磁性凝膠包埋固定仲醇脫氫酶研究

朱益慧,李大力

(南京理工大學生物工程系,江蘇 南京 210094)

酶作為重要的生物催化劑參與許多生物過程,由于其高特異性和高效率,已應用于化工[1-2]、食品[3-4]和生物醫(yī)學[5-6]等領域。游離酶因穩(wěn)定性低和難回收在應用中受到限制[7],而固定化酶彌補了游離酶缺陷,應用領域不斷拓寬[8-9]。酶固定化方法可分為物理法和化學法[10]。前者主要包括吸附和包埋,后者主要為共價連接和交聯(lián)。凝膠是一種親水交聯(lián)聚合物,很多研究者用凝膠來制備固定化酶。如Brahim等[11]將葡萄糖氧化酶固定在p(HEMA)-凝膠中,研究了其在填料床生物反應器中的動力學性質(zhì);盧釩[12]將海藻酸鈉凝膠微球包埋酶用于尿酸/葡萄糖的即時檢測;劉再冉[13]將漆酶和磁性生物炭共同包埋在聚乙二醇雙丙烯酸酯和聚乙二醇雙馬來酸單酯凝膠中用于高效去除水中偶氮染料;Zhao等[14]利用大孔聚丙烯酰胺凝膠固定辣根過氧化物酶。磁性凝膠固定化酶是指在交聯(lián)的親水性聚合物三維網(wǎng)絡中包埋磁性顆粒和酶,凝膠的磁性使其更易于從反應體系中回收,磁性凝膠固定化酶在生物催化工程中具有一定應用價值。

仲醇脫氫酶是一種氧化還原酶,作者所在課題組[15-16]在前期研究中提取獲得了一種依賴NAD+、以R-苯乙醇為底物的仲醇脫氫酶(PEDH),并將葡萄糖脫氫酶與此酶偶聯(lián)實現(xiàn)了R-苯乙醇的合成。作者在此用磁性凝膠包埋固定仲醇脫氫酶用于催化手性R-乙醇基吡啶的合成,通過掃描電子顯微鏡(SEM)和振動樣品磁強計(VSM)分別對其形貌和磁性進行表征,并對其酶學性質(zhì)進行研究。

1 實驗

1.1 試劑

磁性四氧化三鐵顆粒、丙烯酰胺、N,N-亞甲基雙丙烯酰胺、聚乙烯亞胺(PEI,分子量600),阿拉丁實業(yè)有限公司(中國上海);4-乙酰基吡啶,希恩思生化公司(中國天津);NADH,阿拉丁生物科技有限公司(中國上海);仲醇脫氫酶(PEDH),自行提取獲得[15]。

1.2 磁性凝膠包埋固定化仲醇脫氫酶的制備

在小燒杯中加入30%丙烯酰胺600 μL、5%聚乙烯亞胺250 μL、5%四氧化三鐵懸浮液1.05 mL、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺20 μL、1%過硫酸銨80 μL、仲醇脫氫酶液1 mL,攪拌均勻后按照每孔100 μL的量迅速添加到96孔板中;待凝膠形成后取出,在水中浸泡10 min去除未交聯(lián)的丙烯酰胺單體,洗凈,即得磁性凝膠包埋固定化仲醇脫氫酶(Gel-Fe3O4/PEI@PEDH,以下簡稱固定化酶),置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

同法制備不含酶、磁性顆粒、聚乙烯亞胺的純凝膠(Gel);不含酶、聚乙烯亞胺的磁性凝膠(Gel-Fe3O4);不含酶但摻入聚乙烯亞胺的磁性凝膠(Gel-Fe3O4/PEI)。

1.3 酶活測定

取2.7 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(50 mmol·L-1,pH值7.0)和100 μL 4-乙酰基吡啶(50 mmol·L-1),混合,于25 ℃預熱3 min,加入50 μL待測酶液和50 μL輔酶NADH(5 mmol·L-1),45 ℃反應5 min,測定340 nm處吸光度。用等量去離子水代替待測酶液作為對照組,根據(jù)吸光度的變化計算NADH反應后的減少量。已知340 nm處NADH的摩爾吸光系數(shù)(ε)為6.22 L·mmol-1·cm-1。

酶活定義為:在最適反應條件下,每分鐘消耗1 μmol NADH所用的酶量作為一個酶活單位(U)。

1.4 酶的最適反應pH值和最適反應溫度篩選

25 ℃下,當磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(50 mmol·L-1)pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0時,按1.3方法測定游離酶和固定化酶的活性,其中游離酶反應5 min,固定化酶反應20 min。以最高活性為100%計算相對活性,確定固定化酶的最適反應pH值。

同法,在磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(50 mmol·L-1)pH值為7.0,反應溫度分別為25 ℃、35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃時,測定游離酶和固定化酶的活性,確定固定化酶的最適反應溫度。

1.5 酶促反應動力學參數(shù)測定

采用雙倒數(shù)作圖法測定游離酶和固定化酶對4-乙酰基吡啶的酶促反應動力學參數(shù),包括米氏常數(shù)(Km)和最大反應速度(Vmax)。

1.6 酶的穩(wěn)定性研究

將酶分別在不同溫度(4 ℃、45 ℃、70 ℃)下靜置3 h,每隔1 h取樣,在最適反應條件下測定殘留活性(以初始活性的百分比計,初始活性為100%),考察酶的熱穩(wěn)定性。將酶分別在不同pH值(5.0、7.0、8.0)的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(50 mmol·L-1)中靜置3 d,每隔24 h取樣,在最適反應條件下測定殘留活性,考察酶的酸堿穩(wěn)定性。

1.7 固定化酶的重復使用性能研究

在最佳反應條件下,將固定化酶用于催化R-乙醇基吡啶的合成,20 min后取出,測定殘留活性;用去離子水沖洗3次后重復使用,測定殘留活性,重復使用5次,考察固定化酶的重復使用性能。

2 結果與討論

2.1 固定化酶的形貌

Gel、Gel-Fe3O4、Gel-Fe3O4/PEI、Gel-Fe3O4/PEI@PEDH的SEM照片如圖1所示。

圖1 Gel(a)、Gel-Fe3O4(b)、Gel-Fe3O4/PEI(c)、Gel-Fe3O4/PEI@PEDH(d)的SEM照片

由圖1可以看出,Gel表面較光滑(圖1a);加入Fe3O4后,可以看到磁性凝膠Gel-Fe3O4包埋的Fe3O4納米顆粒團簇(圖1b),這是Fe3O4顆粒聚集導致的[17];加入Fe3O4、PEI后,磁性凝膠Gel-Fe3O4/PEI包埋的Fe3O4納米顆粒的表面形態(tài)沒有變化(圖1c);當仲醇脫氫酶被包埋進凝膠后,凝膠結構沒有被破壞(圖1d)。實驗發(fā)現(xiàn),制備的Gel富有彈性,機械性能良好;而聚乙烯亞胺是一種水溶性高分子聚合物,可以靜電吸附帶負電荷的NAD+和NADH,在凝膠制備過程中摻入聚乙烯亞胺有利于NAD+和NADH在凝膠中富集,提高固定化酶的催化效率。

2.2 固定化酶的磁性

為改善傳質(zhì)效果,凝膠包埋固定化酶在使用時通常需剪切成小塊,但若凝膠過于細小時,會增加固定化酶的回收難度。因此,將磁性顆粒與酶共同包埋在凝膠中,以便使用外加磁場實現(xiàn)固定化酶的回收。

Fe3O4和Gel-Fe3O4/PEI@PEDH的磁性分析結果如圖2所示。

圖2 Fe3O4和Gel-Fe3O4/PEI@PEDH的磁性分析結果

由圖2可知,Fe3O4磁性顆粒的飽和磁化強度為76.85 emu·g-1;用凝膠包埋后,Gel-Fe3O4/PEI@PEDH磁性凝膠的飽和磁化強度降至6.56 emu·g-1,但仍然可以利用外加磁場自反應體系回收。

2.3 固定化酶的最適反應pH值和最適反應溫度

反應pH值和反應溫度對游離酶和固定化酶的活性影響如圖3所示。

圖3 反應pH值(a)和反應溫度(b)對游離酶和固定化酶的活性影響

由圖3a可知,游離酶的最適反應pH值為6.0,固定化酶的最適反應pH值為7.0;與游離酶相比,固定化酶在偏堿性環(huán)境能保持較高的活性。由圖3b可知,游離酶在25～65 ℃范圍內(nèi)具有較高活性;固定化酶的活性則隨著溫度的升高先升高后降低,在45 ℃時的相對活性最高,65 ℃時相對活性急速下降。

2.4 酶促反應動力學參數(shù)

游離酶和固定化酶利用輔酶NADH還原4-乙酰基吡啶生成4-乙醇基吡啶的反應動力學符合米氏方程。采用雙倒數(shù)作圖法計算得到游離酶對底物4-乙酰基吡啶的米氏常數(shù)Km為0.110 mmol·L-1、最大反應速率Vmax為26.178 μmol·L-1·min-1;固定化酶對底物4-乙酰基吡啶的米氏常數(shù)Km為0.156 mmol·L-1、最大反應速率Vmax為1.523 μmol·L-1·min-1,遠低于游離酶,其原因可能是反應中的傳質(zhì)限制。

2.5 固定化酶的熱穩(wěn)定性

酶的熱穩(wěn)定性是評價酶工業(yè)應用價值的重要因素。游離酶和固定化酶在4 ℃、45 ℃、70 ℃下分別靜置1 h、2 h、3 h的殘留活性如圖4所示。

圖4 游離酶和固定化酶的熱穩(wěn)定性

由圖4可知,固定化酶在4 ℃和45 ℃下靜置3 h時,活性幾乎沒有變化,殘留活性在90%左右,在70 ℃靜置3 h后的殘留活性在40%左右;而游離酶在70 ℃靜置1 h就喪失全部活性。因此,將仲醇脫氫酶包埋固定在磁性凝膠中可以增強其熱穩(wěn)定性。

2.6 固定化酶的酸堿穩(wěn)定性

游離酶和固定化酶在不同pH值(5.0、7.0、8.0)的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(50 mmol·L-1)中靜置3 d的殘留活性如圖5所示。

圖5 游離酶和固定化酶的酸堿穩(wěn)定性

由圖5可知,游離酶和固定化酶在pH值為7.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液中靜置3 d后均能保持高活性,具有較高的酸堿穩(wěn)定性。

2.7 固定化酶的重復使用性能

酶的可重復使用性在工業(yè)應用中起著重要作用,良好的重復使用性能可極大降低生產(chǎn)成本。固定化酶重復使用5次后的殘留活性如圖6所示。

圖6 固定化酶的重復使用性能

由圖6可知,固定化酶重復使用5次后的殘留活性為41%。可能是因為重復反應、重復清洗使得酶泄露和酶蛋白變性,從而導致酶活性降低。

3 結論

通過原位共聚法制備了磁性凝膠包埋固定化仲醇脫氫酶,用于催化手性R-乙醇基吡啶的合成。結果表明,與游離仲醇脫氫酶相比,固定化仲醇脫氫酶的最適反應溫度為45 ℃,最適反應pH值為7.0,且具有較高的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性;由于具有磁性,固定化仲醇脫氫酶易于回收,重復使用性能良好,重復使用5次后的殘留活性達到41%。