支氣管肺泡灌洗液宏基因組二代測序在兒童難治性肺炎診治中的應用

馮榮光 周麗巖 竇蕊 周雪原 王莉榮 韓麗紅 王育民

（1.內蒙古自治區婦幼保健院兒內科，內蒙古呼和浩特 010020；2.內蒙古醫科大學第二附屬醫院超聲醫學中心，內蒙古呼和浩特 010010）

難治性肺炎（refractory pneumonia, RTP）是指經過積極抗感染治療后沒有明顯改善甚至病情惡化，并且預后較差的嚴重肺炎［1］，臨床表現多樣，易發生胸腔積液、肺膿腫、肺壞死及肺不張等嚴重并發癥。2019 年《中國兒童難治性肺炎呼吸內鏡介入診療專家共識》［2］中提出，療效不佳、吸收緩慢甚至久治不愈以及出現嚴重并發癥的肺炎可以被納入RTP 的范疇。近年來由于抗生素濫用、感染病原體的進化和變異、新型病原體不斷產生、混合感染率以及細菌耐藥性持續增加等多種因素的作用，RTP發生率明顯升高，同時因疑難危重感染所導致的膿毒血癥、呼吸衰竭等造成兒童患者病死率較高，RTP成為兒童呼吸系統疾病診治中的難點。宏基因組二代測序（metagenomic nextgeneration sequencing, mNGS）是20 世紀發展起來的新一代檢測技術，利用幾乎所有病原體都含有DNA 或RNA 的共性，直接從臨床標本中提取微生物核酸進行大規模基因組測序，將樣本中的微生物和宿主遺傳物質進行綜合分析［3］，并與已知微生物數據庫對比從而得出感染病原體的種類及序列數。mNGS包含了標本中所有微生物的基因信息總和，對新發及臨床未知的病原體檢測具有重要意義［4］，彌補了傳統檢測法的不足，近年來在成人和兒童感染性疾病中逐漸得到應用［5-6］。本研究旨在探討mNGS 與傳統病原學檢測方法對于兒童RTP病原學診斷的臨床價值，盡早明確病原體，從而更精準地指導臨床用藥。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性選取2020年1月—2023年3月內蒙古自治區婦幼保健院兒內科收治的RTP住院患兒160例為研究對象，結合患兒的病情及家屬對mNGS的檢測意愿分為mNGS 組（80 例）和傳統檢測組（80例）。納入標準：（1）符合《中國兒童難治性肺炎呼吸內鏡介入診療專家共識》［2］中RTP 的診斷標準；（2）年齡28 d至14歲；（3）久治不愈的肺炎，即抗感染治療＞2周，經積極治療無效，臨床癥狀、體征及影像學無明顯改善或加重；（4）吸收緩慢的肺炎，即在使用抗感染治療后癥狀、體征有好轉，但2周后復查影像學病灶吸收＜50%，遷延不愈者；（5）重癥肺炎，即出現嚴重通氣和/或換氣功能障礙或肺內外并發癥。排除標準：（1）病歷資料不全者；（2）嚴重的肺部及全身基礎疾病者；（3）非感染性肺炎者；（4）存在支氣管鏡檢查禁忌證者。

本研究通過內蒙古自治區婦幼保健院倫理委員會批準（［2021］倫審第［079-2］號），患兒監護人同意入組并簽署知情同意書。

1.2 病原檢測

兩組患兒入院后均予完善炎癥指標檢測及傳統病原學檢測。傳統病原學檢測包括：微生物培養（吸痰管采集痰液標本）、呼吸道病原核酸檢測、血清學檢測（支原體、結核、真菌）。mNGS組完善支氣管鏡檢查后留取支氣管肺泡灌洗液（bronchial alveolar lavage fluid, BALF）標本同時送檢mNGS和微生物培養。

mNGS 使用QIAamp?UCP 病原體DNA 試劑盒（德國，Qiagen）從所有樣品中提取DNA；使用Benzonase（德國，Qiagen）和Tween20（德國默克，Sigma）去除部分人源DNA。使用QIAamp?病毒RNA 試劑盒（德國，Qiagen）提取總RNA，用Ripo-Zero rRNA Removal Kit（美國，Illumina）去除核糖體RNA，并利用逆轉錄酶和脫氧核糖核苷三磷酸（美國，Thermo Fisher）生成cDNA。使用Nextera XT DNA文庫制備試劑盒（美國，Illumina）構建DNA和cDNA樣本文庫。然后將構建好的文庫加載到Illumina Nextseq CN500 測序儀上進行測序。刪除重復、短的和低質量序列數，使用Burrows-Wheeler Aligner 軟件將測序數據中人源序列數據人類參考基因組（hg38）比對并進行識別和排除。從美國國家生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information）核苷酸和基因組數據庫中選擇具有代表性的微生物基因組作為數據庫搭建基礎（細菌、病毒、真菌、寄生蟲、支原體、衣原體等），獲取所有可能感染的病原微生物種類及相對豐度等數據。根據患兒其他病原體檢測結果、臨床癥狀及藥物治療反應，綜合評估mNGS報告中的病原微生物是否與該患兒臨床癥狀相關。

1.3 療效判斷標準

根據患兒臨床癥狀的改善、白細胞、C反應蛋白等炎癥指標的恢復程度以及復查胸部影像學的吸收情況評價臨床療效。顯效：臨床癥狀消失，炎癥指標恢復正常，影像學提示肺實變好轉面積≥80%病變區域；有效：臨床癥狀消失，炎癥指標恢復正常，影像學提示肺實變好轉面積≥50%病變區域；無效：臨床癥狀及體征改善不明顯，肺實變好轉面積≤30%病變區域［7］。總體有效=顯效+有效。

1.4 統計學分析

采用SPSS 25.0 軟件進行統計學分析。不符合正態分布的計量資料以中位數（四分位數間距）［M（Q1，Q3）］ 表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用卡方檢驗，采用McNemar 檢驗分析mNGS 檢測與傳統病原學檢測病原學陽性率的差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患兒基本資料比較

mNGS組和傳統檢測組患兒年齡、性別、基礎疾病、早產或低出生體重、先天性心臟病、氣道或肺結構異常方面比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組患兒基本資料比較

2.2 兩組病原體檢測情況

mNGS組檢出病原體53種，共199株，其中細菌76株，病毒83株，真菌18株，特殊病原體（包括支原體、衣原體、結核分枝桿菌）22株。傳統檢測組檢出病原體26 種，共98 株，包括細菌52 株，病毒21株，真菌3株，特殊病原體22株。見表2。

表2 兩組病原體檢出情況 ［株（%）］

mNGS組陽性74例（92%），其中混合感染比例為61%（49/80），以細菌+病毒感染為主（21%，17/80）；單一感染比例為31%（25/80），以特殊病原體為主（14%，11/80）。傳統檢測組陽性65 例（81%），其中混合感染比例為31%（25/80），以細菌+特殊病原體為主（10%，8/80）；單一感染比例為50% （40/80），以細菌為主（30%，24/80）。見表3。

表3 兩組單一感染和混合感染情況比較 ［例（%）］

mNGS 組患兒支氣管肺泡灌洗液同時送檢mNGS 及微生物培養法，mNGS 陽性率為92%（74/80），高于微生物培養法陽性率（58%，46/80），差異有統計學意義（P＜0.001）。若以微生物培養法陽性作為病原學診斷的“金標準”，mNGS 診斷靈敏度為98%，特異度為15%，陽性預測值為61%，陰性預測值為83%。見表4。

表4 mNGS組患兒mNGS與微生物培養法陽性結果比較（例）

2.3 兩組治療情況比較

mNGS組總體有效率高于傳統檢測組，住院期間并發癥發生率低于傳統檢測組（P＜0.05），見表5。

表5 兩組患兒治療情況比較 ［例（%）］

mNGS組中有68例患兒根據mNGS結果進行了治療調整，調整后總體有效率為96%（65/68），見表6。

表6 68例mNGS組患兒調整藥物方案情況 ［例（%）］

3 討論

RTP是兒童呼吸系統疾病中導致患兒死亡的主要原因，發生機制中感染占主要因素。目前臨床上病原檢測以微生物培養法、呼吸道病原核酸檢測等最為廣泛，但因培養時間長、易受上呼吸道定植菌污染及抗生素濫用等特性［8］，降低了病原體檢出率，延誤最佳治療時機。而mNGS是以群落為背景研究微生物種群的檢測技術，通過提取微生物的遺傳物質來研究環境中的微生物多樣性，相比于微生物培養法及PCR 核酸擴增技術等具有測序迅速、覆蓋廣、靈敏度高、無偏移的特點［9］，且臨床藥物包括抗生素和糖皮質激素的應用對其結果產生的影響較小［10］，近年來逐漸應用于呼吸系統等多種臨床感染性疾病中。

有研究認為相對于傳統病原學檢測，mNGS可顯著提高兒童下呼吸道感染性疾病的病原體檢出率。本研究中mNGS 組共檢出53 種病原體，而傳統檢測組應用了微生物培養、呼吸道病原核酸檢測、血清學檢測3 種傳統檢測方法共檢出26 種病原體，與何邦立等［11］、唐青等［12］的研究結果相近。將mNGS 組患兒的BALF 標本同時進行mNGS和微生物培養，mNGS陽性率為92%，顯著高于微生物培養法陽性率58%，與既往報道結果［13-15］接近。mNGS 診斷靈敏度為98%，特異度為15%，陽性預測值為61%，陰性預測值為83%，與Miao等［16］的研究相差較大，可能與本研究樣本量較小有關。既往研究表明，RTP 患兒通常存在混合感染［17］。本研究對比兩組患兒病原體檢出情況，mNGS結果多為混合感染，而傳統檢測大多只能檢出單種病原體，這與mNGS 的測序優勢有關。mNGS可以發現如星座鏈球菌、分枝桿菌、真菌等較多傳統檢測不能檢出的罕見微生物信息，對于混合感染患兒的病原學診斷率較高。然而本研究也發現，部分患兒的mNGS結果與其臨床表現并不完全相符。有文獻指出，mNGS雖覆蓋率廣泛，但其將呼吸道內的定植菌及自身的某些宿主基因一并涵蓋其中，這也造成了對結果解讀的偏差，導致該項技術的應用存在較大爭議［18］。本研究兩組真菌類檢出情況差異較為明顯，在臨床中采用傳統方法確診真菌感染通常較為困難，但近年來肺部真菌感染患兒較以往增加，尤其是在患有先天性心臟病、氣道發育不良等基礎疾病的患兒中真菌陽性率顯著高于無基礎疾病患兒，并且免疫系統受損患兒肺部感染真菌后通常病情進展較快，病死率較高［19］。mNGS相對于傳統檢測可以顯著提高真菌類病原的檢出率，縮短檢測時間，幫助此類患兒盡早明確感染原因，避免延誤治療［20］。

明確感染病原體的最終目的是輔助RTP 的病因治療，本研究mNGS組中68例患兒根據mNGS結果調整了治療，其中65例調整后顯效或有效，3例無效（1例放棄治療，1例轉院，1例存在嚴重后遺癥），治療總體有效率為96%，與崔鳳婷等［21］、鈕月英等［22］的研究一致。本研究發現mNGS 組總體有效率顯著高于傳統檢測組，且在住院期間的并發癥發生率顯著低于傳統檢測組，提示mNGS相對于傳統檢測法可以早期發現感染病原體，幫助臨床醫師精確指導治療，減少并發癥，縮短病程，改善預后。

但目前該技術仍存在很多不足，包括對數據庫的選擇沒有全面統一的參考，對報告結果的解讀缺乏標準的指南或共識，以及宿主背景核酸的干擾等，導致其準確性和可信性尚存在一定爭議，且目前該項目的檢查費用相對較高，亦導致其在臨床中的應用受到很大的限制。

總之，mNGS可在呼吸系統感染性疾病尤其是RTP中發揮不可替代的作用，其對于呼吸道感染性疑難重癥的病原學診斷，尤其對于新發和臨床未知的病原體的檢測具有重要意義。能夠有效幫助兒科醫生盡早識別病原體，使患兒得到精準治療，提高治愈率。對于難以明確感染微生物以及存在基礎疾病的免疫系統受損RTP 患兒，應盡早完善mNGS查找病原，早期診斷，早期治療，減少并發癥和后遺癥，降低病死率。但對于mNGS結果的解讀需結合具體臨床資料判定。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。