基于流式細(xì)胞術(shù)的蘭屬雜交后代倍性鑒定

冷青云 陸錦萍 黃少華 徐世松 李海燕 牛俊海 尹俊梅

關(guān)鍵詞：流式細(xì)胞術(shù)；蘭屬；倍性鑒定

蘭屬（CymbidiumSw.）是蘭科（Orchidaceae）重要觀賞類群之一，原生種約86種[1]，主要分布于亞洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，向南到澳大利亞北部，中國是該屬的分布中心和多樣性中心，分布于秦嶺山脈以南地區(qū)，約有63種[2]。種內(nèi)品種及種間雜種和品種間雜交種超過2萬種，截至2022年，在國際蘭花雜種登錄權(quán)威機(jī)構(gòu)（InternationalRegistrationAuthorityforOrchidHybrids，RHS）上登錄的蘭屬植物雜交種有超過17363個[3]。

蘭屬育種方式有選擇育種、雜交育種與誘變育種等，其中雜交育種是蘭屬植物的主要育種手段。在雜交育種工作中，了解親本及雜交后代的倍性和育性十分重要，有利于提高育種的成功率。通過染色體計(jì)數(shù)法對一些蘭屬原生種及雜交品種（雜交蘭和大花蕙蘭）進(jìn)行倍性鑒定研究，原生種及雜交蘭主要是二倍體，大花蕙蘭（Cymbidiumhybridium）的染色體倍性多樣化，有二倍體、三倍體、四倍體、六倍體和非整倍體[4-10]。然染色體計(jì)數(shù)法對細(xì)胞學(xué)操作技術(shù)要求較高，且費(fèi)時費(fèi)工，面對大規(guī)模種質(zhì)資源及雜交后代群體的倍性鑒定需要尋找一種快速便捷、高通量鑒定的方法。

流式細(xì)胞術(shù)（flowcytometry，F(xiàn)CM）是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種對懸浮的單細(xì)胞進(jìn)行高速分析和分選的技術(shù)。在植物學(xué)研究中，常用于倍性分析、細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞周期分析及植物基因組大小估算等研究，具有分析速度快、靈敏度高、可靠性好等優(yōu)點(diǎn)[11-12]。近年來在紅掌[13]、香蕉[14]、橡膠[15]、火龍果[16]、茉莉花[17]、桂花[18]、三角梅[19-20]等植物倍性鑒定中應(yīng)用。在蘭科植物研究中，已有超過26屬70種的基因組大小是通過FCM評估，包括蘭屬、兜蘭屬（Paphiopedilum）、樹蘭屬（Epidnedium）等[21-25]，另外，F(xiàn)CM也應(yīng)用于對化學(xué)誘變劑處理后的蝴蝶蘭（Phalaenopsis）、石斛（Dendrobium）、白芨（Bletilla）倍性鑒定[26-29]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)對蘭屬3個雜交后代群體進(jìn)行倍性鑒定，以期為快速鑒定雜種后代倍性提供技術(shù)方法，并獲得優(yōu)良的多倍體植株，為今后的多倍體育種提供種質(zhì)材料。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料為親本黃金小神童（CymbidiumGoldenElf.‘Sundust）、冬風(fēng)蘭（CymbidiumdayanumRchb.f）、美花蘭（CymbidiuminsigneRolfe）以及其雜交后代群體，其中，黃金小神童為雜交種，其他為原生種，具體組合及雜交后代數(shù)量見表1。所有材料均保存于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所八隊(duì)熱帶花卉種質(zhì)資源圃。

1.2方法

1.2.1蘭屬流式細(xì)胞術(shù)倍性檢測技術(shù)體系構(gòu)建裂解液種類、試驗(yàn)材料組織部位是影響倍性檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本試驗(yàn)應(yīng)用了3種裂解液Galbraithsbuffer（GLB）（30mmol/LNa3C6H5O7·2H2O、45mmol/LMgCl2、20mmol/L3-[nmorpholino]propanesulfonicacid]、0.1%TritonX-100（w/V），pH7.0）、WoodyPlantBuffer（WPB）（0.2mol/LTris-HCl，86mmol/LNaCl，10mmol/L焦亞硫酸鈉，4mmol/LMgCl2·6H2O，2mmol/LEDTANa2·2H2O，1%PVP-10，1%（V/V）TritonX-100，pH7.5[26]、CyStainUVPreciseP試劑盒，以黃金小神童幼嫩葉片、根尖組織、花梗、花萼片為材料，利用流式細(xì)胞儀測定相對熒光強(qiáng)度（relativefluorescenceintensityofPI-stainednuclei，F(xiàn)L）和G0/G1期的變異系數(shù)（coefficientofvariation，CV），篩選出最適合裂解液及組織部位，每個處理重復(fù)3次。

1.2.2蘭屬雜交后代流式細(xì)胞術(shù)倍性檢測基于黃金小神童為試驗(yàn)材料構(gòu)建的蘭屬流式細(xì)胞術(shù)倍性檢測技術(shù)體系：解離液為CyStainUVPreciseP，幼嫩葉片為試材，檢測其倍性。

將樣品置于含1.0mL預(yù)冷的GLB解離液的培養(yǎng)皿中，用鋒利的刀片切碎，2min后用300目尼龍網(wǎng)過濾，濾液加入預(yù)冷的碘化丙啶（PI）和RNAase溶液，工作濃度均為50μg/mL。置于冰上避光染色0.5～1h后上機(jī)檢測，儀器為SysmexCyFlow?PloidyAnalyser，激發(fā)光為488nm，每次檢測收集5000個顆粒，儀器自帶軟件作圖分析，變異系數(shù)控制在5%以內(nèi)。每份材料重復(fù)3次。

1.2.3不同倍性氣孔形狀觀察葉片氣孔大小和密度比較：取不同倍性葉片，在葉片下表皮均勻涂上一層透明指甲油，待指甲油干后，用鑷子挑取其表皮置于有蒸餾水的載玻片上，吸取多余的水分，加蓋玻片后在LeicaDM2500生物顯微鏡40×物鏡下觀察測量。每片至少觀察10個視野，記錄每個視野內(nèi)氣孔器的個數(shù)，每片選取30個氣孔，測量每個氣孔器的長度和寬度。

2結(jié)果與分析

2.1蘭屬流式細(xì)胞術(shù)倍性檢測技術(shù)體系構(gòu)建

2.1.1不同裂解液對細(xì)胞核解離的影響以黃金小神童嫩葉為供試材料，利用流式細(xì)胞儀研究3種裂解液對蘭屬植物的裂解效果（圖1，表2），發(fā)現(xiàn)3種裂解液均能較好地保證完整的細(xì)胞核從破碎細(xì)胞中裂解出來，同時可降解細(xì)胞中的次生代謝產(chǎn)物。對于FL值，3種裂解液有顯著差異，其中GLB裂解液裂解樣品得出的FL值最低，最高的FL值出現(xiàn)在CyStainUVPreciseP裂解的樣品中，且顯著高于另外2個裂解液。在用3種裂解液對蘭屬進(jìn)行流式分析中，CV值差異不顯著，最高的為WPB裂解液，CV值為5.66%，大于5%；最低為GLB裂解液，為3.93%。裂解液的選擇標(biāo)準(zhǔn)為有最高的FL值和最低的CV值，通過表2發(fā)現(xiàn)，CyStainUVPreciseP在3種裂解液種中最佳。從圖1也可看出，CyStainUVPreciseP制備的樣品流式細(xì)胞圖出峰清晰、穩(wěn)定、雜峰少，并且可以清晰地觀察到G2期。因此，選定CyStainUVPreciseP試劑盒為本研究后期的裂解液。

2.1.2不同組織部位對植物倍性的影響本研究分別使用植株的嫩葉、根尖、花梗和花萼片來驗(yàn)證不同組織器官對植物倍性檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的影響。由圖2可知，4種組織器官均能裂解出細(xì)胞核，嫩葉和花梗有一個明顯峰值，其峰值清晰，細(xì)胞碎片少，根尖和花萼片流式DNA含量直方圖顯示出2C、4C、8C共3個峰值，根尖在2C、4C處峰值等高，花萼片的主峰值出現(xiàn)在4C處，是葉片主峰值的2倍，這2種組織呈現(xiàn)體內(nèi)多倍化現(xiàn)象，不適合作為蘭屬倍性檢測的組織材料，花梗能較好地出峰，也無多倍化細(xì)胞干擾，但其取材時間只能在開花期特定時間采集，而葉片可以在任何季節(jié)取材，是理想的蘭屬倍性檢測組織部位。在后續(xù)的研究中選擇以幼嫩葉片為材料開展流式細(xì)胞術(shù)檢測。

2.2蘭屬雜交后代流式細(xì)胞術(shù)倍性檢測

以CyStainUVPreciseP試劑盒為裂解液，利用流式細(xì)胞儀對3個親本及其雜交后代進(jìn)行倍性檢測。測定結(jié)果見圖3，3個親本流式細(xì)胞圖出峰清晰、穩(wěn)定、雜峰少，熒光強(qiáng)度在12251～13509之間，差異不大。因3個親本均為二倍體，將雜交后代DNA相對含量峰值在12800左右定為二倍體，三倍體峰值在19200左右和四倍體峰值在25600左右。雜交后代倍性檢測統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3，共檢測出多倍體8株，其中黃金小神童×美花蘭后代檢測出三倍體1株，占比為1.02%；（黃金小神童×冬鳳蘭）×美花蘭后代檢測出三倍體5株，占比8.92%；四倍體2株，占比3.57%。

2.3不同倍性氣孔形狀比較

蘭屬二倍體、三倍體和四倍體的氣孔性狀分析結(jié)果表明（表4，圖4），不同倍性間的氣孔長度、寬度和密度均差異顯著（P<0.05）；氣孔長度和寬度的排序?yàn)樗谋扼w>三倍體>二倍體，而氣孔密度的排序則相反。

3討論

目前，流式細(xì)胞術(shù)是大規(guī)模檢測植物倍性的有效手段，具有快速、準(zhǔn)確、操作簡便和可重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。其中裂解液種類和試驗(yàn)材料組織部位是影響其準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素。前人研究發(fā)現(xiàn)GLB對蘭屬裂解效果最好[24-25]。本研究在對蘭屬植物裂解試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)CyStainUVPreciseP試劑盒裂解液是所用3種裂解液中效果最佳的，CyStainUVPreciseP為專利產(chǎn)品，配方成分未公開，且售價(jià)偏高，GLB含有檸檬酸鈉和TritonX-100，能清除蘭屬植物葉肉細(xì)胞中含有大量的糖類、酚類等黏性物質(zhì)，其裂解的細(xì)胞懸浮液也能出較好的峰值，因此在對蘭屬物種進(jìn)行流式細(xì)胞技術(shù)測定時，無法獲得CyStainUVPreciseP試劑盒裂解液的情況下，也可選擇GLB進(jìn)行試驗(yàn)。蘭科普遍存在核內(nèi)再復(fù)制現(xiàn)象[12]，蘭屬組織器官中也均存在多倍體化[30]。本研究所選的4種植物組織中，根尖和花萼片均存在不同程度的內(nèi)源多倍體化現(xiàn)象，內(nèi)源多倍體化在植物倍性鑒定中會造成倍性改變的假象，對結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生影響；嫩葉和花梗出峰穩(wěn)定，因嫩葉不受開花等影響，在幼苗期及成苗期均可以采樣，是蘭屬倍性檢測的最佳組織材料。

多倍體育種是觀賞植物育種的重要方向之一。目前商業(yè)化的大花蕙蘭品種多數(shù)為多倍體。不同倍性品種間雜交是蘭屬多倍體的主要選育途徑，三倍體可由四倍體為親本與二倍體雜交產(chǎn)生，四倍體由四倍體和四倍體雜交產(chǎn)生，二倍體品種間雜交也能產(chǎn)生四倍體的子代[8，10]。本研究在2個二倍體為親本的雜交組合后代中檢測到三倍體和四倍體，四倍體可能是由二倍體合子經(jīng)體細(xì)胞加倍后發(fā)育成植株，三倍體是由未減數(shù)分裂的2n配子和經(jīng)減數(shù)分裂n配子受精融合發(fā)育而成，其中2n配子來源于母本的概率大于父本，因?yàn)樵讷@得多倍體雜交組合的母本均為雜交種，黃金小神童是建蘭（C.ensifolium）和大花蕙蘭（C.EnidHaupt）的雜交種，經(jīng)多次雜交選育而成，具有50%建蘭、12.5%美花蘭和6.25%獨(dú)占春的血統(tǒng)[英國皇家園藝學(xué)會（RHS）的蘭科植物品種國際登錄網(wǎng)]。有研究表明遠(yuǎn)緣雜交是獲得高效發(fā)生2n配子資源的有效手段，雜交種在配子形成過程中減數(shù)分裂異常，出現(xiàn)2n配子概率顯著高于原生種[31-32]。從本研究中雜交組合3比組合2出現(xiàn)多倍體比例高的現(xiàn)象，也可發(fā)現(xiàn)雜交代數(shù)越高，遺傳背景越復(fù)雜，獲得可育配子比例低，產(chǎn)生后代數(shù)量也相對少，但更容易出現(xiàn)多倍體。在蘭屬雜交育種中，親本選擇可以親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，親本至少有一方是經(jīng)過多代雜交后的雜交種，這樣子代植株倍性會相對豐富。

染色體組的加倍會導(dǎo)致基因表達(dá)和調(diào)控的改變，從而造成植物形態(tài)和生理上的相應(yīng)變化，如葉片變寬、變厚，花瓣變厚、顏色變深，氣孔長度和寬度增大、密度降低、育性和抗性改變等。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著倍性的提高氣孔的長度和寬度均增大，氣孔密度變小。這與張?jiān)丛吹萚33]在橡膠多倍體研究中的結(jié)果相似。而株型、花朵數(shù)量、大小和顏色、花期長短、抗性及育性等特性有待進(jìn)一步觀察。