蘭科蒙自蘭快速繁殖和試管開花的研究

邵麗 曾歆花 黃衛(wèi)昌

關鍵詞：蒙自蘭；無菌播種；快速繁殖；試管開花

蒙自蘭[Mengziafoliosa（King&Pantl.）W.C.Huang，Z.J.Liu&C.Hu]，是蘭科蒙自蘭屬多年生草本植物，主要分布于中國云南南部、泰國的山坡林下。基于前期形態(tài)學和分子系統(tǒng)學的分析結果，華白及[Bletillasinensis（Rolfe）Schltr.]區(qū)別于蘭科龍嘴蘭族的白及屬和其他屬植物。因此，以華白及作為模式種，建立蘭科新屬——蒙自蘭屬[1]。當前，由于生境破壞和人為干擾，蒙自蘭野外居群和植株數(shù)量極少，目前已被列為國家保護的瀕危植物[2]。此外，蒙自蘭在引種栽培和繁育過程中也存在生長緩慢、開花少和結實困難等問題，這極不利于蒙自蘭野外種群的恢復和重建。蘭科植物種子數(shù)量巨大，一個果莢內含有成千上萬粒種子，通過無菌播種技術能快速繁殖大量種苗；此外，通過試管開花技術能打破天氣、季節(jié)和地域的限制，可提高植物開花率和結實率，從而滿足植物資源保護和可持續(xù)開發(fā)利用所需的植物材料。目前，國內外對蘭科植物組培快繁和試管開花的研究有較多報道，如春蘭[3]、建蘭[4]、寒蘭[5]、鐵皮石斛[6]、梳唇石斛[7]、春石斛[8]、虎舌蘭[9]、報春石斛[10]和扇形文心蘭[11]等。而瀕危蘭科植物蒙自蘭由于稀缺的野外材料，其無菌播種繁殖、藥效和試管開花等相關研究均處于空白狀態(tài)。為加快該物種的保護和開發(fā)利用，亟需開展蒙自蘭的快速繁育和試管開花研究。

本研究通過研究不同濃度6-BA、NAA、營養(yǎng)物質對蒙自蘭生長的影響，以及6-BA、NAA、TDZ、2，4-D、PP333對試管開花的影響，篩選出最佳培養(yǎng)基配方，建立一套高效的快繁技術體系。不但可以為該物種的種群回歸和恢復等保育生物學研究提供幫助，還能為其開花調控機理研究和縮短育種周期提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

供試材料取自云南人工授粉的蒙自蘭未開裂果莢。

1.2方法

1.2.1種子消毒滅菌將蒙自蘭蒴果在流水下沖洗0.5h，然后用吸水紙將種莢表面水分吸干后轉入無菌操作臺。參照王麗等[12]的方法，用75%酒精浸泡30s，然后用含少許吐溫20的0.1%升汞溶液震蕩消毒10～15min，無菌水沖洗5遍，濾紙吸干表面水分后待用。

1.2.2種子萌發(fā)（1）不同成熟度種子的萌發(fā)。播種不同成熟程度的蒴果，成熟度為從自交到播種的天數(shù)分別為85、95、105、115d。剖開消毒過的蒴果，將種子均勻接種于含0.5mg/LNAA、30g/L蔗糖、6.5g/L瓊脂、0.2g/L活性炭，pH為5.8的1/2MS培養(yǎng)基上。共4組處理A1～A4，每個處理接種10瓶，每瓶約100粒種子，分別記錄萌發(fā)時間和統(tǒng)計種子萌發(fā)數(shù)，并計算萌發(fā)率。萌發(fā)率=萌發(fā)種子數(shù)量/接入種子總數(shù)×100%。

（2）不同培養(yǎng)基對種子萌發(fā)的影響。基本培養(yǎng)基以MS和1/2MS為對照，添加不同濃度的NAA和6-BA，采用L16（43）正交表設計（表1）。設置16組樣本B1～B16，每組接種5瓶，每瓶100粒種子，待種子萌發(fā)后統(tǒng)計萌發(fā)種子數(shù)，計算萌發(fā)率。

1.2.3叢芽增殖將萌發(fā)后長小葉的蒙自蘭小苗接種至不同培養(yǎng)基，基礎培養(yǎng)基為1/2MS，添加不同濃度NAA和6-BA，NAA的濃度梯度設置為0、0.2、0.5mg/L，6-BA的濃度梯度設置為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mg/L，不添加任何激素的作為對照組（CK）。15個處理C1～C15，每組處理10個重復150芽，60d后統(tǒng)計增殖率。

1.2.4生根壯苗將增殖后約同等大小的蒙自蘭小苗接種至不同的生根壯苗培養(yǎng)基。基礎培養(yǎng)基是1/2MS，添加不同濃度生長素和營養(yǎng)物勻漿，設置L16（43）正交試驗表（表2）。不添加任何生長調節(jié)劑和營養(yǎng)物的培養(yǎng)基作為對照組（CK），16個處理D1～D16，每組10個重復共100苗，60d后測量生根數(shù)量、根長和苗高[13]。

1.2.5試管開花將叢芽增殖后約同等大小的蒙自蘭幼苗接種至不同的催花培養(yǎng)基。以1/2MS為基礎培養(yǎng)基，添加不同濃度的細胞分裂素6-BA（1.0、2.0mg/L）、TDZ（0.1、0.5mg/L）和生長素NAA（0.2、0.5mg/L）、2，4-D（0.2、0.5mg/L），兩兩配比，另添加多效唑PP3331.0mg/L，以不添加PP333的處理作為對照組（CK），16個處理E1～E16，每組5個重復共25苗，90d后統(tǒng)計開放花朵數(shù)，計算開花率和正常花率。開花率=開放花朵數(shù)/接種外植體數(shù)×100%；正常花率=正常花朵數(shù)/開放花朵數(shù)×100%。

1.2.6培養(yǎng)條件通過預試驗發(fā)現(xiàn)蒙自蘭從萌發(fā)到幼苗生長各階段在1/2MS培養(yǎng)基上均生長良好，因此設置叢芽增殖、生根壯苗、試管開花試驗的基本培養(yǎng)基均為1/2MS。各培養(yǎng)基中均加入0.2g/L活性炭、6.5g/L瓊脂、30g/L蔗糖，催花培養(yǎng)基中另外添加30g/L香蕉勻漿，pH均調為5.8。培養(yǎng)室溫度控制在（25±1）℃，光照時長為12h/d，光照強度為2000lx。

1.3數(shù)據(jù)處理

使用正交設計助手Ⅱv3.1軟件設置正交試驗表，運用SPSS16.0軟件進行數(shù)據(jù)處理。采用單因素方差分析比較不同種子成熟度對種子萌發(fā)率的影響；采用多因素方差分析比較不同培養(yǎng)基對種子萌發(fā)率，以及不同激素濃度配比對叢芽增殖率、根長、苗高、根數(shù)量、花芽分化率和正常開花率的影響。采用TukeyHSD方法比較不同實驗組的顯著性差異（P<0.05）。

2結果與分析

2.1不同成熟度對蒙自蘭種子萌發(fā)的影響

蒙自蘭種子的成熟度對其萌發(fā)率有顯著影響（表3）。授粉后85～105d的種子呈白色，萌發(fā)所需時間均在30d左右，隨著種子成熟時間的延長其萌發(fā)率遞增，A3與A1、A2間呈顯著差異。105d的種子萌發(fā)率最高為87.00%，顯著高于115d的種子萌發(fā)率，且萌發(fā)出原球莖后葉片分化快。授粉115d的種子顏色略深，萌發(fā)時間最短，但萌發(fā)率明顯降低，且萌發(fā)后的原球莖葉分化率低。

2.2不同培養(yǎng)基對蒙自蘭種子萌發(fā)的影響

成熟度為105d的蒙自蘭種子播種于不同培養(yǎng)基上，供試的16組培養(yǎng)基均能萌發(fā)，但各組萌發(fā)率有顯著差異（表4）。B15處理的培養(yǎng)基（1/2MS+0.6mg/LNAA+1.0mg/L6-BA）的萌發(fā)率最高，為97.00%。在16組處理中，當NAA濃度相同時，萌發(fā)率隨6-BA濃度的升高而增加；而當6-BA濃度相同時，較低NAA濃度的萌發(fā)率較高，其中B9和B15的萌發(fā)率接近，且B9的萌發(fā)率僅次于B15；當NAA濃度為1.0mg/L時，MS培養(yǎng)基的萌發(fā)率較低，B4和B8的萌發(fā)率分別為5.00%和9.40%；當6-BA濃度為1.5mg/L時，1/2MS培養(yǎng)基的萌發(fā)率有所降低。從表5中可知，基礎培養(yǎng)基、NAA、6-BA對蒙自蘭種子萌發(fā)的影響均存在顯著性差異（P<0.05），對比三因素的F值發(fā)現(xiàn)，影響種子萌發(fā)率的大小順序為基礎培養(yǎng)基＞NAA＞6-BA。

2.3不同激素濃度對蒙自蘭叢芽增殖的影響

蒙自蘭種子播種后約30d萌發(fā)形成原球莖。將其轉接至增殖分化培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)原球莖會分化成苗，但增殖形成的愈傷組織并未分化且逐漸發(fā)黃死亡。因此在原球莖分化出葉片后再進行叢芽增殖處理。將1/2MS作為基本培養(yǎng)基，觀察NAA和6-BA對叢芽增殖的影響（表6）。結果顯示，各處理的蒙自蘭叢芽均具有不同程度的增殖，未添加NAA和6-BA的CK組的增殖率顯著低于添加激素處理組；C2和C4顯著高于其他處理，2組處理均未添加NAA；C4處理的增殖率最大，為47.33%，其6-BA添加濃度為2.0mg/L；添加激素處理組中，C5的增殖率最低為18.01%，其6-BA添加濃度為2.5mg/L，C4和C5處理均未添加NAA。主體效應分析顯示（表7），不同濃度的NAA對叢芽增殖的影響差異不顯著（P>0.05），而不同濃度的6-BA對叢芽增殖的影響差異顯著（P<0.05）。

2.4不同濃度NAA及營養(yǎng)物對蒙自蘭生根壯苗的影響

將蒙自蘭叢芽接種到不同培養(yǎng)基上，觀察NAA和不同營養(yǎng)物質對蒙自蘭生根壯苗的影響。結果表明，D15培養(yǎng)基1/2MS+1.0mg/LNAA+30g/L土豆勻漿處理的蒙自蘭生長狀況最佳，苗高、根長和根的數(shù)量均顯著高于其他處理（表8）。由表9可知，各因素間呈顯著性差異（P<0.05）。營養(yǎng)物對蒙自蘭根長和根數(shù)量的影響大于NAA，30g/L土豆勻漿處理的生根效果最佳，其次是濃度10g/L，土豆勻漿超過30g/L反而抑制生根；30、50ml/L椰子水和100g/L香蕉勻漿也有利于生根，但效果比土豆勻漿差。NAA對苗高的影響大于營養(yǎng)物，1.0mg/L的NAA有利于幼苗莖葉生長，D14、D15處理組的苗高顯著高于其他處理。

2.5不同激素濃度對蒙自蘭試管開花的影響

在蒙自蘭生根壯苗試驗中發(fā)現(xiàn)，添加30g/L香蕉勻漿的培養(yǎng)基上幼苗有部分開花現(xiàn)象，故在試管開花試驗培養(yǎng)基中以添加30g/L香蕉勻漿來促進其開花，CK組不添加。將生長健壯、苗高基本一致的蒙自蘭幼苗接種到不同培養(yǎng)基上，觀察不同激素對幼苗花芽分化和開花的影響。從表10可知，在添加PP333的條件下，E2處理的花芽分化率和正常開花率均顯著高于其他處理，是最優(yōu)催花培養(yǎng)基。觀察花芽分化情況發(fā)現(xiàn)（圖1），E1、E2、E3培養(yǎng)基的花梗均較長且大多植株開2～4朵花（圖1A），而其他培養(yǎng)基處理的開花株均為1梗1朵（圖1B）；與E1對比發(fā)現(xiàn)，未添加PP333的CK培養(yǎng)基幼苗無花芽分化；當添加相同濃度的6-BA時，除E6未開花，NAA與6-BA組合處理的花芽分化率顯著優(yōu)于2，4-D與6-BA組合處理，且花朵畸形率也較低；含2，4-D的培養(yǎng)基處理中，除E16外，花芽分化率均顯著低于其他處理，且花朵畸形率較高；TDZ對蒙自蘭花芽分化也有促進作用，0.5mg/LTDZ處理的作用效果明顯高于0.1mg/LTDZ，但其花朵畸形率高于含6-BA的培養(yǎng)基處理，可見添加TDZ會增加蒙自蘭花朵畸形率，而2，4-D對蒙自蘭花芽分化有一定的抑制作用。添加0.5mg/LTDZ和0.5mg/LNAA的E12處理培養(yǎng)基上幼苗的開花狀態(tài)為花梗短且花瓣卷曲（圖1C）；添加0.1mg/LTDZ和0.5mg/L2，4-D的E14處理培養(yǎng)基上幼苗的開花狀態(tài)為花梗短且花朵呈閉合狀態(tài)直至凋謝（圖1D）。

3討論

蒙自蘭在野生狀態(tài)和人工栽培條件下生長緩慢，利用無菌種子培養(yǎng)可有效解決分株繁殖系數(shù)低、繁殖周期長的問題。本研究表明，在1/2MS培養(yǎng)基上，蒙自蘭從種子萌發(fā)到壯苗的各階段均能較好生長，生長調節(jié)劑對生長各階段起到的促進或抑制作用各有差異。

種子成熟度對種子萌發(fā)有著重要影響[14]。通過解剖鏡觀察種子發(fā)現(xiàn)，蒙自蘭105d的種子胚圓潤飽滿（圖1E），而115d的種子胚縮小、種皮變厚（圖1F）。用TTC溶液對種子進行染色發(fā)現(xiàn)，85、95、105d的種子很快被染色，而115d的種子只有少數(shù)種子被染色，且染色所需時間較長。因此，115d的種子萌發(fā)率低可能與種子活性低、胚齡長或種皮變厚有關。蔣雅婷等[15]研究發(fā)現(xiàn)，無距蝦脊蘭種子胚齡為120d時萌發(fā)率最高，隨后逐漸降低，到210d時，萌發(fā)率降為0。蒙自蘭野外植株數(shù)量少，組培苗養(yǎng)護難度高且開花難，目前能得到的果莢數(shù)量有限，因此尚未觀察到其果莢自然開裂的時間和狀態(tài)。種子在115d以后的萌發(fā)率是否會降到0以及果莢自然開裂的時間后續(xù)還需進一步試驗加以驗證。1/2MS培養(yǎng)基的種子萌發(fā)率均較高，說明低鹽分培養(yǎng)基有利于蒙自蘭種子萌發(fā)，這與漆子鈺[3]對春蘭種子的萌發(fā)研究結果一致。NAA和6-BA的不同濃度組合也影響種子萌發(fā)，1/2MS+0.6mg/LNAA+1.0mg/L6-BA的培養(yǎng)基萌發(fā)率最高為97.00%，而105d的種子在1/2MS+0.5mg/lNAA培養(yǎng)基中的萌發(fā)率為87.00%，在NAA濃度接近的情況下，其萌發(fā)率相對較低的原因可能是未添加6-BA。可見，培養(yǎng)基配方對蒙自蘭種子萌發(fā)起著關鍵作用。

蒙自蘭種子萌發(fā)后原球莖會快速進入葉分化階段，在分化之前可以通過添加生長調節(jié)劑對原球莖進行增殖處理，但增殖出的愈傷組織未能分化成苗，可能增殖出的愈傷為非胚性愈傷組織。而對已分化出葉片的幼苗進行叢芽增殖發(fā)現(xiàn)均為有效增殖，且叢芽健壯，未發(fā)現(xiàn)徒長、弱化或玻璃化現(xiàn)象。在植物組織培養(yǎng)中，細胞分裂素可刺激細胞分裂，促進芽分化和生長[3]。不同品種蘭科植物所需的生長調節(jié)劑種類、組合和濃度也不同。蒙自蘭叢芽增殖試驗結果表明，2.0mg/L6-BA對叢芽增殖效果最佳，這與滇金石斛[13]、血葉蘭[16]叢芽增殖所需的分裂素一致，但濃度不同，且滇金石斛還需添加NAA，血葉蘭還需添加NAA和TDZ。而杜鵑蘭叢生芽增殖需要2.0mg/LTDZ和0.2mg/LIAA[17]，與蒙自蘭不同。生長素NAA能促進試管苗生長、生根和壯苗。除生長調節(jié)劑外，一些天然營養(yǎng)物質，如椰青、香蕉、土豆、蘋果、酵母浸出物等，對某些植物器官組織有一定的促進生長作用。椰青、香蕉和土豆被廣泛應用于蘭科植物的組織培養(yǎng)。1.0mg/LNAA和30g/L土豆為蒙自蘭幼苗生根壯苗的最優(yōu)組合，這與三褶蝦脊蘭[18]幼苗生長所需的添加物和生長調節(jié)劑種類一致，三褶蝦脊蘭需要100g/L土豆泥和0.1mg/LNAA。

蒙自蘭試管開花試驗發(fā)現(xiàn)，生長調節(jié)劑和營養(yǎng)物質對幼苗開花均有一定促進作用。部分開花株植株矮小，且球莖大、葉片寬，可能是PP333抑制植株莖的生長，刺激其提前開花的原因。這與李杰等[19]在霍山石斛花芽誘導試驗中TDZ與PP333組合處理的畸形花比率高的結果一致。蒙自蘭幼苗在90d內陸續(xù)開花，這與梳唇石斛[7]試管開花狀態(tài)一致，但梳唇石斛開花可持續(xù)半年以上。蒙自蘭單朵花期在7～10d左右，90d后花芽分化結束，這可能與培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的消耗有關。本研究結果顯示，蒙自蘭試管開花的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA+1.0mg/LPP333+30g/L香蕉。6-BA與NAA組合處理的誘導效果最佳，這與梳唇石斛[7]的開花誘導結果一致。霍山石斛[19]在花芽誘導培養(yǎng)基中也添加了香蕉勻漿物。但蒙自蘭開花時間不統(tǒng)一，個別植株從播種到開花僅需145d。蘭科植物開花受多種因素的影響，除培養(yǎng)基成分外，還受環(huán)境因子的調控，如溫度、光照強度、光照時長等[20]。本研究取得蒙自蘭試管開花的初步結果，但如何提高試管開花率和花朵品質，以及誘導開花的機理仍有待進一步探索。