基于SSR標記的西南地區野生帶葉兜蘭資源遺傳多樣性分析

徐 言，陳之光，徐玉鳳，葛 紅，楊樹華，趙 鑫，寇亞平，于曉南，賈瑞冬*

基于SSR標記的西南地區野生帶葉兜蘭資源遺傳多樣性分析

徐 言1,2，陳之光2，徐玉鳳2，葛 紅2，楊樹華2，趙 鑫2，寇亞平2，于曉南1*，賈瑞冬2*

1. 北京林業大學園林學院/花卉種質創新與分子育種北京市重點實驗室/國家花卉工程技術研究中心/城鄉生態環境北京市實驗室，北京 100083；2. 中國農業科學院蔬菜花卉研究所/農業農村部花卉生物學與種質創制重點實驗室（北方），北京 100081

帶葉兜蘭[(Lindl. ex Hook. f.) Stein]具有較高的觀賞價值，是中國珍稀瀕危保護植物。為了研究中國西南地區野生帶葉兜蘭資源的遺傳特性，促進野生帶葉兜蘭資源的保護和利用，本研究利用SSR分子標記技術對中國西南地區廣西、云南、貴州3省（區）收集的6個居群190份帶葉兜蘭資源進行遺傳多樣性和群體遺傳結構分析。結果表明：從115對引物中共篩選出10對擴增效果好的引物，10對SSR引物在190份帶葉兜蘭中共檢測到50個等位基因，平均每個位點等位基因（N）為5個，平均有效等位基因數（N）為2.4835個；平均Shannon信息指數（）為0.8592，平均觀測雜合度（H）為0.4518；平均期望雜合度（H）為0.4387，平均Nei’s基因多樣性指數（）為0.4370，平均多態信息含量（PIC）為0.3996。6個野生帶葉兜蘭居群的N為2.8000～4.3000，N為1.9655～2.4060， H為0.3891～0.4839，H為0.3795～0.4683，Shannon信息指數（）為0.6584～0.8369，Nei’s基因多樣性指數（）為0.3648～0.4382。廣西雅長（GYC）和貴州萬峰湖（QWF）居群具有較高的遺傳多樣性（=0.4382,=0.4276），廣西木論（GML）居群具有最低的遺傳多樣性（=0.3648）。分子方差分析（AMOVA）結果表明，遺傳變異主要發生在居群內個體間（94%），而居群內遺傳分化很?。?%）?；谶z傳距離構建的UPGMA聚類分析結果顯示，6個居群遺傳距離較小，居群間遺傳距離和地理位置不完全相關。Structure和主坐標分析結果表明，居群間存在均質化現象，無明顯類群劃分。綜上，帶葉兜蘭資源遺傳多樣性較為豐富，研究結果可為中國西南地區野生帶葉兜蘭資源的保護和利用提供理論依據。

帶葉兜蘭；野生居群；SSR標記；遺傳多樣性；遺傳結構

帶葉兜蘭[(Lindl. ex Hook. f.) Stein]為蘭科（Orchidaceae），杓蘭亞科（Subfam. Cypripedioideae）兜蘭屬（Pfitz.）植物，自然花期3—5月，主要分布于中國、印度東北部、越南、老撾和泰國，其中在中國分布于廣西北部至西部、貴州西南部、云南東南部等地[1]。由于生境破壞、過度采集和非法貿易等情況嚴重，使帶葉兜蘭野生資源遭受嚴重的威脅。目前帶葉兜蘭野生種已被列入《野生動植物瀕危物種國際貿易公約》（CITES）附錄Ⅰ的保護范圍，絕對禁止在國際上貿易[2-4]。它還被收錄于《中國高等植物紅色名錄》，評估等級為易危（VU），且有野生帶葉兜蘭居群呈現破碎化現象的報道[5-6]。此外帶葉兜蘭是一個變異幅度很大的種，在花的結構上有很多變化[1]。因此，利用分子技術對帶葉兜蘭野生資源及其遺傳狀況進行研究具有重要的意義。

分子標記技術在蘭科植物研究中已被廣泛使用。在兜蘭屬植物研究中，有基于ITS序列[7-8]、RAPD[9]和SRAP[10]標記的種間親緣關系及其分類歸屬研究，有基于cpDNA[11]分子標記的系統進化研究，有基于轉錄組數據開發SSR引物[12-13]的研究，以及基于SRAP[14-16]、ISSR[16-18]和SSR[12]標記的遺傳多樣性研究，其中關于帶葉兜蘭的研究報道較少，僅見基于SRAP標記對廣西木論自然保護區的40份野生帶葉兜蘭資源[14]和基于SSR標記對廣西雅長自然保護區的32份野生帶葉兜蘭資源進行遺傳多樣性研究的報道[12]。中國西南地區的云南、貴州和廣西3個?。▍^）均為中國帶葉兜蘭的主要分布地區，而只有以上2篇研究廣西地區帶葉兜蘭單居群遺傳多樣性的文獻，涉及的采集樣本均有一定的地域局限性，且未涵蓋多居群和群體結構研究，不足以反映中國帶葉兜蘭資源的遺傳水平。

SSR簡單重復序列（SSR）又稱為微衛星（microsatellites）或者串聯重復序列（STR），由1～6個堿基為重復單位組成的短串聯重復序列，它廣泛、豐富且隨機地分布于真核生物基因組中[19]。SSR標記具有數量多、分布廣、多態性高、重復性好、共顯性和易檢測等特點，已經成為研究種群遺傳多樣性和遺傳結構的最有效分子標記之一[20]。

本研究以云南、貴州和廣西的6個野生帶葉兜蘭居群為研究材料，在已發表的帶葉兜蘭表型多樣性研究的基礎上[21]，利用SSR標記技術對其進行遺傳多樣性分析和群體結構分析，并綜合分析表型數據和分子數據，以期為中國西南地區野生帶葉兜蘭的資源保護工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

根據網上搜索、相關文獻記載和實地踏查情況，采集來源于帶葉兜蘭天然分布區內廣西、云南和貴州3?。▍^）的6個野生居群，共計190份樣品，具體采樣信息見表1和圖1。其中在廣西木論（GML）和云南柳井（YDZ）居群帶葉兜蘭分布范圍較窄，數量較少，因此采集到的樣本數量也相對較少。采樣標準為居群間的地理距離大于10 km，株間距大于10 m，且無病蟲害。每個單株采集新鮮葉片放入裝有變色硅膠的塑料自封袋中，干燥備用。

表1 6個居群的采樣信息

圖1 樣品采集點分布圖

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 基因組DNA的提取參照本實驗室改良后的亨利兜蘭基因組CTAB提取方法進行[22]。獲取的基因組DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測純度和完整性，并用Nanodrop 2000微量分光光度計（Thermo，美國）檢測濃度和質量，將合格的DNA樣品保存于?20 ℃，備用。

1.2.2 SSR引物篩選 參考本實驗室基于亨利兜蘭轉錄組數據開發的引物[22]，從115對引物中共篩選出10對擴增效果好的SSR引物（表2）。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司北京分公司合成。

表2 10對SSR引物信息

1.2.3 PCR擴增及測序 在C1000 Touch實時定量PCR儀（Bio-Rad，美國）上進行反應，PCR反應體系（20 μL）：10×buffer 2.0 μL，dNTPs 1.5 μL，上、下游引物各2.0 μL，Ex0.2 μL，DNA 3.0 μL，ddH2O 9.3 μL。PCR擴增反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環10次；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環15次；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，循環10次；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR產物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，合格后送至上海天昊生物公司進行基于二代測序技術的SSR基因分型。

1.3 數據處理

采用Excel 2010軟件統計并整理SSR基因分型數據。利用Genalex 6.501[23]和PopGene 1.32[24]軟件計算多態性位點比率（PPB）、等位基因數（N）、有效等位基因數（N）、Shannon信息指數（）、觀測雜合度（H）、期望雜合度（H）、Nei’s基因多樣性指數（）、Nei’s遺傳距離（G）、遺傳相似性（G）和基因流（N）等。利用PIC-Calc軟件計算多態信息含量（PIC）。利用Genalex 6.501[23]軟件進行基于遺傳距離的主成分分析（PCoA）和分子方差分析（AMOVA）。利用Mega 7.0[25]軟件的非加權平均法（UPGMA）進行聚類分析，并構建基于遺傳距離的聚類圖。利用Structure 2.3.4[26]軟件進行遺傳結構分析，設置值為1～10，對不同的值進行10次重復運算。使用馬爾可夫鏈法（Markov’s Chain Monte Carlo, MCMC），設burn-in為100 000次，run-length為100 000次迭代，之后用在線軟件Structure harvester（http://taylor0.biology.ucla.edu/structure harvester/）根據?峰值位置來確定最佳分組群，并繪制群體結構分析圖。

2 結果與分析

2.1 SSR標記多態性

利用10對SSR引物對190份帶葉兜蘭材料進行SSR多態性分析（表3）。由表3可知，共檢測到50個N，N在2～9之間，平均每個SSR標記5個等位基因。N為1.0269～ 6.7468，平均值為2.4835。在0.0843～2.0272之間，平均值為0.8592。H在0.0265～0.8677之間，平均值為0.4518。H在0.0263～0.8540之間，平均值為0.4387。在0.0262～0.8518之間，平均值為0.4370。PIC在0.0260～0.8346之間，平均值為0.3996。參照BOTSTEIN等[27]提出的衡量基因變異程度高低的PIC指標，有4個位點（DY383、DY687、DY716、DY800）是高度多態性位點（PIC>0.50），4個位點（DY356、DY376、DY413、DY669）是中度多態性位點（0.25

表3 10對SSR引物的多態性分析

2.2 居群遺傳多樣性

帶葉兜蘭各野生居群遺傳多樣性檢測結果見表4。6個居群的多態性位點比率（PPB）在70%～100%之間，平均值為88.33%。N在2.8000～ 4.3000之間，平均值為3.3833。N為1.9655～2.4060，平均值為2.1901。在0.6584～0.8369之間，平均值為0.7425。H在0.3891～0.4839之間，平均值為0.4465。H在0.3795～0.4683之間，平均值為0.4205。在0.3648～0.4382之間，平均值為0.4008。表明6個帶葉兜蘭居群的遺傳多樣性豐富，其中廣西木論（GML）遺傳多樣性最低，廣西雅長（GYC）和貴州萬峰湖（QWF）遺傳多樣性較高。

表4 基于10對SSR引物的帶葉兜蘭6個居群的遺傳多樣性

2.3 居群遺傳分化

帶葉兜蘭居群的分子方差分析（AMOVA）結果表明，帶葉兜蘭居群間的遺傳變異僅有6%，而居群內的遺傳變異有94%，絕大部分遺傳變異發生在各居群的內部（表5）。說明野生帶葉兜蘭資源的遺傳多樣性以居群內的變異為主，居群內分化程度較高，而居群間遺傳分化較小。

2.4 聚類和主坐標分析

遺傳距離和遺傳相似性是衡量居群親緣關系的重要指標，6個居群間的Nei’s遺傳距離（G）和遺傳相似性（G）見表6。6個居群間G在0.0169～0.1330之間，G在0.8755～0.9832之間。其中GML和YDZ居群間的G最大（0.1330），GYC和QWF居群間的G最?。?.0169）。GYC和QWF居群間的G最大（0.9832），GML和YDZ居群間的G最?。?.8755）。

根據居群間的Nei’s遺傳距離采用UPGMA法進行聚類分析（圖2），結果顯示，廣西雅長（GYC）和貴州萬峰湖（QWF）首先聚為一支，再依次和貴州桔山（QJS）、云南法斗（YFD）、云南柳井（YDZ）聚集，最后和廣西木論（GML）聚集。結果表明居群間遺傳距離與地理距離無顯著相關性。

表6 帶葉兜蘭居群間的遺傳距離（Gd）和遺傳相似性（Gi）

注：對角線下方為Nei’s遺傳距離（G），對角線上方為Nei’s遺傳相似性（G）。

Note: Below diagonal is Nei’s genetic distance (G), and above diagonal is Nei’s genetic identity (G).

圖2 基于Nei’s遺傳距離的帶葉兜蘭居群的聚類圖

為進一步研究群體間的遺傳關系，對190份帶葉兜蘭進行主坐標分析（PCoA）。其中第一主成分和第二主成分分別可以解釋總變量的31.63%和10.07%（圖3）。主坐標結果表明帶葉兜蘭居群間均質化明顯，居群內存在著種質混雜現象。

2.5 居群遺傳結構

利用Structure的貝葉斯聚類方法對6個帶葉兜蘭居群進行遺傳結構分析，根據EVANNO等[28]的方法用最大似然值?來確定值。Structure分析結果顯示在1～10之間，為2時，?取得最大值（圖4），表明6個居群190個個體的基因型分為2種。2種基因型在每個居群中分布比例相似，不能按照不同基因池區分（圖5），表明帶葉兜蘭居群間均質化，可能由于較高基因流導致。

圖3 基于Nei’s遺傳距離的主坐標分析圖

圖4 ?K分布圖

圖5 帶葉兜蘭居群Structure聚類結果（K=2）

3 討論

3.1 帶葉兜蘭居群的遺傳多樣性

遺傳多樣性是體現一個物種進化潛力和抵抗外界環境變化的能力，遺傳多樣性水平越高，物種適應環境變化的能力越強，反之越弱[29]。本研究所選的6個居群是本實驗室從2013年開始，通過查閱文獻、網上搜索和多年實地踏查所收集到的所有居群，其中貴州萬峰湖（QWF）、貴州桔山（QJS）、云南法斗（YFD）和云南柳井（YDZ）這4個居群均是首次對其進行研究報道。

本研究對6個帶葉兜蘭居群的SSR檢測結果表明，在物種水平（=0.8592,=0.4370）和居群水平（PPB=83.33%,=0.7425,=0.4008）上均具有豐富的遺傳多樣性。與以往的兜蘭屬植物遺傳多樣性研究相比，高于朱亞艷等[10]利用SRAP標記分析的8種兜蘭的遺傳多樣性（PPB=80.26%,=0.4241,=0.2879），略高于李宗艷等[17]利用ISSR標記分析的7個硬葉兜蘭居群的遺傳多樣性（PPB= 96.04%,=0.4889,=0.3244），略高于HUANG等[16]利用ISSR和SRAP標記分析的15個硬葉兜蘭居群的遺傳多樣性（ISSR: PPB=80.28%,=0.4236; SRAP: PPB=70.67%,=0.3301），也高于秦惠珍等[18]利用ISSR標記分析的8個白花兜蘭居群的遺傳多樣性（PPB=78.33%,=0.4191,= 0.2808）。高麗霞等[14]利用SRAP標記分析的廣西木論自然保護區的40份野生帶葉兜蘭的遺傳多樣性（PPB=24.22%,=0.1582,=0.1282）低于本研究中同位于廣西木論縣木論自然保護區的廣西木論（GML）的遺傳多樣性（PPB=70%,=0.6584,=0.3648），推測可能與本研究采用的SSR標記具有更高的多態性和保護區的保護有關。CHEN等[12]利用SSR標記分析的廣西雅長自然保護區的32份野生帶葉兜蘭的遺傳多樣性（N=2.9300,N=2.2200,H= 0.5313）略高于本研究中同位于廣西雅長自然保護區的廣西雅長（GYC）的遺傳多樣性（N= 3.9000,N=2.2820,H=0.4452）。本研究對6個帶葉兜蘭居群的研究也顯示了廣西木論（GML）的遺傳多樣性最低，廣西雅長（GYC）的遺傳多樣性較高，推測可能和位于雅長自然保護區的帶葉兜蘭居群較大，而位于木論自然保護區的居群較小有關。本研究與上述近緣或相同物種的多項指標比較表明，帶葉兜蘭整體遺傳多樣性豐富，高于硬葉兜蘭和白花兜蘭。

3.2 帶葉兜蘭居群的遺傳結構

遺傳分化是反映遺傳結構的重要指標。本研究通過AMOVA分析顯示，94%的遺傳分化發生在居群內，居群間遺傳分化很?。?%），即帶葉兜蘭主要遺傳變化來自居群內的個體間變異。李宗艷等[17]利用ISSR標記對7個硬葉兜蘭居群進行AMOVA分析顯示，硬葉兜蘭居群內（60.4%）的遺傳變異大于居群間（39.60%）。HUANG等[16]利用ISSR和SRAP標記對15個硬葉兜蘭居群進行AMOVA分析，ISSR標記結果顯示硬葉兜蘭居群內（69%）遺傳變異大于居群間（31%），SRAP標記結果也顯示硬葉兜蘭居群內（75%）遺傳變異大于居群間（25%）。秦惠珍等[18]利用ISSR分子標記對8個白花兜蘭居群進行AMOVA分析顯示白花兜蘭居群內（87.53%）遺傳變異大于居群間（12.47%）。多項指標表明多數兜蘭屬植物的遺傳變異均以居群內的遺傳變異為主。這一結果可能與兜蘭具有欺騙性授粉的特征有關，欺騙性授粉的物種比向傳粉者提供回報的物種具有更高的基因流動，且兜蘭種子細小也有利于遠距離傳播[11]。此外，評價居群的遺傳結構需要結合物種的繁育系統和傳粉方式等因素進行綜合分析，目前尚無帶葉兜蘭繁育和傳粉的相關報道，后續應加強對這方面的研究來進一步闡明其遺傳結構的形成原因。

遺傳結構是評價遺傳資源的關鍵。本研究通過UPGMA聚類、PCoA分析和Structure群體結構分析對帶葉兜蘭資源進行劃分，3種分析方法得到的結果相似，均顯示6個野生帶葉兜蘭居群無明顯的類群劃分，居群間存在基因漸滲的現象且均質化明顯。這可能會降低物種的長期適應性進化能力，增加在不斷變遷的環境中因隨機事件而滅絕的風險。推測很可能因為現存的各個居群起源于相同的祖先居群，由于在歷史中發生生境片段化，造成這一連續分布的祖先居群殘留成目前多個分散的居群。

3.3 表型多樣性和遺傳多樣性關聯分析

本研究與本實驗室王文曉等[21]的帶葉兜蘭表型多樣性分析結果相比，其中有5個居群采樣地點均與王文曉等文中相對應（王文曉等文中的YDZ居群采樣地由云南省馬關縣斗嘴鄉更正為云南省文山縣柳井彝族鄉斗咀村，居群字母簡稱YDZ不變）。王文曉等根據18個表型性狀變異系數分析顯示，5個野生居群內變異系數由高到底為云南法斗（YFD）＞貴州萬峰湖（QWF）＞廣西雅長（GYC）＞云南柳井（YDZ）＞廣西木論（GML），本研究根據遺傳多樣性分析結果顯示，6個野生居群遺傳多樣性由高到低為廣西雅長（GYC）＞貴州萬峰湖（QWF）＞云南法斗（YFD）＞貴州桔山（QJS）＞云南柳井（YDZ）＞廣西木論（GML），二者結果部分相似；但王文曉等根據巢氏方差分析表型分化系數顯示，居群間的表型分化大于居群內，而本研究根據AMOVA分析遺傳分化系數顯示，居群內的遺傳分化遠遠大于居群間；聚類結果也不同，王文曉等按照表型性狀Q型聚類將居群劃分為3類，云南法斗（YFD）和云南柳井（YDZ）為一類群，廣西雅長（GYC）和廣西木論（GML）為一類群，貴州萬峰湖（QWF）為一類群，其結果大致同地理位置及生境相符。這種利用表型性狀檢測植物遺傳變異和多樣性的方法簡便易行，能夠短期內基本了解植物的遺傳變異水平[30]。但植物形態學特征受環境影響較大，在不同生境下營養和生殖性狀均會出現差異，因此存在一定的局限性[31]。而利用SSR分子標記技術是從DNA水平上反映個體間的遺傳變異現象，不受生長發育和時間的制約，避免環境干擾，成本低，檢測效率高，能更準確地反映類群間的親緣關系[32]。基于SSR技術，本研究聚類結果表明，不同居群的帶葉兜蘭的遺傳結構未嚴格按照地理距離劃分，這一結果與本實驗室硬葉兜蘭13個居群遺傳多樣性分析結果類似，廣西木論（GML）居群和其他居群遺傳距離最遠（數據尚未發表）。其原因可能是：（1）由于貴州萬峰湖（QWF）居群位于5個居群的中間位置，與其他居群有相對較大的基因流交流，基因重組的空間和機會更大，更容易擴大種群的遺傳多樣性水平；（2）貴州萬峰湖（QWF）和廣西雅長（GYC）居群分別位于紅水河水系的上下游，通過紅水河水系增加了這2個居群間的基因交流，因此這2個居群間關系最近。

3.4 帶葉兜蘭資源保護

遺傳多樣性是種質資源保護與評價的重要指標[33]。通過對中國西南地區的6個帶葉兜蘭居群的遺傳多樣性進行研究，結果表明帶葉兜蘭具有相對豐富的遺傳多樣性，但居群間存在均質化現象。在6個居群中，貴州萬峰湖（QWF）居群和位于廣西雅長自然保護區的廣西雅長（GYC）居群遺傳多樣性較高，應作為核心種群重點保護，可見選擇在廣西雅長作為全國唯一一個國家級蘭科植物自然保護區，在帶葉兜蘭的保護上其意義重大。由于帶葉兜蘭居群內個體間的遺傳變異較高，因此也要加強對居群內部每個個體的保護，以保持最大遺傳變異基因庫為目標。

此外，通過全基因組重測序和簡化基因組測序等高通量測序技術開發分子標記，已廣泛應用于大田作物和蔬菜中，這也給蘭科植物起源和進化帶來新的研究方向[34]。如簡化基因組測序技術有不參考基因組就可以進行大量SNPs開發的優勢，目前在蘭科植物中石斛屬[35]、蝴蝶蘭屬[36]上已有應用，但尚無新型分子標記技術應用于兜蘭屬植物的報道。為了更好地保護兜蘭屬植物，今后可以利用新型高通量測序技術開發新的標記技術，加強與鄰國的交流，增加越南、老撾、印度、泰國等國家野生居群采樣，以全面了解帶葉兜蘭資源的遺傳狀況。

[1] 劉仲健, 陳心啟, 陳利君, 雷嗣鵬. 中國兜蘭屬植物[M]. 北京: 科學出版社, 2009: 93-95. LIU Z J, CHEN X Q, CHEN L J, LEI S P. The genusin China[M]. Beijing: Science Press, 2009: 93-95. (in Chinese)

[2] 羅毅波, 賈建生, 王春玲. 中國蘭科植物保育的現狀和展望[J]. 生物多樣性, 2003, 11(1): 70-77. LUO Y B, JIA J S, WANG C L. A general review of the conservation status of Chinese orchids[J]. Biodiversity Science, 2003, 11(1): 70-77. (in Chinese)

[3] 王英強. 中國兜蘭屬植物生態地理分布[J]. 廣西植物, 2000, 20(4): 289-294. WANG Y Q. The geography of Chinese species of[J]. Guihaia, 2000, 20(4): 289-294. (in Chinese)

[4] 楊穎婕, 黃家林, 胡虹, 張石寶. 中國兜蘭屬植物種質資源保護和利用研究進展[J]. 西部林業科學, 2021, 50(5): 108-112, 119. YANG Y J, HUANG J L, HU H, ZHANG S B. Progress on conservation and utilization ofspecies in China[J]. Journal of West China Forestry Science, 2021, 50(5): 108-112, 109. (in Chinese)

[5] 覃海寧, 楊永, 董仕勇. 中國高等植物受威脅物種名錄[J]. 生物多樣性, 2017, 25(7): 696-744. QIN H N, YANG Y, DONG S Y. Threatened species list of China’s higher plants[J]. Biodiversity Science, 2017, 25(7): 696-744. (in Chinese)

[6] 馮昌林, 鄧振海, 蔡道雄, 吳天貴, 賈宏炎, 白靈海, 趙祖壯, 蘇勇. 廣西雅長林區野生蘭科植物資源現狀與保護策略[J]. 武漢植物學研究, 2012, 30(3): 285-292. FENG C L, DENG Z H, CAI D X, WU T G, JIA H Y, BAI L H, ZHAO Z Z, SU Y. Current status and conservation strategies of wild orchid resources in Guangxi Yachang Forests[J]. Wuhan Botanical Research, 2012, 30(3): 285-292. (in Chinese)

[7] 張羅霞, 李宗艷. 部分兜蘭屬植物基于ITS基因的序列分析[J]. 分子植物育種, 2019, 17(1): 33-34, 36-39, 35. ZHANG L X, LI Z Y. Sequence analysis of someplants based on ITS gene[J]. Molecular Plant Breeding, 2019, 17(1): 33-34, 36-39, 35. (in Chinese)

[8] CHOCHAI A, LEITCH I J, INGROUILLE M J, FAY M F. Molecular phylogenetics of(Cypripedioideae; Orchidaceae) based on nuclear ribosomal ITS and plastid sequences[J]. Botanical Journal of the Linnean Society, 2012, 170(2): 176-196.

[9] CHUNG S Y, CHOI S H, KIM M J, YOON K E, LEE G P, RYU K H. Genetic relationship and differentiation ofandbased on RAPD analysis[J]. Scientia Horticulturae, 2006, 109(2): 153-159.

[10] 朱亞艷, 王港, 侯娜, 王蓮輝. 貴州南部野生兜蘭SRAP遺傳多樣性分析[J]. 西南林業大學學報(自然科學), 2017, 37(1): 10-14. ZHU Y Y, WANG G, HOU N, WANG L H. Genetic diversity analysis of wildspecies in the south of Guizhou[J]. Journal of Southwest Forestry University (Natural Sciences), 2017, 37(1): 10-14. (in Chinese)

[11] GUO Y Y, LUO Y B, LIU Z J, WANG X Q. Reticulate evolution and sea-level fluctuations together drove species diversification of slipper orchids () in South-East Asia[J]. Molecualr Ecology, 2015, 24(11): 2838-2855.

[12] CHEN L, DONG H, WANG J W, LI L N, XU M. Microsatellites characteristics analysis and SSR marker development forbased on transcriptome sequencing[J]. Plant Genetic Resources, 2018, 16(4): 394-396.

[13] XU Y F, JIA R D, ZHOU Y H, CHEN H, ZHAO X, GE H. Development and characterization of polymorphic EST SSR markers for(Orchidaceae)[J]. Applications in Plant Sciences, 2018, 6(5): 1-6.

[14] 高麗霞, 覃國樂, 易桂萍. 帶葉兜蘭遺傳多樣性的SRAP分析[J]. 南方農業學報, 2014, 45(10): 1734-1738. GAO L X, QIN G L, YI G P. Genetic diversity analysis ofby SRAP marker[J]. Journal of Southern Agriculture, 2014, 45(10): 1734-1738. (in Chinese)

[15] LI Z, LI J, LI M. Effect of human disturbance on genetic structure of rare and endangeredimplied the habitat status[J]. Tropical Conservation Science, 2020, 13(12): 3299-3319.

[16] HUANG J L, LI S Y, HU H. ISSR and SRAP markers reveal genetic diversity and population structure of an endangered slipper Orchid,(Orchidaceae)[J]. Plant Diversity and Resources, 2014, 36(2): 209-218.

[17] 李宗艷, 管名媛, 李靜, 李名揚. 基于ISSR的硬葉兜蘭居群遺傳多樣性研究[J]. 西北植物學報, 2016, 36(7): 1351-1356. LI Z Y, GUAN M Y, LI J, LI M Y. Genetic diversity ofdetected by ISSR data[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2016, 36(7): 1351-1356. (in Chinese)

[18] 秦惠珍, 盤波, 趙健, 鄒蓉, 韋霄, 唐鳳鸞. 極小種群野生植物白花兜蘭ISSR遺傳多樣性分析[J]. 廣西科學, 2022, 29(6): 1134-1140. QIN H Z, PAN B, ZHAO J, ZHOU R, WEI X, TANG F L. ISSR genetic diversity analysis of small population wild plant[J]. Guangxi Sciences, 2022, 29(6): 1134-1140. (in Chinese)

[19] 王玲玲, 陳東亮, 黃叢林, 邢震. SSR分子標記技術在植物研究中的應用[J]. 安徽農業科學, 2017, 45(36): 123-126, 130. WANG L L, CHEN D L, HUANG C L, XING Z. Application of SSR moclecular marker technique in plant research[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2017, 45(36): 123-126, 130. (in Chinese)

[20] BALLOUX F, NICOLAS L M. The estimation of population differentiation with microsatellite markers[J]. Molecular Ecology, 2002, 11(2): 55-65.

[21] 王文曉, 程浩, 徐玉鳳, 葛紅, 楊樹華, 趙鑫, 武榮花, 賈瑞冬. 帶葉兜蘭5個野生居群表型多樣性分析[J]. 植物遺傳資源學報, 2020, 21(5): 1196-1206. WANG W X, CHENG H, XU Y F, GE H, YANG S H, ZHAO X, WU R H, JIA R D. Phenotypic diversity analysis of five wildpopulations[J]. Journal of Plant Genetic Resources, 2020, 21(5): 1196-1206. (in Chinese)

[22] 賈瑞冬, 徐玉鳳, 葛紅, 周妍慧, 楊樹華, 趙鑫. 亨利兜蘭EST-SSR標記引物、其開發方法及其應用: 107365874B[P]. 2020-04-07. JIA R D, XU Y F, GE H, ZHOU Y H, YANG S H, ZHAO X. EST-SSR primers evelopment and application in: 107365874B[P]. 2020-04-07. (in Chinese)

[23] PEAKALL R, SMOUSE P E. GENALEX 6: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research[J]. Molecular Ecology Notes, 2010, 6(1): 288-295.

[24] KRAWCZAK M, NIKOLAUS S, VON E H, CROUNCHER P J P, EI M N, SCHREIBER S. PopGen: population-based recruitment of patients and controls for the analysis of complex genotype-phenotype relationships[J]. Community Genetics, 2006, 9(1): 55-61.

[25] HALL B G. Building phylogenetic trees from molecular data with MEGA[J]. Molecular Biology and Evolution, 2013, 30(5): 1229-1235.

[26] PRITCHARD J K, STEPHENS M, DONNELLY P. Inference of population structure using multilocus genotype data[J]. Genetics, 2000, 155(2): 945-959.

[27] BOTSTEIN D, WHITE R L, SKOLNICK M, DAVIS R W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. American Journal of Human Genetics, 1980, 32(3): 311-314.

[28] EVANNO G S, REGNAUT S J, GOUDET J. Detecting the number of clusters of individuals using the software structure: a simulation study[J]. Molecular Ecology, 2005, 14(8): 2611-2620.

[29] 田星, 李中霽, 劉小莉, 李國棟. 基于SSR分子標記的燈盞花遺傳多樣性分析[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2021, 27(18): 136-143. TIAN X, LI Z J, LIU X L, LI G D. Genetic diversity analysis ofbased on SSR markers[J]. Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae, 2021, 27(18): 136-143. (in Chinese)

[30] 焦振彬, 羅毅波. 群體表型性狀研究揭示環境與遺傳因素對霍山石斛表型的影響及物種分類[J]. 生物多樣性, 2021, 29(8): 1073-1086. JIAO Z B, LUO Y B. Effects of environmental and genetic factors on phenotypic traits and species classification of[J]. Biodiversity Science, 2021, 29(8): 1073-1086. (in Chinese)

[31] 趙洋, 穆雪, 李春艷, 汪衛星. 獼猴桃屬(Lindl.)植物親緣關系研究進展[J]. 果樹學報, 2019, 36(9): 1214-1228. ZHAO Y, MU X, LI C Y, WANG W X. Research advances on the genetic relationships of kiwifruit (Lindl.)[J]. Journal of Fruit Science, 2019, 36(9): 1214-1228. (in Chinese)

[32] 劉少榮, 楊揚, 田紅麗, 易紅梅, 王璐, 康定明, 范亞明, 任潔, 江彬, 葛建镕, 成廣雷. 基于農藝及品質性狀與SSR標記的青貯玉米品種遺傳多樣性分析[J]. 作物學報, 2021, 47(12): 2362-2370. LIU S R, YANG Y, TIAN H L, YI H M, WANG L, KANG D M, FAN Y M, REN J, JIANG B, GE J R, CHENG G L. Genetic diversity analysis of silage corn varieties based on agronomic and quality traits and SSR markers[J]. Acta Agronomica Sinica, 2021, 47(12): 2362-2370. (in Chinese)

[33] 宋杰, 李世峰, 劉麗娜, 李樹發, 解瑋佳, 關文靈. 云南含笑天然居群的表型多樣性分析[J]. 西北植物學報, 2013, 33(2): 272-279. SONG J, LI S F, LIU L N, LI S F, XIE W J, GUAN W L. Phenotypic diversity of natural populations of[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica, 2013, 33(2): 272-279. (in Chinese)

[34] 熊燕, 張金柱, 董婕, 王力, 高鵬, 姜琬, 車代弟. 簡化基因組測序技術在觀賞植物中的應用研究進展[J]. 園藝學報, 2020, 47(6): 1194-1202. XIONG Y, ZHANG J Z, DONG J, WANG L, GAO P, JIANG W, CHE D D. A review of reduced-representation genome sequencing technique and its applications inornamental plants[J]. Acta Horticulturae Sinica, 2020, 47(6): 1194-1202. (in Chinese)

[35] 王趁芳, 黃守程, 周玉麗, 王曉鵬, 劉愛榮, 侯北偉, 葉梅榮. 基于測序基因分型技術的3種石斛蘭遺傳關系分析[J]. 中國野生植物資源, 2021, 40(10): 19-24. WANG C F, HUANG S C, ZHOU Y L, WANG X P, LIU A R, HOU B W, YE M R. Analysis of the genetic relationships among 3species based on genotyping by sequencing[J]. Chinese Wild Plant Resources, 2021, 40(10): 19-24. (in Chinese)

[36] 肖文芳, 李佐, 陳和明, 呂復兵. 基于SLAF-BSA技術的蝴蝶蘭花底色關聯SNP分子標記開發與驗證[J]. 中國農業大學學報, 2021, 26(9): 92-100. XIAO W F, LI Z, CHEN H M, LYU F B. Identification and validation of single-nucleotide polymorphism markers linked to flower ground color inby using combined specific-locus amplified fragment sequencing and bulked segregant analysis[J]. Journal of China Agricultural University, 2021, 26(9): 92-100. (in Chinese)

Genetic Diversity of WildPopulations in Southwest China with SSR Markers

XU Yan1,2, CHEN Zhiguang2, XU Yufeng2, GE Hong2, YANG Shuhua2, ZHAO Xin2, KOU Yaping2, YU Xiaonan1*, JIA Ruidong2*

1. College of Landscape Architecture, Beijing Forestry University / Beijing Key Laboratory of Ornamental Plants Germplasm Innovation & Molecular Breeding / National Engineering Research Center for Floriculture / Beijing Laboratory of Urban and Rural Ecological Environment, Beijing 100083, China; 2. Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Flower Crops (North China), Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100081, China

(Lindl. ex Hook. f.) Stein is a rare and endangered plant in China with high ornamental value.In order to explore the genetic characteristics of wildresources in Southwest China, and contribute to the protection and utilization of the wild resources, this study used SSR molecular marker to analyze the genetic diversity and population genetic structure of 190resources which collected from six populations in Guangxi, Yunnan and Guizhou provinces in Southwest China. In this study, the results showed thatten pairs of primers with good amplification effect were selected from 115 pairs of primers, and 50 alleles were detected by 10 pairs of SSR primers of 190.The average number of alleles (N) was five and the average number of effective alleles (N) was 2.4835. The average Shannon information index () was 0.8592. The average observed heterozygosity (H) was 0.4518 and the average expected heterozygosity (H) was 0.4387. The average polymorphic information content (PIC) was 0.3996 and the average Nei’s expected heterozygosty () was 0.4370.In this six wildpopulations,the number of alleles (N) was from 2.8000 to 4.3000. The number of effective alleles (N) was from 1.9655 to 2.4060. The observed heterozygosity (H) was from 0.3891 to 0.4839. The expected heterozygosity (H) was from 0.3795 to 0.4683. The Shannon information index () was from 0.6584 to 0.8369, and the Nei’s expected heterozygosty () was from 0.3648 to 0.4382.In the six wild populations, the genetic diversity of Guangxi Yachang (GYC) and Guizhou Wanfeng Lake (QWF) populations was generally higher (=0.4382,=0.4276), while the genetic diversity of Guangxi Mulun (GML) population was relatively low (=0.3648).Analysis of molecular variance (AMOVA) results showed that genetic variation mainly occurred among individuals within the population (94%),while genetic differentiation within populations was very small (6%).UPGMA cluster analysis based on genetic distance showed that the genetic distance of the sixpopulations was very small, there was no obvious group division and the genetic distance was not completely related to the geographical location.The results of Structure and principal coordinate analysis were consistent with those of UPGMA cluster analysis. Structure and principal coordinate analysis results showed that there was homogenization among the populations, and there was no obvious group division. In summary, the genetic diversity ofresources is relatively rich, which can provide a theoretical basis for the protection and utilization of wildresources in Southwest China.

; wild populations; SSR; genetic diversity; genetic structure

S682.31

A

10.3969/j.issn.1000-2561.2023.11.009

2022-12-20；

2023-01-31

國家重點研發計劃項目（No. 2021YFD1200200）。

徐 言（1998—），女，碩士研究生，研究方向：蘭花種質資源與遺傳育種。*通信作者（Corresponding author）：于曉南（YU Xiaonan），E-mail：yuxiaonan626@126.com；賈瑞冬（JIA Ruidong），E-mail：jiaruidong@caas.cn。