溶液(pH值3.0)溶解,測定殘余酶活,研究其熱穩(wěn)定性。

1.4.2 最適反應(yīng)pH值和pH穩(wěn)定性

分別用pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的醋酸緩沖溶液溶解酸性蛋白酶AP-10純組分,測定酶活,確定其最適反應(yīng)pH值。分別用pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的醋酸緩沖溶液溶解酸性蛋白酶AP-10純組分,靜置2 h后測定殘余酶活,研究其pH穩(wěn)定性。

1.4.3 金屬離子的影響

將酸性蛋白酶AP-10純組分分別用終濃度為1 mmol·L-1、5 mmol·L-1、15 mmol·L-1、55 mmol·L-1的金屬離子(Ni2+、Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Ca2+、Co2+)溶液溶解,室溫靜置1 h后測定殘余酶活,以不加金屬離子時的酶活為100%,研究金屬離子對酸性蛋白酶AP-10酶活的影響。

1.5 分析方法

采用OriginPro 9.0和Excel 2007進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸性蛋白酶AP-10的純化

2.1.1 活性炭吸附脫色

分別用0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的活性炭對酸性蛋白酶AP-10濃縮液進行脫色處理,測定脫色率,結(jié)果如圖1所示。

圖1 活性炭用量對脫色率的影響

由圖1可知,隨著活性炭用量的增加,酸性蛋白酶AP-10濃縮液的脫色率迅速升高,脫色效果顯著,在活性炭用量為0.8%時,脫色率達到90%;繼續(xù)增加活性炭用量,脫色率變化不大。因此,確定最佳活性炭用量為0.8%。

2.1.2 硫酸銨分級沉淀

在酸性蛋白酶AP-10脫色液中逐級加入硫酸銨,使其飽和度依次達到20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%,收集上清和沉淀,測定比酶活,結(jié)果見表1。

表1 酸性蛋白酶AP-10脫色液經(jīng)硫酸銨分級沉淀后的比酶活

由表1可知,隨著硫酸銨飽和度的增加,酸性蛋白酶AP-10脫色液分級沉淀的上清比酶活逐漸降低、沉淀比酶活先升高后降低;當硫酸銨飽和度為60%時,沉淀比酶活達到最高。

2.1.3 脫鹽

將上述比酶活最高的沉淀用乳酸緩沖溶液溶解,上HiTripTMDesalting柱,上樣量0.5 mL,用乳酸緩沖溶液洗脫,流速0.5 mL·min-1,結(jié)果如圖2所示。

圖2 酸性蛋白酶AP-10的HiTripTM Desalting柱脫鹽圖譜

由圖2可知,硫酸銨分級沉淀后的酸性蛋白酶AP-10經(jīng)HiTripTMDesalting柱脫鹽后,可將鹽與目的蛋白峰(第1個蛋白峰)分開。

2.1.4 凝膠層析

將脫鹽后的酸性蛋白酶AP-10凍干樣品用乳酸緩沖溶液溶解,上SuperdexTM75 10/300 GL凝膠層析柱,結(jié)果如圖3所示。

圖3 酸性蛋白酶AP-10的SuperdexTM 75 10/300 GL凝膠層析圖譜

由圖3可知,脫鹽后的酸性蛋白酶AP-10凍干樣品經(jīng)SuperdexTM75 10/300 GL凝膠層析純化后,可得到單一蛋白峰。

2.1.5 SDS-PAGE電泳

分別將酸性蛋白酶AP-10濃縮液、硫酸銨分級沉淀液、脫鹽液及純組分的蛋白濃度稀釋至1～2 mg·mL-1,進行SDS-PAGE電泳分析,結(jié)果如圖4所示。

M.蛋白marker 1.濃縮液 2.硫酸銨分級沉淀液 3.脫鹽液 4.純組分

由圖4可知,酸性蛋白酶AP-10發(fā)酵液經(jīng)濃縮、活性炭吸附脫色、硫酸銨分級沉淀、脫鹽及凝膠層析等純化過程后,可以獲得純組分(條帶4),分子量約為40 kDa,比酶活達到5 800 U·mg-1,純化倍數(shù)為6倍(表2)。

表2 各步純化的比酶活和純化倍數(shù)

2.2 酸性蛋白酶AP-10的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 溫度對酸性蛋白酶AP-10酶活的影響(圖5)

a.不同溫度下的相對酶活 b.不同溫度下靜置2 h后的殘余酶活

由圖5可知,酸性蛋白酶AP-10的最適反應(yīng)溫度為40 ℃;當溫度低于40 ℃時,酶活穩(wěn)定性較高,殘余酶活較高;當溫度高于40 ℃時,酶活穩(wěn)定性較低,殘余酶活急劇下降,60 ℃時殘余酶活僅20%。綜合考慮酶活損失與催化效率,酸性蛋白酶AP-10適宜反應(yīng)溫度為30～45 ℃。

2.2.2 pH值對酸性蛋白酶AP-10酶活的影響(圖6)

a.不同pH值下的相對酶活 b.不同pH值下靜置2 h后的殘余酶活

由圖6可知,酸性蛋白酶AP-10的最適反應(yīng)pH值為3.0;在pH值為3.5～6.5時,酶活穩(wěn)定性較高,殘余酶活在80%以上。表明酸性蛋白酶AP-10的最適反應(yīng)pH值偏酸性且范圍較廣。

2.2.3 金屬離子對酸性蛋白酶AP-10酶活的影響(圖7)

圖7 金屬離子對酸性蛋白酶AP-10酶活的影響

由圖7可知,1 mmol·L-1的Ni2+、Cu2+、Mn2+對酸性蛋白酶AP-10有激活作用;1～55 mmol·L-1的Mn2+均對酸性蛋白酶AP-10有激活作用,15 mmol·L-1時的相對酶活最高,為125%,說明Mn2+對酸性蛋白酶AP-10具有強烈的激活作用;55 mmol·L-1的Fe2+、Zn2+、Co2+對酸性蛋白酶AP-10有較強的抑制作用,相對酶活分別降至20%、64%、60%;1～55 mmol·L-1的Fe2+均對酸性蛋白酶AP-10具有抑制作用,說明Fe2+對酸性蛋白酶AP-10具有強烈的抑制作用。

3 結(jié)論

采用活性炭吸附脫色、硫酸銨分級沉淀、脫鹽和凝膠層析等技術(shù)對酸性蛋白酶AP-10濃縮液進行分離純化,獲得酸性蛋白酶AP-10純組分,比酶活為5 800 U·mg-1,純化倍數(shù)為6倍,最適反應(yīng)溫度為40 ℃,熱穩(wěn)定范圍為30～45 ℃;最適反應(yīng)pH值為3.0,pH值穩(wěn)定范圍為3.5～6.5;Mn2+對酸性蛋白酶AP-10具有強烈的激活作用,Fe2+對酸性蛋白酶AP-10具有強烈的抑制作用。酸性蛋白酶AP-10廣泛應(yīng)用于釀造、食品、飼料等領(lǐng)域,隨著對其研究的深入,它將具有更廣闊的應(yīng)用前景,同時,也對酸性蛋白酶AP-10 提出了更高的要求,需要進一步探究并開發(fā)高品質(zhì)產(chǎn)品。