酵母專用型酶制劑的研究開發

徐婷婷,鄭元山,鄧必成,王巍杰,陳志穎

(1.唐山拓普生物科技有限公司,河北 唐山 063000;2.華北理工大學生命科學學院,河北 唐山 063210)

在我國,啤酒廢酵母除用作種子、蛋白飼料添加劑和顆粒混合飼料外,大多被直接丟棄,不僅造成資源浪費,而且破壞環境。而發達國家多是將啤酒廢酵母精加工作為下游工業原料[1-7]。目前,我國啤酒廢酵母精加工產業較為薄弱,若能利用酶解對啤酒廢酵母進行最大程度水解、開發酵母專用型酶制劑,為啤酒廢酵母下游工業提供充足原料,對充分利用啤酒廢酵母資源、保護環境、促進我國下游工業長足發展等具有重大意義[8]。

啤酒廢酵母不僅含有豐富的核酸、蛋白質、氨基酸、糖類以及磷脂、固醇、不飽和脂肪酸等脂類營養物質,還含有維生素、卵磷脂、谷胱甘肽等生物活性物質。這些物質的降解產物以及衍生物可以制成氨基酸制劑或核苷酸制劑等生物制劑,廣泛應用于生物、醫藥、保健品等領域[1]。雖然啤酒廢酵母價值極高,但由于其細胞壁是以β-葡聚糖構成,細胞內的蛋白質具有完整構象[9-12],酒花樹脂及單寧等成分吸附于酵母泥中導致廢酵母具有較強苦味[5],直接利用價值不大。

基于自溶對細胞壁的破壞、酶解對蛋白質構象的破壞,經過自溶與酶解的酵母抽提物的氨基氮含量、總氮含量均大幅提高[13]。但是如果僅僅依靠酵母的內源酶進行自溶,隨著自溶的進行,內源酶活性不斷降低,酵母細胞內的蛋白質很難被徹底水解,最終影響酵母抽提物的氨基氮含量與氨基氮得率[14-18]。為實現啤酒廢酵母資源利用的最大化,作者對啤酒廢酵母進行自溶后,再額外添加一定量的蛋白酶進行酶解來提高氨基氮含量與氨基氮得率,以實現最大程度水解,獲得氨基酸、核苷酸等營養物質。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

啤酒廢酵母,唐山拓普生物科技公司。

胰蛋白酶、中性蛋白酶,南寧龐博生物工程有限公司;風味蛋白酶、β-葡聚糖酶,河南萬邦化工科技有限公司;氯化鈉,天津標準科技有限公司;NaHCO3,天津致遠化學試劑有限公司;2 mol·L-1NaOH溶液、6 mol·L-1HCl溶液,自行配制。

120目篩網,浙江上虞金鼎標準篩具廠;JM-A6002型電子天平,諸暨超澤衡器設備有限公司;CF16RN型日立高速離心機,天美(中國)科學儀器有限公司;ZWY-2102C型恒溫培養振蕩箱,上海智城分析儀器制作有限公司;JA2003型分析天平,天津天馬衡基儀器有限公司;PHS-3C型精密pH儀,天津佑科儀器儀表有限公司;DZKW-4型水浴鍋,北京中興偉業儀器有限公司;D2004W型電動攪拌器,上海司樂儀器有限公司;UltiMate3000型高效液相色譜儀,賽默飛科技(中國)有限公司;SFG-02B型電熱恒溫干燥箱,黃石恒豐醫療器械有限公司。

1.2 啤酒廢酵母的預處理

取適量啤酒廢酵母,加入2倍體積的蒸餾水充分攪拌至均勻后使用120目篩網過篩,于20 ℃、4 500 r·min-1離心15 min,離心3次,得到洗脫酵母泥。將洗脫酵母泥配成10%懸液,加入0.5%的NaHCO3,攪勻后靜置30 min,于20 ℃、4 500 r·min-1離心30 min,得到純凈酵母泥。

1.3 啤酒廢酵母的自溶

取適量純凈酵母泥于燒杯中,用蒸餾水配制成一定濃度的酵母懸液,加入一定量的氯化鈉,用2 mol·L-1NaOH溶液與0.1 mol·L-1HCl溶液調節懸液pH值,在一定溫度下進行自溶;自溶結束后置于90 ℃水浴鍋中30 min以中止自溶,于20 ℃、4 500 r·min-1離心15 min,得到酵母蛋白水解液,測定酵母干重。

采用單因素實驗考察氯化鈉加量、pH值、自溶時間、自溶溫度、懸液濃度對氨基氮含量和氨基氮得率的影響,探究啤酒廢酵母自溶最適條件。

1.4 啤酒廢酵母的酶解

取適量酵母蛋白水解液于燒杯中,用蒸餾水配制成一定濃度的酵母蛋白懸液,調節pH值至適宜,按一定酶底比加入蛋白酶,置于45 ℃恒溫培養振蕩箱中酶解;酶解結束后置于90 ℃恒溫水浴鍋中20 min以中止酶解,于20 ℃、4 500 r·min-1離心15 min,收集上清液得到酵母抽提液,測定氨基氮含量,按下式計算氨基氮得率(Y,%):

式中:c為酵母抽提液中氨基氮含量,%;m1為酵母抽提物上清液質量,g;w為上清液中固形物含量,%;m2為酵母蛋白水解液中酵母干重,g。

以氨基氮得率為評價指標,以pH值、酶加量、酶解時間為考察因素,采用正交實驗探究啤酒廢酵母酶解最適條件。

1.5 蛋白酶酶解對酵母懸液pH值的影響

取一定量酵母蛋白水解液,用蒸餾水配制成14%酵母蛋白懸液,調節pH值并記錄;加入一定量蛋白酶,置于45 ℃恒溫培養振蕩箱中酶解,每隔1 h測定pH值并記錄。

1.6 蛋白酶復合酶解最適條件的探究

選擇風味蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶等3種蛋白酶對啤酒廢酵母進行復合酶解,探究最適酶解條件。其中風味蛋白酶的加入方式分別為酶解開始時添加、酶解1 h時添加、酶解2 h時添加,加量分別為1.0%、1.5%、2.0%。取一定量酵母蛋白水解液,用蒸餾水配制成14%酵母蛋白懸液,調節pH值至8.0,加入2%的胰蛋白酶,置于45 ℃恒溫培養振蕩箱中酶解2 h;再加入4%的中性蛋白酶,酶解4 h后置于90 ℃恒溫水浴鍋中20 min以中止酶解;然后于20 ℃、4 500 r·min-1離心15 min,收集上清液得到酵母抽提液,測定氨基氮含量,計算氨基氮得率,確定風味蛋白酶的加入方式和加量。

2 結果與討論

2.1 啤酒廢酵母最適自溶條件

2.1.1 氯化鈉加量對氨基氮含量和氨基氮得率的影響

在酵母懸液濃度為10%、pH值為5.0、自溶溫度為50 ℃、自溶時間為24 h的條件下,考察氯化鈉加量對氨基氮含量和氨基氮得率的影響,結果如圖1所示。

圖1 氯化鈉加量對氨基氮含量和氨基氮得率的影響

由圖1可知,隨著氯化鈉加量的增加,啤酒廢酵母自溶酶解后的氨基氮含量和氨基氮得率均先升高后降低,在氯化鈉加量為1%時,氨基氮得率達到最高2.3552%。因此,選擇最適氯化鈉加量為1%。

2.1.2 pH值對氨基氮含量和氨基氮得率的影響

在酵母懸液濃度為10%、氯化鈉加量為1%、自溶溫度為50 ℃、自溶時間為24 h的條件下,考察pH值對氨基氮含量和氨基氮得率的影響,結果如圖2所示。

圖2 pH值對氨基氮含量和氨基氮得率的影響

由圖2可知,在pH值為5.5時,啤酒廢酵母自溶酶解后的氨基氮含量和氨基氮得率均達到最高,其中氨基氮得率達到2.2865%。因此,選擇最適pH值為5.5。

2.1.3 自溶時間對氨基氮含量和氨基氮得率的影響

在酵母懸液濃度為10%、氯化鈉加量為1%、自溶溫度為50 ℃、pH值為5.5的條件下,考察自溶時間對氨基氮含量和氨基氮得率的影響,結果如圖3所示。

圖3 自溶時間對氨基氮含量和氨基氮得率的影響

由圖3可知,在自溶時間為32 h時,啤酒廢酵母自溶酶解后的氨基氮得率達到最高,為2.3433%。因此,選擇最適自溶時間為32 h。

2.1.4 自溶溫度對氨基氮含量和氨基氮得率的影響

在酵母懸液濃度為10%、氯化鈉加量為1%、自溶時間為24 h、pH值為5.5的條件下,考察自溶溫度對氨基氮含量和氨基氮得率的影響,結果如圖4所示。

圖4 自溶溫度對氨基氮含量和氨基氮得率的影響

由圖4可知,在自溶溫度為45 ℃時,啤酒廢酵母自溶酶解后的氨基氮得率達到最高,為2.2852%。因此,選擇最適自溶溫度為45 ℃。

2.1.5 懸液濃度對氨基氮含量和氨基氮得率的影響

在氯化鈉加量為1%、自溶溫度為50 ℃、自溶時間為24 h、pH值為5.5的條件下,考察懸液濃度對氨基氮含量和氨基氮得率的影響,結果如圖5所示。

由圖5可知,隨著懸液濃度的增加,啤酒廢酵母自溶酶解后的氨基氮含量和氨基氮得率均先升高后降低,在懸液濃度為14%時,氨基氮得率達到最高,為3.0946%。因此,選擇最適懸液濃度為14%。

綜上,在氯化鈉加量為1%、pH值為5.5、自溶時間為32 h、自溶溫度為45 ℃、懸液濃度為14%的最適自溶條件下,對啤酒廢酵母進行自溶酶解,氨基氮得率達到最高,為4.23%。

2.2 蛋白酶最適酶解條件

2.2.1 單一蛋白酶酶解最適條件

固定酶解溫度為45 ℃,分別以風味蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶酶解啤酒廢酵母,以氨基氮得率為評價指標,以pH值、酶加量、酶解時間為考察因素,通過L9(34)正交實驗探究單一蛋白酶最適酶解條件。正交實驗因素與水平見表1,結果與分析見表2。

表1 L9(34)正交實驗因素與水平

表2 L9(34)正交實驗結果與分析

由表2可知:風味蛋白酶在45 ℃下酶解啤酒廢酵母的最適條件為A11B11C12,即pH值6.0、酶加量1%、酶解時間5 h,在此條件下進行驗證實驗,氨基氮得率為1.3723%;中性蛋白酶在45 ℃下酶解啤酒廢酵母的最適條件為A22B22C21,即pH值7.0、酶加量4%、酶解時間4 h,在此條件下進行驗證實驗,氨基氮得率為1.9103%;胰蛋白酶在45 ℃下酶解啤酒廢酵母的最適條件為A32B31C33,即pH值8.0、酶加量2%、酶解時間6 h,在此條件下進行驗證實驗,氨基氮得率為1.6303%。

2.2.2 3種蛋白酶酶解啤酒廢酵母的能力比較

最適條件下,3種蛋白酶對啤酒廢酵母的酶解能力大小依次為:中性蛋白酶>胰蛋白酶>風味蛋白酶,中性蛋白酶的水解能力最強,氨基氮得率為1.9103%(圖6)。這可能是由于,酶解溫度45 ℃下,中性蛋白酶的活性最高,而胰蛋白酶和風味蛋白酶的活性相對較低。

圖6 最適條件下3種蛋白酶對啤酒廢酵母的酶解能力比較

2.2.3 蛋白酶酶解對酵母懸液pH值的影響(表3)

表3 蛋白酶酶解對酵母懸液pH值的影響

由表3可知,胰蛋白酶對啤酒廢酵母酶解2 h后,酵母懸液pH值為6.98;中性蛋白酶對啤酒廢酵母酶解2 h后,酵母懸液pH值為6.34。因此,將復合酶酶解方案定為:調酵母懸液pH值為8.0,加入胰蛋白酶酶解2 h后再加入中性蛋白酶進行復合酶解。

2.2.4 蛋白酶復合酶解最適條件

其它條件不變,在風味蛋白酶加量分別為1.0%、1.5%、2.0%,加入方式分別為酶解開始時添加、酶解1 h時添加、酶解2 h時添加的情況下,3種蛋白酶對啤酒廢酵母進行復合酶解后的氨基氮得率如圖7所示。

圖7 風味蛋白酶加量和加入方式對氨基氮得率的影響

由圖7可知,在酶解2 h時加入1.5%的風味蛋白酶,酵母抽提物的氨基氮得率達到最高,為2.64%。因此,將啤酒廢酵母的酶解方案確定為:配制14%的酵母懸液,調節pH值至8.0,加入2%的胰蛋白酶,置于45 ℃恒溫培養振蕩箱中酶解2 h后,再加入4%的中性蛋白酶與1%的風味蛋白酶酶解4 h。

2.3 酵母抽提物的液相色譜分析(圖8)

圖8 酵母抽提物的液相色譜

由圖8可知,在確定的最適自溶條件和最適酶解條件下,以胰蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶等3種蛋白酶對啤酒廢酵母進行復合酶解,發現酵母抽提物中天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸含量最高,丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸等中性氨基酸含量次之,賴氨酸與精氨酸等堿性氨基酸含量較高。

3 結論

通過單因素實驗得到啤酒廢酵母最適自溶條件為:氯化鈉加量1%、pH值5.5、自溶時間32 h、自溶溫度45 ℃、懸液濃度14%,此時氨基氮得率達到最高4.23%;通過正交實驗得到啤酒廢酵母最適酶解方案為:調節酵母懸液pH值至8.0,加入2%的胰蛋白酶,45 ℃酶解2 h后,再加入4%的中性蛋白酶與1%的風味蛋白酶酶解4 h。先自溶后酶解的方式,可以更徹底地水解啤酒廢酵母細胞蛋白,提高氨基氮得率,為酵母抽提物的制備提供了新工藝,為工業化發展提供了新思路。