一心維納斯蝴蝶蘭花香物質(zhì)合成相關(guān)基因RT-qPCR內(nèi)參基因篩選

章楊婷，張燕萍，黃靜妍，王文君，童 妍，趙 凱，周育真*

一心維納斯蝴蝶蘭花香物質(zhì)合成相關(guān)基因RT-qPCR內(nèi)參基因篩選

章楊婷1，張燕萍1，黃靜妍1，王文君1，童 妍1，趙 凱2，周育真1*

1. 福建農(nóng)林大學(xué)風(fēng)景園林與藝術(shù)學(xué)院/蘭科植物保護(hù)與利用國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350002；2. 福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州 350117

一心維納斯蝴蝶蘭（I-Hsin Venus）花型優(yōu)雅、花期持久、花香馥郁，是優(yōu)良的香花品種，具有較高的園林觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。為篩選適用于一心維納斯蝴蝶蘭花香物質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因，本研究以一心維納斯蝴蝶蘭不同花期（中蕾期、初開期、盛開前期、盛開中期、盛開后期、衰敗期）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，選取了、、、、、、和共8個(gè)管家基因作為候選內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)候選內(nèi)參基因在花朵不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，并利用geNorm、NormFinder、BestKeeper三個(gè)內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析軟件對(duì)候選內(nèi)參基因進(jìn)行分析。綜合分析結(jié)果表明，的穩(wěn)定性最高，可作為一心維納斯蝴蝶蘭相關(guān)基因表達(dá)分析的最適內(nèi)參基因。

一心維納斯蝴蝶蘭；內(nèi)參基因；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；表達(dá)穩(wěn)定性

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（quantitative real-time PCR, RT-qPCR）是指在PCR反應(yīng)體系中添加熒光基團(tuán)（探針或者染料），在PCR擴(kuò)增進(jìn)程中借助熒光信號(hào)的積累進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[1]。RT-qPCR目前已普遍應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域[2]。因RT-qPCR的特異性強(qiáng)、無污染性和準(zhǔn)確性高，其被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)驗(yàn)證方面的研究[3]。但是，RNA的質(zhì)量或試驗(yàn)操作的偏差等因素會(huì)影響最終結(jié)果的精準(zhǔn)度[4]。使用內(nèi)參基因?qū)Y(jié)果進(jìn)行校對(duì)并糾正，可以大大降低目標(biāo)基因與數(shù)據(jù)表達(dá)水平之間的差異，從而提高試驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

內(nèi)參基因通常選用管家基因，這類基因以穩(wěn)定表達(dá)著稱，但目前并沒有哪個(gè)內(nèi)參基因能確保在所有情況下都能穩(wěn)定表達(dá)[5]。理想的內(nèi)參基因在不同條件不同組織中均會(huì)穩(wěn)定表達(dá)，而試驗(yàn)研究中內(nèi)參基因的恒定表達(dá)僅僅是在一定的試驗(yàn)環(huán)境下和一定的組織中才會(huì)實(shí)現(xiàn)[6]。在特定試驗(yàn)條件下或給特定組織或品種進(jìn)行RT-qPCR表達(dá)穩(wěn)定分析前，應(yīng)該選擇合適的內(nèi)參基因。目前常用的內(nèi)參基因主要包括肌動(dòng)蛋白基因（）、18S核糖體RNA（）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（）、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因（）、多聚泛素酶基因（）、α微管和β微管蛋白基因（、）以及親環(huán)蛋白基因（）等。

蝴蝶蘭（spp.）因花朵形態(tài)像蝴蝶而得名，又稱蝶蘭，其花色艷麗，花姿嬌俏，花期長(zhǎng)，廣泛分布于中國(guó)、泰國(guó)、菲律賓、馬來西亞等地，屬熱帶亞熱帶氣生蘭，被稱為“蘭花皇后”。蝴蝶蘭的原生種數(shù)量少，市場(chǎng)上廣泛栽培與應(yīng)用的品種部分是雜交種，在花卉市場(chǎng)上頗受歡迎[7]。隨著市場(chǎng)的不斷變化和消費(fèi)者需求的多樣化，品種的不斷創(chuàng)新及改良是必要手段，蝴蝶蘭香花品種的培育是目前重要的育種目標(biāo)之一。一心維納斯蝴蝶蘭（I-Hsin Venus）是以金龍蝴蝶蘭（Dragon’s Gold）和I-Hsin Viola Tria為親本雜交選育而成的香花品種，具有花香濃郁、花色絢麗多彩、花型輕盈、花期持久等特性，是研究蝴蝶蘭花香的理想材料。前期研究表明，一心維納斯蝴蝶蘭隨著花朵開放，花香物質(zhì)逐漸增加而產(chǎn)生花香，其香氣成分主要為萜類物質(zhì)，且成分復(fù)雜。目前還需對(duì)其花香合成與釋放相關(guān)的分子機(jī)制進(jìn)行更深入地挖掘。

本研究基于蝴蝶蘭一心維納斯品種的花朵轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出、、、、、、和這8個(gè)候選內(nèi)參基因，分別對(duì)其進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，并通過RT-qPCR得到在蝴蝶蘭6個(gè)不同花期中的表達(dá)量。利用軟件評(píng)估內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，篩選出理想的內(nèi)參基因。為后期開展一心維納斯蝴蝶蘭花香物質(zhì)合成和釋放相關(guān)功能基因研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以福建農(nóng)林大學(xué)森林蘭苑溫室大棚中的蝴蝶蘭一心維納斯品種的花朵為材料，于2021年3—6月花朵集中開放時(shí)期的10：00—14：00采集，采集包括中蕾期（ZL）、初開期（CK，0 d）、盛開前期（S7，7 d）、盛開中期（S15，15 d）、盛開后期（S30，30 d）、衰敗期（SB，45 d及以上）6個(gè)時(shí)期，設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采集后的樣品迅速放入液氮中，迅速轉(zhuǎn)移至?80 ℃冰箱里備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA合成 使用RNA提取試劑盒（Plant RNA Kit, OMEGA）提取一心維納斯蝴蝶蘭不同花期的總RNA。使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取RNA的完整性，超微量紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒，TaKaRa）將檢測(cè)合格的樣品RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將得到的cDNA樣品放于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 候選內(nèi)參基因篩選 根據(jù)已測(cè)序完成的一心維納斯蝴蝶蘭不同花期的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（未發(fā)表），F(xiàn)PKM值為92.61以上并且各基因樣品表達(dá)量較為一致的情況下[8]，通過網(wǎng)站（http://orchi-db-a-se.itps.ncku.edu.tw/）[9]查找小蘭嶼蝴蝶蘭（）基因組數(shù)據(jù)進(jìn)入NCBI的Blast P程序進(jìn)行同源基因比對(duì)，初步篩選出8個(gè)內(nèi)參基因（表1）。

1.2.3 RT-qPCR 通過Primer 3（https://primer3.ut. ee/）在線網(wǎng)站和DNAMAN 9.0軟件，基于已知的內(nèi)參基因的核苷酸序列來設(shè)計(jì)引物（表2），引物由福州白鯨生物科技有限公司合成。使用TB Green Premix ExⅡ試劑盒（TaKaRa公司）進(jìn)行RT-qPCR，反應(yīng)體系為：10 μL TB Green Premix ExⅡ、正反引物各0.8 μL、0.4 μL ROX Reference DyeⅡ、6 μL滅菌水、2 μL cDNA溶液，反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。溶解曲線溫度設(shè)置為60～95 ℃，升溫速度為0.2 ℃/s。每個(gè)基因每個(gè)時(shí)期3次技術(shù)重復(fù)，得出的數(shù)據(jù)計(jì)算△Ct值后使用2?△△Ct公式運(yùn)算。

表1 根據(jù)FPKM值及Blast P比對(duì)篩選到的8個(gè)候選內(nèi)參基因

表2 候選內(nèi)參基因的引物序列

1.3 數(shù)據(jù)處理

將一心維納斯蝴蝶蘭6個(gè)花期的cDNA等量混合，設(shè)置5個(gè)濃度梯度（5?1、5?2、5?3、5?4、5?5），每個(gè)濃度梯度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，對(duì)樣品進(jìn)行RT-qPCR。以獲得的5個(gè)梯度下各個(gè)內(nèi)參基因的Ct值為縱坐標(biāo)，稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并利用公式計(jì)算各候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率（）[10]，=(10?1/k?1)′100%。

參考當(dāng)前已有的試驗(yàn)中對(duì)內(nèi)參基因穩(wěn)定性的分析方法[11]，通過geNorm、NormFinder和BestKeeper三個(gè)分析軟件對(duì)各候選內(nèi)參基因在一心維納斯蝴蝶蘭6個(gè)不同花期中的穩(wěn)定性進(jìn)行分析，綜合3個(gè)軟件得出的穩(wěn)定性排名，篩選出最適的內(nèi)參基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)參基因RT-qPCR分析

RT-qPCR分析得出的結(jié)果如圖1所示，溶解曲線均僅出現(xiàn)單一峰，表明8個(gè)內(nèi)參基因均未出現(xiàn)引物二聚體。引物二聚體會(huì)產(chǎn)生熒光信號(hào)，干擾到目的基因的定量[12]，無引物二聚體，說明引物的特異性較好，滿足RT-qPCR下一步試驗(yàn)的條件。

以一心維納斯蝴蝶蘭不同發(fā)育階段的cDNA為模板進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的斜率（）、相關(guān)系數(shù)（2），計(jì)算引物擴(kuò)增效率（）。結(jié)果表明（表3），和擴(kuò)增效率分別為121.95%和112.23%，高于110%。其余的6個(gè)候選內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率均在90%～110%之間，且8個(gè)候選內(nèi)參基因相關(guān)系數(shù)（2）在0.9826～ 0.9998之間，表明特異性及擴(kuò)增效率良好，滿足RT-qPCR操作。

圖1 候選內(nèi)參基因溶解曲線

表3 8種引物的相關(guān)系數(shù)與擴(kuò)增效率

Tab.3 Amplification efficiency and correlation of eight candidate genes

候選內(nèi)參基因的Ct值越大，基因的表達(dá)量越小；反之，候選內(nèi)參基因的Ct值越小，基因的表達(dá)量越大，且同一個(gè)候選內(nèi)參基因Ct值的波動(dòng)越大，說明該基因的表達(dá)穩(wěn)定性越小。對(duì)8個(gè)內(nèi)參基因在各樣本中的表達(dá)水平（Ct值）進(jìn)行分析（表4），在一心維納斯蝴蝶蘭6個(gè)花期中，各候選內(nèi)參基因在不同樣本中的Ct平均值為20.789～ 27.735。其中的平均Ct值最低，其表達(dá)量最高；的平均Ct值最高，其表達(dá)水平最低；、、、、、、、的平均表達(dá)水平依次升高。的Ct值變化幅度最大，Ct差值為3.594；波動(dòng)范圍最小，Ct差值為1.981。

表4 8個(gè)候選基因在6個(gè)樣本中的Ct值

2.2 候選基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

2.2.1 geNorm軟件分析 通過geNorm軟件計(jì)算候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定值（表5），值與穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，<1.5時(shí)被認(rèn)為是理想內(nèi)參。在本研究中，8個(gè)候選內(nèi)參基因在不同時(shí)期花序中的值均小于0.7，表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性。在不同時(shí)期花序中，和2的值最低（0.207），穩(wěn)定性最好，其次是（0.257），而相對(duì)來說，表達(dá)最不穩(wěn)定（值最高，為0.663）。但由于<1.5時(shí)就能被認(rèn)為是理想內(nèi)參，則8個(gè)內(nèi)參基因均有較為良好的穩(wěn)定性，表達(dá)穩(wěn)定性由大到小排序?yàn)?>>>>>>。

表5 geNorm分析候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性

2.2.2 NormFinder軟件分析 使用NormFinder軟件計(jì)算出的表達(dá)穩(wěn)定值越小，說明該基因越穩(wěn)定，反之，值越大，該基因穩(wěn)定性就越差。如表6所示，在不同時(shí)期花序中，8個(gè)內(nèi)參基因的穩(wěn)定性依次為>>>>>>>，其中，表達(dá)穩(wěn)定性最高，表達(dá)穩(wěn)定性最低。

表6 NormFinder軟件分析候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性

2.2.3 BestKeeper軟件分析 使用BestKeeper軟件計(jì)算Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差（stardand deviaton, SD）及變異系數(shù)（coefficient of variation, CV）并比較各值的大小，分析判斷該內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性。SD和CV越小，穩(wěn)定性越好。由表7可知，除了之外的內(nèi)參基因的SD值均小于1，表達(dá)穩(wěn)定性依次為>>>>>>，其中穩(wěn)定性最好，穩(wěn)定性較差。的SD值大于1，說明穩(wěn)定性較差，相對(duì)來說，不適合作為內(nèi)參基因。

表7 BestKeeper軟件分析候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性

2.2.4 綜合評(píng)價(jià) 上述3個(gè)分析結(jié)果表明，3個(gè)軟件的結(jié)果存在相似之處，但同時(shí)也存在差異。geNorm軟件分析結(jié)果表明，和穩(wěn)定性最高；NormFinder軟件分析結(jié)果表明，穩(wěn)定性最高；BestKeeper軟件分析結(jié)果表明，穩(wěn)定性最高。因此，對(duì)3個(gè)軟件分析的結(jié)果進(jìn)行幾何平均值計(jì)算并排名（表8），排名越高，幾何平均值越小，該基因表達(dá)越穩(wěn)定。在一心維納斯蝴蝶蘭花朵不同發(fā)育時(shí)期中，的表達(dá)最穩(wěn)定，是一心維納斯蝴蝶蘭花朵不同發(fā)育時(shí)期中最理想的內(nèi)參基因，其次是；表達(dá)最不穩(wěn)定的是，不合適用作內(nèi)參基因。

表8 Excel綜合分析候選基因的表達(dá)穩(wěn)定性排名

Tab.8 Expression stability of candidate genes was ranked by Excel comprehensive analysis

3 討論

RT-qPCR技術(shù)是被廣泛應(yīng)用的基因表達(dá)分析的主要技術(shù)手段，但其結(jié)果的準(zhǔn)確性需依靠試驗(yàn)所選出的對(duì)特定物種表達(dá)穩(wěn)定性較高的內(nèi)參基因，未經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)而使用其他試驗(yàn)中發(fā)表的內(nèi)參基因可能會(huì)導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差[13]。因此，在進(jìn)行目的基因表達(dá)水平研究時(shí)，首先需要篩選在特定條件下合適的內(nèi)參基因。目前，多種觀賞花卉的內(nèi)參篩選試驗(yàn)均有報(bào)道，如石蒜（）[14]、萱草（）[10]、茉莉花（）[15]等，大辣椒蝴蝶蘭（Hybrid, Big Chili）在低溫脅迫條件下的內(nèi)參基因研究已有報(bào)道[16]，但還未見蝴蝶蘭花香釋放過程中相關(guān)內(nèi)參基因的篩選研究。

本研究通過3種軟件分析了8個(gè)候選內(nèi)參基因在一心維納斯蝴蝶蘭花朵不同發(fā)育時(shí)期中的穩(wěn)定性情況。3種分析軟件得出的結(jié)果有所不同，但表達(dá)比較穩(wěn)定和最不穩(wěn)定的候選內(nèi)參基因基本相同。geNorm軟件和NormFinder軟件得出的結(jié)果較為相似，BestKeeper軟件得出的結(jié)果相差較大，可能是BestKeeper軟件分析時(shí)直接使用Ct值這一原始數(shù)據(jù)，導(dǎo)致與geNorm和NormFinder軟件比較差異性相對(duì)大。該分析結(jié)果在其他內(nèi)參基因篩選的報(bào)道中也常有出現(xiàn)，如曹映輝等[17]在建蘭（）花香物質(zhì)合成相關(guān)基因內(nèi)參基因篩選中，geNorm和NormFinder軟件得出的結(jié)果一致性較高，均表明與表達(dá)較為穩(wěn)定，而BestKeeper卻不同；齊香玉等[15]在茉莉（）不同組織（含花朵）中內(nèi)參基因的篩選試驗(yàn)中表明，在BestKeeper中的穩(wěn)定性最好，但是其在geNorm和NormFinder中的穩(wěn)定性卻較差，反之和在BestKeeper中的穩(wěn)定性不好，但其在geNorm和NormFinder中的穩(wěn)定性較好。因此，需要對(duì)3個(gè)軟件的最后結(jié)果進(jìn)行幾何平均數(shù)計(jì)算并分析排名，降低誤差，以提高結(jié)果的準(zhǔn)確性，最后根據(jù)綜合分析得到最理想的內(nèi)參基因。

基因參與真核生物細(xì)胞的許多重要生命活動(dòng)，如細(xì)胞形狀的維持、胞質(zhì)環(huán)流、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞分裂、細(xì)胞分化、細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)運(yùn)輸、極性鍵成以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等[18]。在理想狀態(tài)下，無論是細(xì)胞類型或發(fā)育階段不同，還是處理方法不同，一個(gè)理想的內(nèi)參基因都能穩(wěn)定表達(dá)。由于基因在個(gè)體各個(gè)生長(zhǎng)階段的大多數(shù)組織中持續(xù)表達(dá)，變化小，序列高度保守，基因常作為內(nèi)參基因使用[19]。一心維納斯蝴蝶蘭花朵不同發(fā)育時(shí)期的理想候選內(nèi)參基因是。在其他物種的內(nèi)參基因篩選報(bào)道中，也有被選為理想的內(nèi)參基因的情況。李晗等[20]選擇羽衣甘藍(lán)（var.）不同發(fā)育時(shí)期的柱頭作為材料通過qRT-PCR對(duì)7個(gè)候選內(nèi)參基因進(jìn)行篩選，篩選出基因?yàn)樽詈线m的內(nèi)參基因。在馬鈴薯（）中也能穩(wěn)定表達(dá)[21]。在甘草干旱條件下[22]、板藍(lán)根ABA處理?xiàng)l件下及冬油菜低溫脅迫條件下的表達(dá)均最為穩(wěn)定[23-24]。

基因在一心維納斯蝴蝶蘭花朵不同時(shí)期中表達(dá)的穩(wěn)定性最差，而仇志浪等[25]在甜櫻桃（）花芽不同時(shí)期的內(nèi)參基因篩選中得出的最佳內(nèi)參基因是；NICOT等[26]在馬鈴薯植株不同脅迫條件下的內(nèi)參基因篩選中得出的最穩(wěn)定基因也是。說明并不存在理想的內(nèi)參基因適用于所有植物，在不同植物不同條件下，需要根據(jù)實(shí)際情況篩選合適的內(nèi)參基因。

在聚寶紅玫瑰蝴蝶蘭（cultivar, Jiuhbao Red Rose）內(nèi)參基因的研究中，基于geNorm和NormFinder分析，在蝴蝶蘭的大多數(shù)測(cè)試樣本中表現(xiàn)出高度穩(wěn)定性，表明是蝴蝶蘭qRT-PCR分析的合適參考基因[27]。CHUANG等[28]在研究貝麗娜蝴蝶蘭（）花香物質(zhì)合成相關(guān)功能基因時(shí)，選用作為內(nèi)參基因。本研究則著重篩選出蝴蝶蘭花朵花香釋放時(shí)期所適用的內(nèi)參基因，為今后蝴蝶蘭花香物質(zhì)合成相關(guān)基因功能及分子機(jī)制的研究提供更有針對(duì)性的參考依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究利用qRT-PCR技術(shù)，通過3個(gè)分析軟件（geNorm、NormFinder、BestKeeper）來分析評(píng)估一心維納斯蝴蝶蘭的8個(gè)候選內(nèi)參基因（,,,,,,,）在不同花期中的穩(wěn)定性，經(jīng)過綜合分析表明，內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序?yàn)?>>=>>>，得出為最為理想的內(nèi)參基因，次之。在一心維納斯蝴蝶蘭花香物質(zhì)合成與釋放的研究過程中，對(duì)相對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行分析時(shí)，可用基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行校正。

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Selection of Suitable RT-qPCR Reference Genes for Floral Scent Biosynthesis inI-Hsin Venus

ZHANG Yangting1, ZHANG Yanping1, HUANG Jingyan1, WANG Wenjun1, TONG Yan1, ZHAO Kai2, ZHOU Yuzhen1*

1. College of Landscape Architecture and Art, Fujian Agricultural and Forestry University / Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration for Orchid Protection and Utilization, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2. College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou, Fujian 350117, China

I-Hsin Venus is an excellent variety of fragrant flowers, with elegant flower types, long flowering period and rich floral fragrance, which has high garden ornamental value.,,,,,,and, were selected as the candidate internal reference genes based on the transcriptome data of different flower development stages in. I-Hsin Venus to select the appropriate reference genes for RT-qPCR analysis of the correlated genes in the biosynthesis pathway of the floral scent inI-Hsin Venus. The expression of the candidate internal reference genes in inflorescences at different stages was detected by RT-qPCR. The candidate internal parameter genes were analyzed by combining three internal parameter gene stability analysis software: geNorm, NormFinder and BestKeeper. The results of comprehensive analysis showed thatwas the most stable and could be used as the best internal reference gene for the expression analysis of. I-Hsin Venus.

I-Hsin Venus; reference genes; RT-qPCR; expression stability

S682.31

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.006

2022-06-05；

2022-09-15

福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（No. 2023J01283）；福建農(nóng)林大學(xué)優(yōu)秀碩士論文基金項(xiàng)目（No. 1122YS01009）。

章楊婷（1998—），女，碩士研究生，研究方向：園林植物與應(yīng)用。*通信作者（Corresponding author）：周育真（ZHOU Yuzhen），E-mail：zhouyuzhen@163.com。