鏈霉菌FJS31-2 abxR2基因克隆表達及蛋白純化

李澤鑫,王蘭林,栗午娟,楊 逸,張悅萌,高佩舒,田紅英,岳昌武

(延安大學基礎醫學院 延安市微生物藥物創新及轉化重點實驗室,陜西 延安 716000)

放線菌是一類革蘭氏陽性細菌,與人類生產生活密切相關,抗生素大部分是由放線菌產生的[1-4]。鏈霉菌(Streptomycessp.)FJS31-2屬于放線菌,其基因組全長約11.6 Mb。作者所在課題組[5]從鏈霉菌FJS31-2發酵產物中發現了鹵化PKS Ⅱ型聚酮類新型抗生素Zunyimycins。Zunyimycins具有很高的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性[6],臨床應用潛力巨大;同其它多組分抗生素一樣,Zunyimycins的多組分生物合成也可能受到復雜嚴格的調控。比較不同來源的產Zunyimycins或其結構類似物菌株的abx基因簇,發現它們成對存在的調控蛋白AbxR1和AbxR2的編碼基因高度保守且讀框方向一致(氨基酸同源性高達90%)。GenBank數據庫在線同源比對分析發現調控基因abxR2可能編碼AfsR/SARP(Streptomycesantibiotic regulatory protein)家族調控蛋白,而SARP家族調控因子通常通過直接激活鏈霉菌來源天然活性產物的合成基因簇或其它調控基因來發揮其功能[7]。如Yin等[8]在龜裂鏈霉菌(S.rimosus)中過表達簇內調控基因otcR,使得土霉素產量大大提高;Chen等[9]在殺真菌素鏈霉菌(Streptomycesfungicidicus)中過表達調控基因orf22,使得恩拉霉素產量得以提高。表明調控基因abxR2可能參與了Zunyimycins的正向調控。因此,作者對調控基因abxR2進行擴增后克隆至pET32a質粒上構建重組質粒pET32a-abxR2[10],利用IPTG誘導表達得到AbxR2重組蛋白,并對其進行純化,以期為研究AbxR2重組蛋白及提高Zunyimycins產量提供新策略,促進Zunyimycins的進一步開發和轉化[11-12]。

1 實驗

1.1 材料與試劑

鏈霉菌(Streptomycessp.)FJS31-2,從貴州省梵凈山10～20 cm深地表土壤中分離得到,保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心(菌保號:CGMCC 4.7321)[13];pET32a表達質粒、大腸埃希菌(Escherichiacoli)Rosetta(DE3)感受態細胞,博邁德(北京)基因技術有限公司。

限制性內切酶NcoⅠ和XhoⅠ,Thermo Fisher Scientific公司;DNA凝膠純化回收試劑盒、高純度質粒小提試劑盒,博邁德(北京)基因技術有限公司;IPTG、Tris、Glycine、SDS、酵母粉、氯化鈉、瓊脂粉,北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成

參照GenBank數據庫中鏈霉菌FJS31-2的abxR2基因序列,應用Primer 5.0軟件設計abxR2的引物:上游引物:5′-GATAGAGTCCGCAAGGGGCT-3′;下游引物:5′-CGAAAGAGGGGCGAACGACCA-3′,擴增片段長度1 911 bp。引物合成及測序由博邁德(北京)基因技術有限公司完成。

1.2.2 目的基因的擴增與測序

以鏈霉菌FJS31-2基因組為模板,擴增目的基因。PCR反應條件:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸1.5 min,共30個循環;72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用DNA凝膠純化回收試劑盒對PCR產物進行回收純化。abxR2基因測序由博邁德(北京) 基因技術有限公司完成。

根據測序結果,使用NCBI數據庫中Blast程序對abxR2基因的蛋白質氨基酸序列進行序列同源性比對,從GenBank數據庫中得到與abxR2同源性較高且已證明具有生物活性功能的調控基因蛋白質氨基酸序列,采用MEGA 5.1軟件進行聚類分析,構建系統發育樹[14-15]。

1.2.3 重組質粒pET32a-abxR2的構建與鑒定

使用NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切pET32a質粒,回收純化目的片段。將擴增的abxR2片段通過T4 DNA連接酶連接至pET32a質粒上,構建重組質粒pET32a-abxR2,并進行酶切鑒定,送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

1.2.4 AbxR2重組蛋白的誘導表達

將序列測定正確的重組質粒pET32a-abxR2轉化至大腸埃希菌Rosetta(DE3)感受態細胞中,隨機挑取單個菌落至2 mL LB液體培養基(含50 mg·L-1氨芐霉素)中,37 ℃、150 r·min-1培養過夜,然后移至15 mL含氨芐霉素的LB液體培養基中擴大培養;待菌液OD600值為0.6～0.8,按1∶1000的比例加入1.0 mmol·L-1IPTG,28 ℃、110 r·min-1誘導4 h;取誘導后的菌液1 mL,于12 000 r·min-1離心2 min;收集菌體,用500 μL高純度質粒小提試劑盒P1溶液(25 mmol·L-1Tris-HCl,10 mmol·L-1EDTA,50 mmol·L-1glucose)洗滌,加入30 μL 5×loading buffer混勻,95 ℃煮沸10 min,2 000 r·min-1離心2 min,以10%的分離膠進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.5 AbxR2重組蛋白的純化

將誘導后的菌液用500 μL的P1溶液洗滌2次后,再用其重懸菌體,300 W超聲(工作4 s,間歇4 s,共15 min)裂解;將超聲破碎后的菌液離心,分別收集上清和沉淀;向上清中加入2倍體積的冰丙酮溶液(-20 ℃預冷);因為目的蛋白以包涵體形式在大腸埃希菌中表達,收集包涵體沉淀,進行AbxR2蛋白純化:先依次用1 mol·L-1、2 mol·L-1、4 mol·L-1尿素溶液洗滌包涵體,去除其中部分雜質;然后用8 mol·L-1尿素溶解包涵體,得到較為粗制的包涵體;再采用逐步稀釋復性法對粗制包涵體進行復性,向溶液中緩慢加入1 mol·L-1低濃度尿素至溶液中尿素濃度降至1.5 mol·L-1,使得包涵體恢復至正確的空間結構。

2 結果與討論

2.1 關鍵基因系統進化分析

對abxR2基因擴增得到1 911 bp的PCR產物,測序正確后,使用NCBI數據庫中的Blast程序進行序列同源性比對,結果如圖1所示。

圖1 鏈霉菌FJS31-2 AbxR2與其它菌株調控因子基因系統進化分析

從圖1可以看出,鏈霉菌FJS31-2 AbxR2的氨基酸序列與鏈霉菌屬Streptomycesrimosussubsp.rimosusOtcR的同源性為41%、與StreptomycestsukubensisFkbN的同源性為38%、與StreptomycesnatalensisPimR的同源性為36%,與StreptomycescoelicolorA3(2)redD的同源性為34%、與StreptomycesfilamentosusDptR2的同源性為44%,與Streptomycessp.Tu 4128BagⅠ的同源性為33%。

2.2 重組質粒pET32a-abxR2的構建與鑒定

將ZunyimycinsabxR2基因片段通過T4 DNA連接酶連接至pET32a質粒上,獲得重組質粒pET32a-abxR2。然后對pET32a-abxR2進行NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定,發現abxR2基因片段成功克隆到pET32a質粒上(圖2)。

M.10000 bp DNA marker 1.質粒DNA 2.pET32a-abxR2雙酶切片段

2.3 AbxR2重組蛋白的誘導表達

28 ℃下,用1.0 mmol·L-1IPTG誘導AbxR2重組蛋白表達,誘導后的菌液經超聲處理后,離心,收集沉淀,進行SDS-PAGE電泳檢測,結果如圖3所示。

M.標準蛋白marker 1.未誘導表達 2,3.IPTG誘導表達(28 ℃、110 r·min-1、菌液OD600值為0.6、1.0 mmol·L-1IPTG誘導4 h)

從圖3可以看出,表達的AbxR2蛋白為包涵體蛋白,在約100 kDa處出現目的條帶,與預期蛋白大小一致。因此,確定最優誘導條件為:菌液OD600值為0.6時,用1.0 mmol·L-1IPTG于28 ℃、110 r·min-1誘導4 h。

2.4 AbxR2重組蛋白的純化

首先在低溫下,依次用1 mol·L-1、2 mol·L-1、4 mol·L-1尿素溶液洗滌AbxR2重組蛋白包涵體,通過逐步稀釋復性法對包涵體進行復性,降低尿素濃度,使蛋白正確折疊,達到純化目的。其SDS-PAGE電泳圖譜如圖4所示。

M.標準蛋白marker 1.未誘導表達的AbxR2重組蛋白包涵體2～5.IPTG誘導表達(28 ℃、110 r·min-1、菌液OD600值為0.6、1.0 mmol·L-1IPTG誘導4 h)的AbxR2重組蛋白包涵體

從圖4可以看出,在100 kDa處出現了1條與預測大小一致的特異蛋白條帶。

2.5 討論

進一步分別對調控蛋白AbxR1、AbxR2的功能域進行分析發現,AbxR2的N末端相對保守,具有AfsR調控蛋白家族常見的HTH、BTAD、NB-ARC等保守功能域,但和放線菌來源的、不負責調控Zunyimycins類似物合成的AfsR蛋白相比,其C末端和地細菌類群(Terrabacteriagroup)相似,C末端自603個氨基酸殘基處缺失,沒有TPR功能域。由于TPR功能域介導了蛋白質之間的相互作用,這意味著Zunyimycins生物合成基因簇的調控模式可能不同于傳統的放線菌AfsR調控。提示Zunyimycins的生物合成調控可能有其獨特之處,可進行深入研究。

由于大腸桿菌生長快、表達量高,容易培養,是原核表達系統高效表達的優選,因此,本研究在成功構建了重組質粒pET32a-abxR2后,選擇大腸埃希菌Rosetta(DE3)作為表達宿主菌[16-17]進行IPTG誘導表達,發現在菌液OD600值為0.6時,用1.0 mmol·L-1IPTG于28 ℃、110 r·min-1誘導4 h,AbxR2重組蛋白的表達效果較好[18]。

通過SDS-PAGE分析,確定AbxR2蛋白以包涵體形式存在,并對包涵體進行純化。為研究AbxR2蛋白、培育Zunyimycins高產菌株提供了理論依據和物質基礎。

3 結論

利用原核表達系統獲得鏈霉菌FJS31-2 AbxR2重組蛋白,并進行蛋白純化。通過PCR擴增abxR2基因,將擴增產物克隆至pET32a質粒上,構建重組質粒pET32a-abxR2;將重組質粒轉化至大腸埃希菌Rosetta(DE3)感受態細胞中,在菌液OD600值為0.6時,用1.0 mmol·L-1IPTG于28 ℃、110 r·min-1誘導4 h,AbxR2重組蛋白的表達效果較好;采用尿素洗滌方式純化AbxR2重組蛋白,得到單一特異蛋白條帶。為研究AbxR2蛋白的結構和功能及提高Zunyimycins產量奠定了基礎。