大孔吸附樹脂法分離純化白僵菌素

周站云,郭月玲,周 博,李 敏,彭 亮,王崔巖

(微生物藥物國(guó)家工程研究中心 河北省工業(yè)微生物代謝技術(shù)創(chuàng)新中心 華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司,河北 石家莊 052165)

白僵菌素(beauvericin)為鐮刀菌次級(jí)代謝產(chǎn)物[1],是由3個(gè)(D-2)-α-羥基異戊酸和3個(gè)N-甲基苯丙氨酸交替組成的白色針狀六元環(huán)狀縮酯肽化合物,分子式C45H57N3O9,相對(duì)分子量783.95,化學(xué)性質(zhì)較穩(wěn)定。

研究表明,白僵菌素具有多種生物活性,如抗腫瘤、殺蟲、抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗炎、降膽固醇等[2-3]。將白僵菌素和抗真菌藥物制成復(fù)合制劑,不僅可減少抗真菌藥物的用量降低副作用,還能提高抗真菌藥物的藥效[4]。

目前,有關(guān)白僵菌素分離純化的文獻(xiàn)報(bào)道較少[5]。因此,作者開發(fā)大孔吸附樹脂分離純化白僵菌素的工藝路線,通過大孔吸附樹脂吸附、乙醇解吸,再經(jīng)過濃縮、萃取、脫色、結(jié)晶得到高純度白僵菌素。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

白僵菌素發(fā)酵液,由華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司微生物所提供。

白僵菌素對(duì)照品,自制;樹脂HZ801、HZ814、HZ816、HZ818、HZ830、HZ835,上海華震科技有限公司;樹脂LX-16、LX-28、LX-32、LX-620、LX-1600、LSA-700,西安藍(lán)曉科技新材料股份有限公司;乙腈(色譜純),美國(guó)Merck公司;工業(yè)乙醇,中糧生化能源(肇東)有限公司;活性炭,上海興長(zhǎng)活性炭有限公司;乙酸乙酯、異丙醚,天津永大化學(xué)試劑有限公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

LC-2010AHT型高效液相色譜儀,日本島津公司;YR-PTB型真空泵、RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;81-2型磁力攪拌器,上海司樂儀器有限公司。

1.2 白僵菌素的分離純化

白僵菌素發(fā)酵液的預(yù)處理:由于白僵菌素為胞內(nèi)發(fā)酵,大部分產(chǎn)物在菌絲體內(nèi)。取白僵菌素發(fā)酵液,真空抽濾,保留菌絲,用1～1.5倍發(fā)酵液體積的工業(yè)乙醇浸泡,過濾,得白僵菌素浸泡液,備用。

采用大孔吸附樹脂法分離純化白僵菌素。經(jīng)吸附、解吸、濃縮、萃取、脫色、結(jié)晶等步驟得到高純度白僵菌素。

1.3 白僵菌素分離純化條件優(yōu)化

1.3.1 樹脂型號(hào)的篩選

樹脂的預(yù)處理和再生:將樹脂用工業(yè)乙醇浸泡4 h,過濾,用去離子水洗至不再混濁,除去致孔劑;用2 mol·L-1HCl溶液浸泡2 h,去離子水洗至中性;再用2 mol·L-1NaOH溶液浸泡2 h,去離子水洗至中性,備用。同法對(duì)使用過的樹脂進(jìn)行再生處理。

樹脂型號(hào)的靜態(tài)篩選:取預(yù)處理好的樹脂10 mL(V0)放入三角瓶中;將預(yù)處理好的白僵菌素發(fā)酵液乙醇浸泡液的酒精度調(diào)至40%,采用HPLC法測(cè)定白僵菌素初始濃度(c0,μg·mL-1);將100 mL(V1)40%酒精度的乙醇浸泡液加入三角瓶中,每隔0.5 h充分搖晃1 min,4 h后取上清,采用HPLC法測(cè)定白僵菌素濃度(c1,μg·mL-1),按式(1)計(jì)算樹脂吸附量(μg·mL-1),考察樹脂型號(hào)對(duì)白僵菌素吸附效果的影響。

(1)

色譜條件:菲羅門IS-Sil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),流動(dòng)相為乙腈-水(78∶22,體積比),流速1 mL·min-1,波長(zhǎng)214 nm,柱溫30 ℃,進(jìn)樣量10 μL,白僵菌素出峰時(shí)間為13.7 min。

1.3.2 上柱液酒精度的篩選

白僵菌素發(fā)酵液乙醇浸泡液的酒精度一般在75%～85%之間,用去離子水將浸泡液的酒精度分別調(diào)至40%、50%,作為上柱液,HPLC法測(cè)定上柱液中白僵菌素濃度。取100 mL預(yù)處理好的篩選樹脂裝柱,將酒精度為40%和50%的上柱液分別自柱頂流加上柱,上柱流速2 BV·h-1,前10 BV樹脂體積的流出液收集在一個(gè)試管中,后面每小時(shí)收集一次,取換管時(shí)的瞬時(shí)流出液,測(cè)定其中白僵菌素濃度,當(dāng)其濃度達(dá)到20%cS時(shí),停止上柱,合并含有白僵菌素的流出液,測(cè)定其中白僵菌素濃度,按式(2)計(jì)算樹脂吸附量(μg·mL-1),考察上柱液酒精度對(duì)白僵菌素吸附效果的影響。

(2)

式中:cS為上柱液中白僵菌素濃度,μg·mL-1;VS為上柱液體積,mL;c為含有白僵菌素流出液中的白僵菌素濃度,μg·mL-1;V為含有白僵菌素流出液體積,mL;VR為樹脂裝柱體積,mL。

1.3.3 上柱流速的篩選

取8根樹脂柱,分別裝入篩選樹脂100 mL,從柱頂加入40%酒精度的上柱液,控制上柱流速分別為0.5 BV·h-1、1.0 BV·h-1、1.5 BV·h-1、2.0 BV·h-1、2.5 BV·h-1、3.0 BV·h-1、4.0 BV·h-1、5.0 BV·h-1,計(jì)算樹脂吸附量,考察上柱流速對(duì)白僵菌素吸附效果的影響。

1.3.4 解吸劑的篩選

白僵菌素易溶于有機(jī)溶劑,因此,優(yōu)選低毒環(huán)保的乙醇和丙酮作為解吸劑。由于浸泡白僵菌素發(fā)酵液時(shí)選用的是乙醇,為便于有機(jī)溶劑回收利用,選用同一溶劑乙醇作為解吸劑。酒精度為40%的上柱液吸附飽和后,先用40%乙醇洗脫,以除去殘留的色素、蛋白及其它極性大的雜質(zhì),再分別用70%、80%、90%的乙醇作為解吸劑,解吸流速為0.5 BV·h-1,每0.5 h收集一次解吸液,測(cè)定解吸液中白僵菌素濃度,解吸4倍體積后停止解吸,合并有效解吸液,測(cè)定HPLC含量,計(jì)算解吸收率,考察解吸劑對(duì)白僵菌素解吸效果的影響。樹脂可再生使用。

1.3.5 萃取溶劑的篩選

收集有效解吸液,真空濃縮至酒精度為0,計(jì)量濃縮液體積(V0),測(cè)定濃縮液中白僵菌素濃度(c0);分別以乙酸乙酯、乙酸丁酯、正丁醇為萃取溶劑,各萃取3次,萃取溶劑用量為濃縮液體積的1/2,按式(3)計(jì)算萃取收率,考察不同溶劑對(duì)白僵菌素萃取效果的影響。

(3)

式中:c1、c2、c3分別為萃取1次、2次、3次后的白僵菌素濃度,μg·mL-1;V1、V2、V3分別為萃取1次、2次、3次后的溶媒體積,mL。

1.3.6 脫色劑活性炭加量的篩選

在萃取液中分別加入0.5%、1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、9.0%、10.0%(以萃取液中白僵菌素質(zhì)量計(jì))的活性炭脫色,攪拌0.5 h后過濾,測(cè)定濾液中白僵菌素濃度,并觀察脫色后溶液顏色變化。考察活性炭加量對(duì)白僵菌素脫色效果的影響。

1.3.7 結(jié)晶溶劑的篩選

脫色液真空濃縮;再分別以乙酸乙酯、異丙醚、乙醇為結(jié)晶溶劑,將濃縮液濃度調(diào)至5.0×104μg·mL-1、7.5×104μg·mL-1、10.0×104μg·mL-1,室溫?cái)嚢? h后于冷庫中靜置過夜;第2 d過濾,用結(jié)晶溶劑挖洗結(jié)晶粉,真空抽濾至干,置于真空烤箱中40 ℃干燥4 h;取出結(jié)晶粉,稱重,測(cè)定結(jié)晶粉HPLC含量。考察白僵菌素在不同溶劑中的結(jié)晶情況。

重結(jié)晶精制白僵菌素:用篩選得到的結(jié)晶溶劑加熱溶解結(jié)晶粉,控制溶液中白僵菌素濃度為7.5×104～8.0×104μg·mL-1,攪拌,冷卻至室溫,繼續(xù)攪拌2 h,冷庫過夜,真空抽濾,結(jié)晶溶劑挖洗,抽濾至干,置于40 ℃真空烤箱中干燥,即得白僵菌素精粉,稱重,測(cè)定HPLC含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹脂型號(hào)的確定

HZ801、HZ814、HZ816、HZ818、HZ830、HZ835、LX-16、LX-28、LX-32、LX-620、LX-1600、LSA-700等12種樹脂對(duì)白僵菌素的吸附量(μg·mL-1)分別為2 160、1 930、1 950、1 980、1 740、1 400、2 020、1 800、1 600、1 580、1 760、1 740。其中,樹脂HZ801和LX-16對(duì)白僵菌素的靜態(tài)吸附效果較好。可通過動(dòng)態(tài)吸附進(jìn)一步篩選樹脂。

2.2 上柱液酒精度的確定

以HZ801樹脂裝柱,將酒精度為40%和50%的上柱液流加上柱,樹脂吸附量分別為6 852 μg·mL-1和4 936 μg·mL-1;以LX-16樹脂裝柱,將酒精度為40%和50%的上柱液流加上柱,樹脂吸附量分別為4 596 μg·mL-1和2 650 μg·mL-1。

可知,HZ801樹脂對(duì)酒精度為40%的白僵菌素的吸附效果最好。因此,選擇HZ801樹脂裝柱,上柱液酒精度以40%最佳。

2.3 上柱流速的確定

以HZ801樹脂裝柱,上柱液酒精度為40%,在流速分別為0.5 BV·h-1、1.0 BV·h-1、1.5 BV·h-1、2.0 BV·h-1、2.5 BV·h-1、3.0 BV·h-1、4.0 BV·h-1、5.0 BV·h-1時(shí)連續(xù)上柱,考察上柱流速對(duì)樹脂吸附量的影響,結(jié)果如圖1所示。

圖1 上柱流速對(duì)樹脂吸附量的影響

由圖1可知,隨著上柱流速的加快,樹脂吸附量逐漸減少,當(dāng)上柱流速為3.0 BV·h-1時(shí),吸附量斷崖式減少。綜合考慮時(shí)間效率,流速太低影響生產(chǎn)周期,確定最佳流速為2.0 BV·h-1。

2.4 解吸劑的確定

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),用100 mL HZ801樹脂裝柱,其對(duì)酒精度為40%的白僵菌素的吸附量達(dá)到6 500 μg·mL-1。首先用40%乙醇洗滌樹脂柱,流出液呈黃色,其中白僵菌素濃度為零,說明40%乙醇洗掉了色素等極性大的雜質(zhì)。再分別用70%、80%、90%乙醇解吸,考察解吸劑對(duì)白僵菌素解吸效果的影響,結(jié)果見表1。

表1 解吸劑對(duì)白僵菌素解吸效果的影響

由表1可知,以90%乙醇為解吸劑時(shí),能夠解吸大部分白僵菌素,解吸收率最高,但是HPLC含量較低;以70%乙醇為解吸劑時(shí),雖然解吸收率和HPLC含量有所升高,但HPLC圖譜拖尾嚴(yán)重,解吸液體積過大,有機(jī)溶劑用量過多,會(huì)增加后處理難度及能耗;以80%乙醇為解吸劑時(shí),解吸收率和HPLC含量均較高。因此,選擇80%乙醇作為解吸劑。

2.5 萃取溶劑的選擇

將解吸液濃縮至酒精度為0,白僵菌素濃度為13 826 μg·mL-1。取濃縮液100 mL,分別以乙酸乙酯、乙酸丁酯、正丁醇為萃取溶劑,各萃取3次,每次50 mL。考察不同溶劑對(duì)白僵菌素萃取效果的影響,結(jié)果見表2。

表2 不同溶劑對(duì)白僵菌素萃取效果的影響

由表2可知,以乙酸乙酯、乙酸丁酯為萃取溶劑時(shí)的總萃取收率明顯高于以正丁醇為萃取溶劑時(shí)的總萃取收率,且以乙酸乙酯為萃取溶劑時(shí)的第3次萃取收率很低,前2次的總萃取收率達(dá)到95.7%,這樣可以減少1次萃取步驟,省時(shí)省力,減少溶劑用量。因此,確定最佳萃取溶劑為乙酸乙酯。

2.6 活性炭加量的選擇

在萃取液中分別加入0.5%、1.0%、3.0%、5.0%、7.0%、9.0%、10.0%的活性炭脫色,考察活性炭加量對(duì)白僵菌素脫色效果的影響,結(jié)果見表3。

表3 活性炭加量對(duì)白僵菌素脫色效果的影響

由表3可知,隨著活性炭加量的增加,白僵菌素濃度逐漸降低,溶液顏色逐漸變淺。綜合考慮,確定最佳活性炭加量為3.0%～5.0%。

2.7 結(jié)晶條件的選擇

脫色液濃縮后為黏稠的油膏,分別以乙酸乙酯、異丙醚、乙醇為結(jié)晶溶劑,將白僵菌素濃度稀釋至5.0×104μg·mL-1、7.5×104μg·mL-1、10.0×104μg·mL-1,考察白僵菌素在不同溶劑中的結(jié)晶情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),5.0×104μg·mL-1白僵菌素在乙酸乙酯和異丙醚中不能結(jié)晶,在乙醇中結(jié)晶量太少;7.5×104μg·mL-1、10.0×104μg·mL-1白僵菌素在乙醇中不能結(jié)晶,在乙酸乙酯中可以結(jié)晶,HPLC含量分別為74.4%、78.2%,在異丙醚中也可以結(jié)晶,HPLC含量分別為82.4%、79.6%,且在異丙醚中得到的結(jié)晶粉的白僵菌素HPLC含量高于在乙酸乙酯中得到的結(jié)晶粉。因此,選擇異丙醚作為結(jié)晶溶劑。

用異丙醚進(jìn)行重結(jié)晶,得到的白僵菌素精粉HPLC含量高于98.5%。其HPLC圖譜如圖2所示。

圖2 白僵菌素精粉的HPLC圖譜

2.8 工藝驗(yàn)證

在最優(yōu)分離純化工藝條件下,即HZ801樹脂裝柱、上柱液酒精度40%、上柱流速2.0 BV·h-1、80%乙醇解吸、乙酸乙酯萃取、3.0%～5.0%活性炭脫色、異丙醚結(jié)晶和重結(jié)晶,進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)

3 結(jié)論

采用大孔吸附樹脂法分離純化白僵菌素。白僵菌素發(fā)酵液乙醇浸泡液經(jīng)HZ801樹脂吸附(上柱液酒精度40%、上柱流速2.0 BV·h-1)、80%乙醇解吸、乙酸乙酯萃取、3.0%～5.0%活性炭脫色、異丙醚結(jié)晶和重結(jié)晶,得到HPLC含量高于98.5%的精粉。該工藝綠色環(huán)保,樹脂和有機(jī)溶劑均可回收再利用,適合工業(yè)化生產(chǎn)。