基于轉(zhuǎn)錄組測序的斑地錦內(nèi)參基因篩選及驗證

許建豐 桂明明 張永康 堯子釗 黃勝和 饒澤昌

關(guān)鍵詞：斑地錦；內(nèi)參基因；轉(zhuǎn)錄組測序；實時熒光定量PCR

斑地錦（EuphorbiamaculataL.）是一年生大戟科（Euphorbiaceae）大戟屬（EuphorbiaL.）草本植物，分布于江西、新疆、河南和浙江等地區(qū)[1]，具有清熱解毒功效，主治痢疾、泄瀉、尿血、便血、瘡癤癰腫、濕熱黃疸等[2]。斑地錦主要含有黃酮類、萜類、酚酸類和生物堿類等成分，目前已開發(fā)有腸炎寧片、三七止血片、瀉痢寧片等中成藥，其主要藥效成分之一為黃酮類物質(zhì)槲皮素[3]，研究槲皮素等藥用植物有效成分生物合成途徑基因及其調(diào)控已成為熱點之一[4]。

實時熒光定量PCR（RT-qPCR）是分子生物學(xué)中研究基因表達(dá)的重要工具之一，具有定量準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點，常用于基因表達(dá)定量分析[5]。然而，合適的內(nèi)參基因是獲得可信相對定量結(jié)果的前提[6]。研究表明，不經(jīng)篩選評價而以一種基因作為任何條件下的內(nèi)參基因可能會大大降低結(jié)果的精確度[7-8]。基因芯片及轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)等已被用于篩選傳統(tǒng)的或新的內(nèi)參基因，以利于RT-qPCR的開展[9]。轉(zhuǎn)錄組測序是對某一物種的mRNA進(jìn)行高通量測序，反映特定條件或特定時間點的基因表達(dá)情況，通過分析轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可以初步篩選出候選內(nèi)參基因[10]。目前評價內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的軟件較多，其中應(yīng)用較廣泛的有g(shù)eNorm、NormFinder和BestKeeper[11-12]。為篩選適用于斑地錦不同生長期不同組織RT-qPCR檢測的內(nèi)參基因，本研究以前期篩選出的內(nèi)參基因EmUBQ[13]和通過轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)初步篩選出的9個表達(dá)相對穩(wěn)定的基因EmRSZ21、EmSE、EmTRI1、EmGDI1、EmSYP22、EmLSM12、EmGBP、EmRPL7、EmUBC為候選內(nèi)參基因進(jìn)行RT-qPCR，分析其在營養(yǎng)生長期和生殖生長期的根、莖、葉、果中的表達(dá)模式，利用geNorm、NormFinder和BestKeeper等軟件綜合分析其表達(dá)穩(wěn)定性排名，并用EmC4H（槲皮素生物合成過程中的關(guān)鍵酶基因之一）進(jìn)行驗證，為斑地錦不同生長期基因組織特異性表達(dá)研究提供可靠的內(nèi)參基因。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1植物材料供試材料采自江西中醫(yī)藥高等專科學(xué)校實驗田，經(jīng)其藥學(xué)系中藥教研室鑒定為斑地錦。分別采集營養(yǎng)生長期（未開花且地上部分有2個及以上分枝）植株的根、莖、葉和生殖生長期（結(jié)3個及以上的果）植株的根、莖、葉、果，7種樣品皆為來源于3株以上植株的混合樣，樣品采集后立即置于-80℃冰箱備用。

1.1.2主要試劑與儀器RNA提取試劑盒（SpinColumnPlantTotalRNAPurificationKit）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRTReagentKitwithgDNAEraser）、熒光定量PCR試劑（PrimeScriptTMRTMasterMix）、Pfu酶（TransStartFastPfuDNAPolymerase）、Taq酶等購自寶生物工程（大連）有限公司。普通PCR儀（T100TMThermalCycler）、熒光定量PCR儀（CFX96Real-Time）等購自美國Bio-Rad公司。超微量分光光度計（NanoDropOne）購自美國ThermoScientific公司。引物合成、測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2方法1.2.1總RNA的提取和cDNA的合成參照試劑盒說明書，提取斑地錦不同生長期根、莖、葉、果總RNA，通過超微量分光光度計測定RNA濃度，并用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的質(zhì)量。cDNA的合成按相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.2候選內(nèi)參基因的篩選根據(jù)課題組斑地錦轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，選取FPKM值大于10且變異系數(shù)小于0.1的9個基因EmSE、EmUBC、EmGDI1、EmLSM12、EmGBP、EmSYP22、EmTRI1、EmRSZ21、EmRPL7以及課題組前期篩選的EmUBQ共10個基因為候選基因。

1.2.3引物設(shè)計及特異性檢測利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計9個候選內(nèi)參基因及EmC4H基因定量PCR引物，EmUBQ定量PCR引物參考文獻(xiàn)[13]，各引物序列見表1。為排除引物二聚體，檢驗引物特異性及非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物對結(jié)果的影響，用相應(yīng)引物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增。

1.2.4RT-qPCR溶解曲線分析以cDNA作為模板，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，加熱RT-qPCR產(chǎn)物從65℃到95℃，每隔0.5℃停留5s檢測1次熒光強(qiáng)度以獲得溶解曲線。RT-qPCR反應(yīng)體系（25μL）：2×TBGreenPremixExTaqII12.5μL，上游引物、下游引物各1μL（10μmol/L），cDNA溶液2μL，滅菌ddH2O8.5μL。擴(kuò)增程序：95℃5min；95℃30s，57℃30s，72℃30s，40個循環(huán)。

1.2.5候選內(nèi)參基因的篩選分別將各樣品總RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為模板，以各定量PCR引物進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。將Ct值按公式Q=E（minCt-sampleCt）（E為擴(kuò)增效率，默認(rèn)值為2；minCt為基因在各樣品中的最小Ct值；sampleCt為基因在某樣品中的Ct值）進(jìn)行計算，Q值導(dǎo)入geNorm和NormFinder軟件中進(jìn)行穩(wěn)定性分析。將各樣品得到的Ct值輸入BestKeeper軟件中，得到候選內(nèi)參基因的表達(dá)穩(wěn)定性變異系數(shù)（CV）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。最后運(yùn)用幾何平均值算法進(jìn)行綜合排名，得出最適合斑地錦不同生長期基因組織特異性表達(dá)研究的內(nèi)參基因。

1.2.6內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗證以綜合分析排名表達(dá)穩(wěn)定性最優(yōu)的基因為內(nèi)參基因，對槲皮素生物合成過程中的EmC4H基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，RT-qPCR方法參照1.2.4，結(jié)合EmC4H基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對內(nèi)參基因進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性驗證。

2結(jié)果與分析

2.1RNA提取與質(zhì)量檢測

所有樣品總RNA的OD260/OD280及OD260/OD230值，利用Nanodrop檢測均在2.0左右，說明所提取RNA純度較好。所有RNA樣品經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示28S和18S條帶明顯（圖1），說明總RNA完整性較好，均可用于后續(xù)試驗。

2.2內(nèi)參基因引物的特異性與熔解曲線分析

內(nèi)參基因引物PCR擴(kuò)增出單一且較亮的條帶，條帶大小與預(yù)期相符，無引物二聚體（圖2），引物特異性強(qiáng)，可用于后續(xù)檢測分析。對10個候選內(nèi)參基因在不同時期各個樣品的RT-qPCR分析表明，各基因Ct值均在22～31之間，各基因引物的熔解曲線均顯示單峰（圖3），表明RT-qPCR所用引物可與模板cDNA特異性結(jié)合并擴(kuò)增靶基因。

2.3候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性分析

2.3.1候選內(nèi)參基因的表達(dá)豐度分析10個候選內(nèi)參基因中，EmRSZ21的平均Ct值最大，為28.82，說明該基因的表達(dá)豐度最低；EmUBQ的平均Ct值最小，為22.26，說明該基因的表達(dá)豐度最高。10個候選內(nèi)參基因的平均Ct值利用Excel中的t檢驗分析顯著性差異，表達(dá)豐度排序依次是EmUBQ>EmGBP=EmGDI1>EmTRI1=EmRPL7=EmUBC>EmLSM12=EmSE>EmSYP22>EmRSZ21（圖4）。

2.3.2geNorm軟件分析geNorm軟件通過計算穩(wěn)定系數(shù)M，以確定表達(dá)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。該軟件以M=1.5作為臨界點，M值越小，穩(wěn)定性越好。10個候選內(nèi)參基因在不同組織中表達(dá)的M值均小于1.5，穩(wěn)定性排名為EmSE>EmUBC>EmGDI1>EmLSM12>EmUBQ>EmGBP>EmSYP22>EmTRI1>EmRSZ21>EmRPL7（表2）。

2.3.3NormFinder軟件分析NormFinder軟件與geNorm類似，也是基于各候選內(nèi)參基因的M，通過方差評估其表達(dá)穩(wěn)定性。NormFinder分析結(jié)果顯示，10個候選內(nèi)參基因在各組織中的表達(dá)穩(wěn)定程度存在差異，按M值大小排序依次為EmGDI1>EmUBQ>EmUBC>EmSYP22>EmSE>EmRPL7>EmLSM12>EmGBP>EmTRI1>EmRSZ21（表3）。

2.3.4BestKeeper軟件分析BestKeeper軟件直接根據(jù)各基因的Ct值，通過計算變異系數(shù)（CV）和標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）來評估各內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，且CV和SD值與基因的穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)，即穩(wěn)定的內(nèi)參基因具有較小的CV值和SD的值。BestKeeper分析結(jié)果顯示，10個候選內(nèi)參基因的SD值只有EmUBQ和EmGDI1小于1.0（默認(rèn)閾值）（表4）。

2.3.5綜合性分析BestKeeper分析結(jié)果與geNorm和NormFinder軟件分析結(jié)果差異明顯，采用幾何平均值算法進(jìn)行各候選內(nèi)參基因的綜合排名，內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好則幾何平均值越低。10個候選內(nèi)參基因在斑地錦不同生長期的不同組織中表達(dá)穩(wěn)定性綜合排名為EmGDI1>EmUBQ>EmSE>EmUBC>EmLSM12=EmGBP>EmTRI1>EmSYP22>EmRSZ21=EmRPL7（表5）。

2.4內(nèi)參基因穩(wěn)定性驗證

以EmGDI1為內(nèi)參基因，分析槲皮素生物合成過程中關(guān)鍵基因之一EmC4H的表達(dá)量差異，以驗證軟件分析結(jié)果的可靠性。結(jié)果表明，以EmGDI1為內(nèi)參基因，EmC4H在營養(yǎng)生長期的表達(dá)差異與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果趨勢完全一致，在生殖生長期的表達(dá)差異與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果趨勢基本一致（圖5）。因此，使用EmGDI1基因為內(nèi)參基因，能夠較為準(zhǔn)確地校準(zhǔn)斑地錦不同生長期不同組織中的RT-qPCR檢測結(jié)果。

3討論

隨著藥用植物分子生物學(xué)研究的不斷深入，藥用活性成分生物合成的關(guān)鍵酶基因表達(dá)與調(diào)控逐漸成為研究熱點。熒光實時定量PCR是檢測基因表達(dá)模式的高效手段之一，而具有合適、穩(wěn)定的內(nèi)參基因是熒光實時定量PCR的基礎(chǔ)。Act、GAPDH、UBQ、18SrRNA等傳統(tǒng)內(nèi)參基因被廣泛應(yīng)用，但在不同組織、不同生長期以及不同處理條件下均穩(wěn)定表達(dá)的內(nèi)參基因并不存在[7]，因此需要根據(jù)試驗條件的改變篩選出可靠的內(nèi)參基因，或應(yīng)用內(nèi)參基因組合以減少基因表達(dá)誤差[14]。基于轉(zhuǎn)錄組測序的RT-qPCR內(nèi)參基因篩選是近年來發(fā)展的一個新的有效策略，在釀酒酵母中已篩選鑒定出一套全新的內(nèi)參基因[15]，也已成功應(yīng)用于一些絲狀真菌、植物和動物中[16-18]，例如在馬爾尼菲青霉菌中，Actin基因在不同細(xì)胞類型中表達(dá)最穩(wěn)定[19]，而基于轉(zhuǎn)錄組測序獲得的FacpA和DigA基因在雙相轉(zhuǎn)換過程中表達(dá)穩(wěn)定性最高[20]。本研究根據(jù)斑地錦轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，篩選出EmSE、EmUBC、EmGDI1、EmLSM12、EmGBP、EmSYP22、EmTRI1、EmRSZ21、EmRPL7和課題組前期利用同源克隆法獲得的內(nèi)參基因EmUBQ，共10個候選內(nèi)參基因進(jìn)行RT-qPCR，分別用geNorm、NormFinder和BestKeeper軟件評價其在各生長期（營養(yǎng)生長期、生殖生長期）根、莖、葉和果中的表達(dá)穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，不同軟件對10個內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性的評估并不完全一致。EmUBQ在BestKeeper評價時表達(dá)最穩(wěn)定，而在geNorm和NormFinder評估中排序居中；EmSE在geNorm中排序最好，而在其他2種軟件中排序較差。這種現(xiàn)象在地菍（Melastomadodecandrum）[21]、扇脈杓蘭（Cypripediumjaponicum）[22]和陽桃（Averrhoacarambola）[23]等研究中也存在，可能是由于軟件的算法不同導(dǎo)致內(nèi)參基因穩(wěn)定性排序不同[24]。因此，需要幾何平均值算法進(jìn)行綜合分析得到最適合的內(nèi)參基因。同時，為了驗證篩選出的內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性，選取槲皮素生物合成過程中的關(guān)鍵基因EmC4H作為目的基因進(jìn)行了驗證，結(jié)果表明，以綜合分析結(jié)果最好的EmGDI1為內(nèi)參基因，EmC4H在斑地錦不同生長期各組織中的表達(dá)差異與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果趨勢一致[25]，進(jìn)一步證明EmGDI1內(nèi)參基因的可靠性。

GDI1是GDP解離抑制因子，屬于Rab蛋白家族，普遍表達(dá)在各種組織中，能與RabGTPase結(jié)合在膜上，參與調(diào)節(jié)囊泡形成、囊泡沿著微管和微絲運(yùn)輸以及膜融合等多個方面的膜運(yùn)輸過程。在甘藍(lán)型油菜新開發(fā)的內(nèi)參基因中，GDI1也是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因之一[26]。10個候選內(nèi)參基因中，EmUBQ表達(dá)也較穩(wěn)定，僅次于EmGDI1，如果采取內(nèi)參基因組合，則EmGDI1和EmUBQ較為合適。但是若試驗情況發(fā)生了變化，例如研究光照條件對斑地錦基因表達(dá)的影響等，可能需要重新篩選評估以獲得合適的內(nèi)參基因。

本研究根據(jù)課題組前期研究及轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)篩選出10個候選基因，結(jié)合RT-qPCR技術(shù)及geNorm、NormFinder和BestKeeper等內(nèi)參基因分析軟件對各候選基因進(jìn)行穩(wěn)定性分析，以槲皮素生物合成過程中的EmC4H基因進(jìn)一步驗證，確定EmGDI1為較適合斑地錦不同生長期不同組織基因表達(dá)模式研究的內(nèi)參基因，為斑地錦分子生物學(xué)研究提供了便利條件。