芒果MiNAC7基因的表達模式及在開花和非生物逆境脅迫應答中的功能分析

黃星 徐歡歡 黎開獎 何新華 夏黎明 陸婷婷 梁容真 羅聰

關鍵詞：芒果；MiNAC7；生物信息學分析；表達模式；功能研究

NAC（NAM、ATAF1/2和CUC2）基因家族是最大的植物特有轉錄因子家族之一，基因成員數量龐大[1]。隨著全基因組測序技術日趨完善，目前已發現絕大部分物種均存在100個以上的NAC基因數量[2]。NAC基因在影響植物生長[3]、調控植株成花[4]、果實成熟[5-6]、葉片衰老[7]和應對非生物脅迫[8-10]等生理過程中發揮了重要作用。

NAC基因家族參與多種激素調控途徑和非生物脅迫應答過程。NAC基因參與調節ABA信號傳導途徑，如：擬南芥AtNAC016可以結合ABA依賴性脅迫信號通路中的關鍵轉錄因子脫落酸響應元件結合蛋白1基因（AREB1）的啟動子，通過抑制AREB1的轉錄來促進對干旱脅迫的反應[11]；過表達水稻ONAC022對外源ABA的敏感性增強，與ABA有關的調控基因表達上調，即水稻ONAC022通過調節ABA信號傳導途徑來提高抗旱和耐鹽脅迫能力[12]；陸地棉GhirNAC2直接與GhNCED3a/3c的啟動子結合，通過調節GhNCED-3a/3c表達來調節ABA生物合成和氣孔關閉，增強了轉基因植物的抗旱性[13]。NAC基因參與調節GA信號傳導途徑，如甘蔗ScNAC23直接與DELLA蛋白ScGAI相互作用調節GA信號傳導途徑來促進甘蔗開花和葉片衰老[14]。NAC基因還參與調節生長素和細胞分裂素等途徑，如水稻OsNAC2基因可以直接結合IAA和細胞分裂素（cytokinin，CK）相關基因的啟動子來調節根發育過程中的細胞分裂[15]。另外，甘蔗OsNAC14可以直接與DNA修復系統中同源重組的關鍵成分OsRAD51A1啟動子之間相互作用，招募參與DNA損傷修復和防御反應的因子來提高耐旱性[8]；梭梭HaNAC1直接與AtNAC32蛋白相互作用來增強抗旱性[16]。

芒果（MangiferaindicaL.）是重要的熱帶水果，適時開花有利于芒果生產[17]。前期研究中，課題組從芒果成花基因LEAFY的酵母文庫篩選獲得1個NAC7基因，而NAC轉錄因子參與了植物的逆境脅迫應答[18]。目前尚不清楚芒果MiNAC7基因是否參與了芒果的成花與逆境脅迫應答。因此，本研究對MiNAC7的生物信息學、表達模式和基因功能進行分析，明確MiNAC7基因在芒果開花和非生物脅迫中的功能。

1材料與方法

1.1材料

本研究所用芒果品種為四季蜜芒（MangiferaindicaL.cv.SiJiMi），該芒果品種生長于廣西大學農學院標本園中。用于時間表達分析的樣本主要為成年期的葉片，采集時間為2021年9月至2022年5月，每月1日下午5點采集1次。時間表達主要分為5個生長階段，即營養生長期、成花誘導期、花芽分化期、花序伸長和開花期、果實發育初期。用于組織表達分析的樣本主要為童期的葉、莖、芽，采集時間為2022年2月15日；成年期的葉、莖、花以及幼胚和成熟胚，采集時間為2021年11月16日。所有樣品采集后立即用液氮冷凍并保存在?80℃冰箱中。本研究中使用的擬南芥為哥倫比亞型擬南芥。

1.2方法

1.2.1生物信息學分析利用TBtools軟件和cDNA以及DNA文件繪制MiNAC7的DNA序列結構圖[19]；通過NCBI/blastp數據庫對芒果MiNAC7編碼的氨基酸序列進行同源查找并預測其保守結構域，利用DNAMAN軟件對不同物種的NAC蛋白進行氨基酸序列比對；利用MEGA7.0軟件構建NAC蛋白的系統發育樹[20]；利用NewPlace數據庫對MiNAC7基因前2000bp的啟動子區進行分析并通過TBtools軟件繪制順式元件的分布。

1.2.2MiNAC7的表達分析芒果樣品RNA采用美基公司的難提植物總RNA小提試劑盒提取，擬南芥樣品RNA采用植物RNA小量提取試劑盒提取。利用M-MLV逆轉錄酶按照說明書將RNA逆轉錄為cDNA，用于后續實驗。利用在線軟件Primer3.0Plus設計特異引物（MiNAC7u：5?-CTGCAGACATAAACGGTGGA-3?，MiNAC7d：5?-TGGGTTGACAAGATCCAACA-3?），以芒果MiActin1為內參基因[21]（qMiACTu：5?-CCGAGACATGAAGGAGAAGC-3?，qMiACTd：5?-GTGGTCTCATGGATACCAGCA-3?）。采用TaKaRa公司的SYBRGreen和SYBRPremixExTaqII試劑，使用AppliedBiosystems7500實時定量PCR儀對MiNAC7基因的表達進行RTqPCR檢測，使用2–ΔΔCT方法對熒光定量的結果進行分析[22]。

1.2.3擬南芥的轉化將MiNAC7的完整cDNA序列（CDS）插入到pBI121載體中，將陽性重組質粒pBI121-MiNAC7按照說明書的方法導入農桿菌EHA105中，隨后用花序侵染法對野生型擬南芥進行轉化[23]。收獲侵染后的種子，將其播種于含有50mg/L卡納的1/2MS培養基中進行陽性苗篩選，利用余海霞等[24]改良的CTAB法提取陽性擬南芥的DNA，用MiNAC7的特異引物對陽性轉基因擬南芥進行PCR檢測與驗證。對序列檢測正確的陽性擬南芥進行培育繁殖，直至獲得純合株系。

1.2.4轉基因擬南芥的表型分析將擬南芥置于長日照（16h光照/8h黑暗）和21℃的條件下培養，以野生型擬南芥（WT）和轉空載擬南芥（pBI1121）為對照，觀察轉基因擬南芥的表型，統計植株第一朵花開放的時間。以T3代純合轉基因擬南芥的cDNA為模板，擬南芥基因AtACTIN2為內參基因（AtActin2u：5?-TCAGATGCCCAGAAGTCTTGTTCC-3?，AtActin2d：5?-CCGTACAGATCCTTCCTGATATCC-3?），通過半定量法[25]檢測芒果MiNAC7基因在轉基因擬南芥中的表達水平。通過qRT-PCR法檢測開花相關基因在轉基因擬南芥中的表達水平（AtFTu：5?-CTTGGCAGGCAAACAGTGTATGCAC-3?，AtFTd：5?-GCCACTCTCCCTCTGACAATTGTAGA-3?;AtAP1u：5?-CACCAAATCCAGCATCCTTAC-3?，AtAP1d：5?-GTTCGAGATCATTCCTCCTCA-3?;AtFLCu：5?-ACTTGTGGATAGCAAGCTTGTGG-3?，AtFLCd：5?-CATGAGTTCGGTCTTCTTGGCTC-3?）。

1.2.5轉基因擬南芥的非生物逆境脅迫處理將T4代轉基因擬南芥幼苗置于長日照培養箱經過3d培養后轉入逆境培養基中，豎直放置并繼續培養5d后，拍照并記錄野生型和轉基因擬南芥的根長表型和鮮重。逆境脅迫處理所用的試劑及濃度設計如下：鹽脅迫使用濃度為0、100、125mmol/L氯化鈉（NaCl）；干旱脅迫使用的甘露醇（mannitol）濃度為0、300、400mmol/L；ABA濃度為0、5μmol/L，GA3濃度為0、5、10μmol/L。

1.3數據處理

本研究所有數據（如表達分析、表型分析和非生物脅迫逆境分析數據等）均使用Excel軟件進行統計處理，采用IBMSPSS25.0軟件進行單因素方差分析和Duncan多重范圍檢驗，利用GraphPadPrism9繪制條形圖，P<0.05表示差異顯著，有統計學意義。

2結果與分析

2.1MiNAC7生物信息學分析

MiNAC7基因DNA全長為3631bp，編碼區長度為1137bp，編碼379個氨基酸，等電點為4.88，蛋白質分子量為93.41kDa。MiNAC7有4個內含子，5個外顯子（圖1A）。利用MEGA7.0軟件構建了NAC蛋白的系統進化樹（圖1B），芒果MiNAC7與阿月渾子PvNAC26最接近，同源性最高，氨基酸相似性為69.64%，且MiNAC7與PvNAC26、CcNAC29、CcNAC100、CsNAC29、LcNAC39同源性較高。故對這6個物種的NAC氨基酸序列進行比對，其保守結構域如圖1C所示，6種蛋白的N端表現出高度的相似性，氨基酸序列中含有1個NAM保守結構域，是NAC基因家族的典型結構域，C端表示出明顯的差異。對MiNAC7基因的起始密碼子前2000bp的啟動子區域進行順式元件分析（圖1D），MiNAC7基因啟動子主要包含6種不同類型的順式調控元件，即光響應元件（lightresponseelement）、ICE轉錄因子結合位點、MYB轉錄因子結合位點、赤霉素響應元件（gibberellinresponse）、茉莉酸響應元件（jasmonicacidresponseelement）以及生長素響應元件（auxinresponseelement）等。

2.2MiNAC7基因的表達模式分析

特性，采集童期和成年期的不同組織進行表達模式分析。如圖2A所示，MiNAC7基因在各個組織中均表達，但表達存在差異，MiNAC7在童期組織的莖中表達最高，其次是在芽中，在葉中表達很低，在成年期的莖中表達水平較高，在花和葉中表達很低；表明MiNAC7基因在莖中優勢表達。為了探究MiNAC7基因在四季蜜芒中不同生長發育時期的表達特性，利用qRT-PCR對不同時期的表達模式進行分析。如圖2B所示，MiNAC7基因在不同時期的葉片中均存在不同程度的表達，其中在營養生長期的葉片中維持較高的表達水平，在成花轉變期和花發育期的葉片中表達水平很低，說明MiNAC7基因與植物生長發育有關。

2.3MiNAC7轉基因擬南芥對開花的影響

將構建好的載體采用花序侵染法轉化野生型擬南芥植株后，篩選陽性株系并繁育至T3代純合植株。通過半定量PCR技術檢測MiNAC7在轉基因擬南芥中的表達情況，結果如圖3A1所示，MiNAC7在這3個轉基因株系（OE-2、OE-3、OE-6）中均可以正常表達，而在野生型（WT）和轉pBI121空載擬南芥中不表達。以野生型擬南芥（WT）和轉空載pBI121擬南芥為對照，觀察MiNAC7轉基因擬南芥的開花時間。結果如圖3A所示，MiNAC7轉基因擬南芥顯著延遲開花，開花時間比對照植株晚約4d（圖3B）。轉基因擬南芥開花內源基因表達水平檢測顯示，MiNAC7轉基因擬南芥中促花基因AtFT和AtAP1的表達水平被顯著下調，而抑制成花基因AtFLC的表達水平被顯著上調（圖3C）。

2.4MiNAC7轉基因擬南芥對逆境脅迫應答的影響

為了解MiNAC7在非生物逆境脅迫中的功能，對野生型擬南芥和3個超量表達株系進行鹽脅迫處理（0、100、125mmol/LNaCl）、干旱脅迫處理（0、300、400mmol/L甘露醇）和激素處理（0、5μmol/LABA，0、5、10μmol/LGA3），結果見圖4。在對照組中，野生型與MiNAC7轉基因擬南芥在根長和鮮重上差異不顯著，實驗組的野生型與MiNAC7轉基因擬南芥在根長和鮮重上差異顯著。鹽脅迫處理使擬南芥根長生長受到抑制，但MiNAC7轉基因擬南芥的根長受到的抑制顯著小于野生型擬南芥。干旱脅迫抑制了擬南芥根長生長，鮮重重量降低，但MiNAC7轉基因擬南芥的根長受到的抑制比野生型擬南芥輕，鮮重比野生型擬南芥重。GA3激素處理使擬南芥根長和鮮重均受到不同程度的影響，5μmol/LGA3激素處理促進了MiNAC7轉基因擬南芥的根長生長，鮮重升高，但對野生型擬南芥的根長生長無顯著差異；10μmol/LGA3激素處理與5μmol/LGA3激素處理相比，野生型擬南芥和MiNAC7轉基因擬南芥的根長生長均被抑制。在5μmol/LABA激素處理下擬南芥表型差異明顯，植株弱小，MiNAC7轉基因擬南芥的根長比野生型擬南芥的短。綜上所述，過表達MiNAC7基因增強了轉基因擬南芥對ABA的敏感性、抗GA3以及抗旱和耐鹽堿能力。

3討論

NAC基因家族廣泛存在于大量物種中，在植物激素信號傳導，成花發育、果實成熟、葉片衰老等植物生長發育過程以及高鹽、干旱、低溫或高溫等非生物脅迫中起重要作用[26]。通過酵母雙雜交文庫篩選，挖掘獲得了1個NAC類轉錄因子，命名為MiNAC7，NCBI同源性比較分析顯示，MiNAC7與多個被命名為不同名字的NAC基因具有同源性，其中與阿方索芒果MiNAC7的核苷酸和氨基酸同源性分別為98.16%和96.04%。進化樹分析顯示芒果MiNAC7與阿月渾子PvNAC26最接近，同源性最高，氨基酸相似性為69.64%。啟動子順式元件分析表明，芒果MiNAC7基因可能受到光照、激素以及逆境脅迫的調控。

不同物種NAC家族基因表現出不同的表達模式。蠟梅CpNAC68在成熟葉和花上特異表達[27]，小麥TtNAC2A在葉和根中特異表達[28]。黃瓜NAC基因家族中有11個基因的優勢表達部位是莖[29]，菊花菜NAC基因家族中有3個成員在莖的生長發育過程中起重要的調控作用[30]。在本研究中，芒果MiNAC7基因在童期組織中的表達水平相對于成年期更高，在童期莖的表達量最高，與北沙柳SpsNAC005的研究結果相似[31]。芒果時空組織分析結果顯示，MiNAC7基因在營養生長期表達量較高，但在成花轉變和花發育期表達水平較低，說明MiNAC7與芒果成花有關。

在植物開花時間的調控中不同的NAC基因具有不同的功能。甘蔗ScNAC23的過表達促使轉基因擬南芥提前開花[14]，黃麻CcNAC1可以讓植物的花期提前[32]，OsNAC7亞家族CHR00069684基因使轉基因煙草提前開花[30]。本研究中，MiNAC7過表達的轉基因擬南芥延遲開花，并下調開花促進基因AtFT和AtAP1的表達，上調成花抑制基因AtFLC的表達，說明MiNAC7通過調控成花相關基因的表達進而影響轉基因植株成花。芒果MiNAC1基因不影響轉基因擬南芥的開花時間[33]，說明不同類型的NAC基因在調控植物成花過程中的功能存在差異。

植物NAC轉錄因子在多種非生物脅迫應答中起重要作用，在NaCl、甘露醇或ABA脅迫條件下，剛毛檉柳ThNAC13轉基因植物的根長和鮮重與野生型植物相比均顯著增加[34]。在ABA脅迫條件下，南荻MlNAC10[35]、歐李ChNAC1[36]轉基因植物都增加了對ABA的敏感性。在本研究中，100、125mmol/L濃度的鹽脅迫處理和300、400mmol/L的干旱脅迫的轉基因擬南芥根長均比野生型擬南芥根長較長，鮮重比野生型擬南芥重。5、10μmol/LGA3激素處理促進了MiNAC7轉基因擬南芥的根長生長，在5μmol/LABA激素處理下轉基因擬南芥根長較短，說明MiNAC7也參與了植物的逆境脅迫應答過程。這與芒果MiNAC1基因在逆境脅迫方面的研究結果相似[33]。

綜上所述，芒果MiNAC7基因不僅參與調控植株開花，同時響應非生物逆境脅迫應答。