流式細胞術估測胡椒屬植物基因組大小方法的建立及應用

伍寶朵 胡麗松 馮楗雄 范睿 郭芬 吉訓志 郝朝運 閆林

關鍵詞：胡椒屬；流式細胞術；細胞核提取液；基因組大小

基因組大小是指某種生物中單倍體細胞核或配子體中的DNA含量，是物種特有的，稱為C值（C-value），常用重量皮克（10?12g）或核苷酸堿基對數量（basepair）來表示。基因組大小與物種的進化有較強的相關性，同時與生物學性狀也有一定的關系[1]。基因組大小測定的方法有多種，如Feulgen染色法、化學分析法及流式細胞術等。Feulgen染色法結果相對準確，但是操作過程繁瑣；化學分析法易受細胞周期影響，致使測定結果存在偏差[2]；而新技術流式細胞術（flowcytometry，FCM）具有瞬間準確分析大量細胞的特點，是一種測定基因組大小快速且有效的方法[3]。流式細胞術在人和動物的臨床和基礎研究中被廣泛應用，植物體內由于含有大量的多糖、多酚等次生代謝物質，嚴重影響了PI染料的熒光染色強度，降低了測定基因組大小的準確性[4]。因此明確適合測定物種流式細胞術的測定方法對該物種基因組大小研究至關重要。近年來，流式細胞術在植物中被廣泛應用。楊轉英等[5]采用流式細胞術測定不同菠蘿蜜株系基因組大小，發現不同菠蘿蜜株系之間基因組大小存在顯著差異，且濕苞株系大于干苞株系。柳覲等[6]利用改良OTTO細胞核提取液檢測出澳洲堅果基因組大小為1.872758×109bp，該研究發現運用流式細胞術進行澳洲堅果基因組C值測定準確可靠。

胡椒屬植物是胡椒科（Piperaceae）重要的泛熱帶組成成分，是基部被子植物中最大的屬之一[7]。約有1000多個種，主要分布于南亞、南美洲、中美洲等熱帶和亞熱帶地區。胡椒屬內有許多具有經濟價值和開發潛力的資源，例如胡椒（P.nigrum）、卡瓦胡椒（P.methysticum）和石楠藤（P.wallichii）等被用來入藥[8]，在亞洲東南部，人們常將蔞葉（P.betle）和檳榔果連同石灰一起咀嚼幫助消化。胡椒野生近緣種眾多，部分資源具有優良性狀，例如黃花胡椒（P.flaviflorum）具有較強的抗瘟病性[9]。大葉蒟（P.laetispicum）具有較長的花穗，石楠藤具有較強的抗寒性等[10]。胡椒是人們喜愛的調味品，素有“香料之王”的美譽。原產于印度，胡椒自1947年引入中國，目前種植面積達3萬hm2，年總產量超過3萬t，位居世界第5位。我國胡椒栽培品種以熱引1號（P.nigrumcv.Reyin1）為主，存在栽培品種單一和抗逆性弱的問題，嚴重限制了我國胡椒產業的良性發展[11-12]。因此亟待開展胡椒資源挖掘和創新利用工作。胡椒是四倍體植物，染色體數為2n=4x=52[13]。JOSE等[14]報道胡椒屬不同資源具有不同染色體數，且胡椒屬植物具有較小的染色體長度（0.56～2.41μm），而染色體倍性分析需要較強的實驗技術，利用流式細胞術可快速測定胡椒屬資源基因組大小，為染色體倍性估測和分析提供基礎。

本研究以4份不同來源地胡椒屬種質為材料，通過篩選6種細胞核提取液和不同部位葉片，明確適合胡椒屬基因組大小的流式細胞術測定方法。利用篩選出的適合胡椒流式細胞術測定的方法，以黃瓜為標樣，測定22份胡椒屬資源的基因組大小。本研究可為胡椒屬資源基因組大小測定提供方法，也將為胡椒屬資源變異、種質資源評價及遠源雜交等研究提供技術基礎。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為胡椒屬種質，胡椒屬種質葉片取材于中國熱帶農業科學院香料飲料研究所的農業農村部萬寧胡椒種質資源圃。分別取4份來源地不同的胡椒屬種質嫩葉用于細胞核提取液篩選（表1）；取4份種質的下位葉、中位葉、倒一葉用于葉片部位篩選；22份胡椒屬資源用于測定基因組大小。以黃瓜（CucumissativusL.）為標樣[15]，將黃瓜種子播種于15cm×20cm培養盆中，并在人工氣候室培育，待長出真葉后取嫩葉用于試驗。

1.2方法

1.2.1細胞核提取液及DNA熒光染料的配制選取4種已報道的細胞核提取液（Otto提取液[5]、Tris提取液[16]、LB01提取液[4]和WPB提取液[17]）、1種改良提取液[18]和1種PI試劑盒（廣州吉源生物科技有限公司），細胞核提取液具體配方見表2。提取液配制完成后過濾、滅菌，并置于4℃冰箱內保存。熒光探針是碘化丙啶（PI），PI工作液中碘化丙啶的濃度為1mg/mL。

1.2.2細胞核懸浮液的制備和染色剪取約20～40mg胡椒葉片放入60mm培養皿中，加入預冷的細胞核提取液500μL，讓提取液充分浸沒葉片，用厚度為0.08mm鋒利的雙面刀片迅速切成碎片，傾斜放置5min，再用400～600目濾膜過濾至流式細胞儀專用上樣管中，在濾液中加入2mL細胞核提取液或緩沖液、6μLRNaseA（終濃度為40μg/mL）和20μLPI染液，避光靜置30min。

1.2.3流式細胞術檢測將制備好的細胞核懸浮液采用德國Partec公司CyFlow?Cube6流式細胞儀檢測。流式細胞儀的氬離子激光發射器的激發光波長為488nm，檢測通道為FL2通道590/50[488]，利用流式細胞儀隨機自帶軟件CyFlowCube15-CFG收集至少5000個細胞，變異系數（coefficientofvariation，CV）控制在6%以內；每個樣本重復測定5次。

1.3數據處理

利用FlowJo-V10軟件分析數據，以標樣基因組大小和出峰位置為對照，依據測定樣品出峰位置計算出其基因組大小（基因組C值），計算公式為：待測樣本基因組大小=參考樣本基因組大小（待測樣本熒光均值/參考樣本熒光均值）；使用SPSS16.0軟件進行數據統計分析。

2結果與分析

2.1細胞核提取液的篩選

比較6種細胞核提取液流式細胞術測定結果可知（圖1），以Otto提取液為細胞核提取液時，只有墨西哥胡椒能檢測出信號峰，熱引1號胡椒、黃花胡椒和卡瓦胡椒3份種質不能檢測出信號峰。以Tris提取液為細胞核提取液時，熱引1號胡椒和墨西哥胡椒能檢測出信號峰，但是信號峰碎片較多，CV值均大于6，黃花胡椒和卡瓦胡椒不能檢測出信號峰。以LB01提取液為細胞核提取液時，熱引1號胡椒、墨西哥胡椒和卡瓦胡椒均能檢測出信號峰，其中熱引1號胡椒和卡瓦胡椒的信號峰都是碎片較多，CV值大于6，墨西哥胡椒信號峰碎片相對少一些，黃花胡椒不能檢測出信號峰。以WPB提取液為細胞核提取液時，熱引1號胡椒和墨西哥胡椒均能檢測出信號峰，但是檢測出的信號峰都是碎片較多，CV值大于6，黃花胡椒和卡瓦胡椒不能檢測出信號峰。以PI試劑盒為細胞核提取液時，墨西哥胡椒和卡瓦胡椒能檢測出信號峰，但是卡瓦胡椒信號峰碎片稍多，熱引1號胡椒和黃花胡椒不能檢測出信號峰。以改良提取液為細胞核提取液時，4份種質均能檢測出完整信號峰，CV值小于6。可見，改良提取液是適合胡椒屬種質流式細胞術的細胞核提取液。

2.2葉片取樣部位的篩選

為選擇適合胡椒屬種質資源流式細胞檢測的最佳部位葉片，利用篩選出的改良提取液分別對黃花胡椒、熱引1號胡椒、卡瓦胡椒和墨西哥胡椒的下位葉（superiorleaf）、中上位葉（inferiorleaf）和倒一葉（invertedoneleaf）進行流式細胞術檢測（圖2），結果表明4份胡椒種質使用下位葉和上位葉檢測時，少數不能形成完整的信號峰，多數形成了完整的信號峰，但是與倒一葉相比，下位葉和上位葉形成的信號峰碎片較多，細胞核收集偏少。可見，倒一葉是適宜胡椒屬流式細胞術的葉片采樣部位。

2.3胡椒屬資源C值測定

通過比較待測胡椒資源樣品與黃瓜樣品峰值的倍數關系（圖3），計算出胡椒資源的基因組大小（表3）。以熱引1號胡椒為例，其熒光強度是6596，標樣黃瓜的熒光強度為3184，ARUMUGANATHAN等[15]報道利用流式細胞術測定的黃瓜基因組大小為367Mb，依據基因組大小計算公式，計算出熱引1號胡椒基因組大小為759.69Mb，HU等[19]通過全基因組測序估測的熱引1號胡椒基因組大小為761.2Mb，二者誤差較小，說明該方法準確可靠。利用同樣的方法，估測了22份胡椒資源基因組大小，檢測的胡椒種質基因組大于900Mb的種質有石楠藤、卡瓦胡椒和山蒟；基因組在600～800Mb的種質有熱引1號、柬埔寨小葉種、班尼約爾1號、古晉、Aman胡椒、EMAS胡椒、73F5、雜交種、復毛胡椒、華山蒟、蔞葉和篳菝；基因組小于600Mb的種質有海南蒟、假蒟、大葉蒟、尖峰嶺胡椒、斜葉蒟、黃花胡椒和墨西哥胡椒。綜上可見，胡椒屬不同種質間基因組大小差異較大。

3討論

植物體內含有大量的多糖、多酚等次生代謝物質，嚴重影響了PI染料的熒光染色強度，降低了測定基因組大小的準確性。胡椒屬植物是遍布于熱帶地區的重要作物，胡椒葉片具有較厚的蠟質層，葉片硬度較高，細胞中具有較復雜的次生代謝物質，研究表明胡椒葉中DPPH清除能力、多酚含量及氧自由基清除能力均高于胡椒果實，可能含有高抗氧化因子[20]。本研究嘗試采用已報道植物流式細胞術測定細胞核提取液（Otto、Tris、LB01、WPB提取液和PI試劑盒）測試胡椒屬植物，均不能得到滿意效果，因此，明確適合胡椒屬植物流式細胞術的細胞核提取液及測定方法對胡椒屬植物基因組大小研究至關重要。

本研究發現，與Otto、Tris、LB01、WPB提取液和PI試劑盒相比較，以改良提取液為細胞核提取液檢測胡椒屬植物時，噪音峰能夠與信號峰較好分離，碎片相對較少，CV值也符合流式細胞術分析要求，是適合胡椒屬植物基因組大小測定的細胞核提取液。本研究選用的6種提取液配方差異較大，以改良提取液檢測胡椒屬植物效果最好，LB01提取液效果次之。比較改良提取液和LB01提取液配方發現，二者共有的成分有Tritonx-100、Cl-和Tris，改良提取液特有的成分是NaHSO3，而LB01提取液特有的成分是spermine·4HCl。分析另外3種已知配方提取液發現，Tritonx-100、Cl-和Tris這3種成分在Tris和WPB提取液中也同時存在。說明NaHSO3和spermine·4HCl可能適用于作為胡椒屬植物流式細胞術檢測的提取液配方，尤其是NaHSO3更適合，當然，它們需與其他成分相互作用才能更好地發揮作用。本研究只測試了改良提取液在胡椒屬植物中的應用，還適用于哪些植物需要進一步試驗證明。

分析不同種質信號峰檢測結果發現，不同種質檢測出信號峰的難易程度差異較大。如：熱引1號胡椒在2種提取液中能檢測出完整信號峰，3種提取液中能檢測的信號峰不能與噪音峰分離；黃花胡椒除在改良提取液中能檢測出完整信號峰，其他的均不能；而墨西哥胡椒在4種提取液中均能檢測出完整信號峰，另外2種的信號峰不能與噪音峰分離。說明利用流式細胞術檢測胡椒屬內不同種資源時也具有特異性，這可能與不同種資細胞內次生代謝物質不同有關。

本研究選用的栽培種胡椒有7份。古晉、Aman和EMAS胡椒都是馬來西亞育成品種，其中EMAS胡椒是由Balancotta（印度品種）和古晉雜交并回交選育而成，Aman胡椒是由從哥斯達黎加引種的品種CATIERow1-1的無性系選育而來[21]。經測試發現，古晉、Aman和EMAS胡椒的基因組大小分別為708.31、667.94、719.32Mb；熱引1號是由從印度尼西亞引種的品種南榜的無性系經長期選育而來，班尼約爾1號是從印度引進的品種，73F5是熱引1號和班尼約爾1號的雜交后代，柬埔寨小葉種是從柬埔寨引進的小葉種胡椒品種。熱引1號、柬埔寨小葉種、班尼約爾1號和73F5的基因組大小分別為759.69、759.69、770.70、785.38Mb。綜上可見，本研究中測定的7份栽培種胡椒的基因組大小存在差異。JOSE等[14]報道栽培種班尼約爾1號、Cheriakaniakadan和Karimunda的總染色體長度分別為67.04、51.48、56.66μm，因此不同栽培種之間基因組大小也會存在差異。本研究中，來源于馬來西亞的品種與來源于印度尼西亞、印度、柬埔寨的品種基因組大小也具有差異。

JOSE等[14]認為胡椒屬資源的染色體基數是n=13（P.cubeba除外），研究發現，栽培胡椒、蔞葉、蓽菝和卡瓦胡椒的染色體數分別為2n=4x=52、2n=2x=52、2n=2x=52和2n=10x=130[14，22-23]。本研究測定卡瓦胡椒基因組大小大于900Mb，明顯大于另外3種染色體數為52的種質，此外，石楠藤和山蒟的基因組也大于900Mb，依據前面結論推測石楠藤和山蒟的染色體條數應該是大于52且為13的倍數[14]。本研究中7份栽培胡椒染色體數都是52，基因組大小范圍為667.94～785.38Mb，SAMUEL等[22]研究中報道，3份染色體數為52的種質（P.nigrum、P.ornatum和P.porphyrophyllum）染色體長度為52.32～72.18μm，其中P.nigrum的染色體長度最長，推斷基因組大小在600～800Mb范圍內的種質染色體數可能也是52條。雜交種是一個未知種，從表型和進化上來看，該種具有與栽培胡椒和黃花胡椒相近的表型，本研究發現，其基因組大小幾乎等于栽培胡椒和黃花胡椒的平均值，因此推測雜交種可能是栽培胡椒和黃花胡椒的雜交后代。