酵母專用型酶制劑的研究開發(fā)

徐婷婷,鄭元山,鄧必成,王巍杰,陳志穎

(1.唐山拓普生物科技有限公司,河北 唐山 063000;2.華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河北 唐山 063210)

在我國(guó),啤酒廢酵母除用作種子、蛋白飼料添加劑和顆?；旌巷暳贤?大多被直接丟棄,不僅造成資源浪費(fèi),而且破壞環(huán)境。而發(fā)達(dá)國(guó)家多是將啤酒廢酵母精加工作為下游工業(yè)原料[1-7]。目前,我國(guó)啤酒廢酵母精加工產(chǎn)業(yè)較為薄弱,若能利用酶解對(duì)啤酒廢酵母進(jìn)行最大程度水解、開發(fā)酵母專用型酶制劑,為啤酒廢酵母下游工業(yè)提供充足原料,對(duì)充分利用啤酒廢酵母資源、保護(hù)環(huán)境、促進(jìn)我國(guó)下游工業(yè)長(zhǎng)足發(fā)展等具有重大意義[8]。

啤酒廢酵母不僅含有豐富的核酸、蛋白質(zhì)、氨基酸、糖類以及磷脂、固醇、不飽和脂肪酸等脂類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),還含有維生素、卵磷脂、谷胱甘肽等生物活性物質(zhì)。這些物質(zhì)的降解產(chǎn)物以及衍生物可以制成氨基酸制劑或核苷酸制劑等生物制劑,廣泛應(yīng)用于生物、醫(yī)藥、保健品等領(lǐng)域[1]。雖然啤酒廢酵母價(jià)值極高,但由于其細(xì)胞壁是以β-葡聚糖構(gòu)成,細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)具有完整構(gòu)象[9-12],酒花樹脂及單寧等成分吸附于酵母泥中導(dǎo)致廢酵母具有較強(qiáng)苦味[5],直接利用價(jià)值不大。

基于自溶對(duì)細(xì)胞壁的破壞、酶解對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的破壞,經(jīng)過自溶與酶解的酵母抽提物的氨基氮含量、總氮含量均大幅提高[13]。但是如果僅僅依靠酵母的內(nèi)源酶進(jìn)行自溶,隨著自溶的進(jìn)行,內(nèi)源酶活性不斷降低,酵母細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)很難被徹底水解,最終影響酵母抽提物的氨基氮含量與氨基氮得率[14-18]。為實(shí)現(xiàn)啤酒廢酵母資源利用的最大化,作者對(duì)啤酒廢酵母進(jìn)行自溶后,再額外添加一定量的蛋白酶進(jìn)行酶解來提高氨基氮含量與氨基氮得率,以實(shí)現(xiàn)最大程度水解,獲得氨基酸、核苷酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

啤酒廢酵母,唐山拓普生物科技公司。

胰蛋白酶、中性蛋白酶,南寧龐博生物工程有限公司;風(fēng)味蛋白酶、β-葡聚糖酶,河南萬邦化工科技有限公司;氯化鈉,天津標(biāo)準(zhǔn)科技有限公司;NaHCO3,天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;2 mol·L-1NaOH溶液、6 mol·L-1HCl溶液,自行配制。

120目篩網(wǎng),浙江上虞金鼎標(biāo)準(zhǔn)篩具廠;JM-A6002型電子天平,諸暨超澤衡器設(shè)備有限公司;CF16RN型日立高速離心機(jī),天美(中國(guó))科學(xué)儀器有限公司;ZWY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩箱,上海智城分析儀器制作有限公司;JA2003型分析天平,天津天馬衡基儀器有限公司;PHS-3C型精密pH儀,天津佑科儀器儀表有限公司;DZKW-4型水浴鍋,北京中興偉業(yè)儀器有限公司;D2004W型電動(dòng)攪拌器,上海司樂儀器有限公司;UltiMate3000型高效液相色譜儀,賽默飛科技(中國(guó))有限公司;SFG-02B型電熱恒溫干燥箱,黃石恒豐醫(yī)療器械有限公司。

1.2 啤酒廢酵母的預(yù)處理

取適量啤酒廢酵母,加入2倍體積的蒸餾水充分?jǐn)嚢柚辆鶆蚝笫褂?20目篩網(wǎng)過篩,于20 ℃、4 500 r·min-1離心15 min,離心3次,得到洗脫酵母泥。將洗脫酵母泥配成10%懸液,加入0.5%的NaHCO3,攪勻后靜置30 min,于20 ℃、4 500 r·min-1離心30 min,得到純凈酵母泥。

1.3 啤酒廢酵母的自溶

取適量純凈酵母泥于燒杯中,用蒸餾水配制成一定濃度的酵母懸液,加入一定量的氯化鈉,用2 mol·L-1NaOH溶液與0.1 mol·L-1HCl溶液調(diào)節(jié)懸液pH值,在一定溫度下進(jìn)行自溶;自溶結(jié)束后置于90 ℃水浴鍋中30 min以中止自溶,于20 ℃、4 500 r·min-1離心15 min,得到酵母蛋白水解液,測(cè)定酵母干重。

采用單因素實(shí)驗(yàn)考察氯化鈉加量、pH值、自溶時(shí)間、自溶溫度、懸液濃度對(duì)氨基氮含量和氨基氮得率的影響,探究啤酒廢酵母自溶最適條件。

1.4 啤酒廢酵母的酶解

取適量酵母蛋白水解液于燒杯中,用蒸餾水配制成一定濃度的酵母蛋白懸液,調(diào)節(jié)pH值至適宜,按一定酶底比加入蛋白酶,置于45 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩箱中酶解;酶解結(jié)束后置于90 ℃恒溫水浴鍋中20 min以中止酶解,于20 ℃、4 500 r·min-1離心15 min,收集上清液得到酵母抽提液,測(cè)定氨基氮含量,按下式計(jì)算氨基氮得率(Y,%):

式中:c為酵母抽提液中氨基氮含量,%;m1為酵母抽提物上清液質(zhì)量,g;w為上清液中固形物含量,%;m2為酵母蛋白水解液中酵母干重,g。

以氨基氮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),以pH值、酶加量、酶解時(shí)間為考察因素,采用正交實(shí)驗(yàn)探究啤酒廢酵母酶解最適條件。

1.5 蛋白酶酶解對(duì)酵母懸液pH值的影響

取一定量酵母蛋白水解液,用蒸餾水配制成14%酵母蛋白懸液,調(diào)節(jié)pH值并記錄;加入一定量蛋白酶,置于45 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩箱中酶解,每隔1 h測(cè)定pH值并記錄。

1.6 蛋白酶復(fù)合酶解最適條件的探究

選擇風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶等3種蛋白酶對(duì)啤酒廢酵母進(jìn)行復(fù)合酶解,探究最適酶解條件。其中風(fēng)味蛋白酶的加入方式分別為酶解開始時(shí)添加、酶解1 h時(shí)添加、酶解2 h時(shí)添加,加量分別為1.0%、1.5%、2.0%。取一定量酵母蛋白水解液,用蒸餾水配制成14%酵母蛋白懸液,調(diào)節(jié)pH值至8.0,加入2%的胰蛋白酶,置于45 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩箱中酶解2 h;再加入4%的中性蛋白酶,酶解4 h后置于90 ℃恒溫水浴鍋中20 min以中止酶解;然后于20 ℃、4 500 r·min-1離心15 min,收集上清液得到酵母抽提液,測(cè)定氨基氮含量,計(jì)算氨基氮得率,確定風(fēng)味蛋白酶的加入方式和加量。

2 結(jié)果與討論

2.1 啤酒廢酵母最適自溶條件

2.1.1 氯化鈉加量對(duì)氨基氮含量和氨基氮得率的影響

在酵母懸液濃度為10%、pH值為5.0、自溶溫度為50 ℃、自溶時(shí)間為24 h的條件下,考察氯化鈉加量對(duì)氨基氮含量和氨基氮得率的影響,結(jié)果如圖1所示。

圖1 氯化鈉加量對(duì)氨基氮含量和氨基氮得率的影響

由圖1可知,隨著氯化鈉加量的增加,啤酒廢酵母自溶酶解后的氨基氮含量和氨基氮得率均先升高后降低,在氯化鈉加量為1%時(shí),氨基氮得率達(dá)到最高2.3552%。因此,選擇最適氯化鈉加量為1%。

2.1.2 pH值對(duì)氨基氮含量和氨基氮得率的影響

在酵母懸液濃度為10%、氯化鈉加量為1%、自溶溫度為50 ℃、自溶時(shí)間為24 h的條件下,考察pH值對(duì)氨基氮含量和氨基氮得率的影響,結(jié)果如圖2所示。

圖2 pH值對(duì)氨基氮含量和氨基氮得率的影響

由圖2可知,在pH值為5.5時(shí),啤酒廢酵母自溶酶解后的氨基氮含量和氨基氮得率均達(dá)到最高,其中氨基氮得率達(dá)到2.2865%。因此,選擇最適pH值為5.5。

2.1.3 自溶時(shí)間對(duì)氨基氮含量和氨基氮得率的影響

在酵母懸液濃度為10%、氯化鈉加量為1%、自溶溫度為50 ℃、pH值為5.5的條件下,考察自溶時(shí)間對(duì)氨基氮含量和氨基氮得率的影響,結(jié)果如圖3所示。

圖3 自溶時(shí)間對(duì)氨基氮含量和氨基氮得率的影響

由圖3可知,在自溶時(shí)間為32 h時(shí),啤酒廢酵母自溶酶解后的氨基氮得率達(dá)到最高,為2.3433%。因此,選擇最適自溶時(shí)間為32 h。

2.1.4 自溶溫度對(duì)氨基氮含量和氨基氮得率的影響

在酵母懸液濃度為10%、氯化鈉加量為1%、自溶時(shí)間為24 h、pH值為5.5的條件下,考察自溶溫度對(duì)氨基氮含量和氨基氮得率的影響,結(jié)果如圖4所示。

圖4 自溶溫度對(duì)氨基氮含量和氨基氮得率的影響

由圖4可知,在自溶溫度為45 ℃時(shí),啤酒廢酵母自溶酶解后的氨基氮得率達(dá)到最高,為2.2852%。因此,選擇最適自溶溫度為45 ℃。

2.1.5 懸液濃度對(duì)氨基氮含量和氨基氮得率的影響

在氯化鈉加量為1%、自溶溫度為50 ℃、自溶時(shí)間為24 h、pH值為5.5的條件下,考察懸液濃度對(duì)氨基氮含量和氨基氮得率的影響,結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知,隨著懸液濃度的增加,啤酒廢酵母自溶酶解后的氨基氮含量和氨基氮得率均先升高后降低,在懸液濃度為14%時(shí),氨基氮得率達(dá)到最高,為3.0946%。因此,選擇最適懸液濃度為14%。

綜上,在氯化鈉加量為1%、pH值為5.5、自溶時(shí)間為32 h、自溶溫度為45 ℃、懸液濃度為14%的最適自溶條件下,對(duì)啤酒廢酵母進(jìn)行自溶酶解,氨基氮得率達(dá)到最高,為4.23%。

2.2 蛋白酶最適酶解條件

2.2.1 單一蛋白酶酶解最適條件

固定酶解溫度為45 ℃,分別以風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶酶解啤酒廢酵母,以氨基氮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),以pH值、酶加量、酶解時(shí)間為考察因素,通過L9(34)正交實(shí)驗(yàn)探究單一蛋白酶最適酶解條件。正交實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1,結(jié)果與分析見表2。

表1 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)因素與水平

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

由表2可知:風(fēng)味蛋白酶在45 ℃下酶解啤酒廢酵母的最適條件為A11B11C12,即pH值6.0、酶加量1%、酶解時(shí)間5 h,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),氨基氮得率為1.3723%;中性蛋白酶在45 ℃下酶解啤酒廢酵母的最適條件為A22B22C21,即pH值7.0、酶加量4%、酶解時(shí)間4 h,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),氨基氮得率為1.9103%;胰蛋白酶在45 ℃下酶解啤酒廢酵母的最適條件為A32B31C33,即pH值8.0、酶加量2%、酶解時(shí)間6 h,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),氨基氮得率為1.6303%。

2.2.2 3種蛋白酶酶解啤酒廢酵母的能力比較

最適條件下,3種蛋白酶對(duì)啤酒廢酵母的酶解能力大小依次為:中性蛋白酶>胰蛋白酶>風(fēng)味蛋白酶,中性蛋白酶的水解能力最強(qiáng),氨基氮得率為1.9103%(圖6)。這可能是由于,酶解溫度45 ℃下,中性蛋白酶的活性最高,而胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶的活性相對(duì)較低。

圖6 最適條件下3種蛋白酶對(duì)啤酒廢酵母的酶解能力比較

2.2.3 蛋白酶酶解對(duì)酵母懸液pH值的影響(表3)

表3 蛋白酶酶解對(duì)酵母懸液pH值的影響

由表3可知,胰蛋白酶對(duì)啤酒廢酵母酶解2 h后,酵母懸液pH值為6.98;中性蛋白酶對(duì)啤酒廢酵母酶解2 h后,酵母懸液pH值為6.34。因此,將復(fù)合酶酶解方案定為:調(diào)酵母懸液pH值為8.0,加入胰蛋白酶酶解2 h后再加入中性蛋白酶進(jìn)行復(fù)合酶解。

2.2.4 蛋白酶復(fù)合酶解最適條件

其它條件不變,在風(fēng)味蛋白酶加量分別為1.0%、1.5%、2.0%,加入方式分別為酶解開始時(shí)添加、酶解1 h時(shí)添加、酶解2 h時(shí)添加的情況下,3種蛋白酶對(duì)啤酒廢酵母進(jìn)行復(fù)合酶解后的氨基氮得率如圖7所示。

圖7 風(fēng)味蛋白酶加量和加入方式對(duì)氨基氮得率的影響

由圖7可知,在酶解2 h時(shí)加入1.5%的風(fēng)味蛋白酶,酵母抽提物的氨基氮得率達(dá)到最高,為2.64%。因此,將啤酒廢酵母的酶解方案確定為:配制14%的酵母懸液,調(diào)節(jié)pH值至8.0,加入2%的胰蛋白酶,置于45 ℃恒溫培養(yǎng)振蕩箱中酶解2 h后,再加入4%的中性蛋白酶與1%的風(fēng)味蛋白酶酶解4 h。

2.3 酵母抽提物的液相色譜分析(圖8)

圖8 酵母抽提物的液相色譜

由圖8可知,在確定的最適自溶條件和最適酶解條件下,以胰蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶等3種蛋白酶對(duì)啤酒廢酵母進(jìn)行復(fù)合酶解,發(fā)現(xiàn)酵母抽提物中天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸含量最高,丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸等中性氨基酸含量次之,賴氨酸與精氨酸等堿性氨基酸含量較高。

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)得到啤酒廢酵母最適自溶條件為:氯化鈉加量1%、pH值5.5、自溶時(shí)間32 h、自溶溫度45 ℃、懸液濃度14%,此時(shí)氨基氮得率達(dá)到最高4.23%;通過正交實(shí)驗(yàn)得到啤酒廢酵母最適酶解方案為:調(diào)節(jié)酵母懸液pH值至8.0,加入2%的胰蛋白酶,45 ℃酶解2 h后,再加入4%的中性蛋白酶與1%的風(fēng)味蛋白酶酶解4 h。先自溶后酶解的方式,可以更徹底地水解啤酒廢酵母細(xì)胞蛋白,提高氨基氮得率,為酵母抽提物的制備提供了新工藝,為工業(yè)化發(fā)展提供了新思路。