LncRNA TUG1通過調節miR-181b-5p/PDCD4軸對高糖誘導的心肌細胞凋亡的影響

呂朝陽，黃婷，徐在革，劉惠雙，楊營軍，李真真，敖文

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病患者的常見并發癥，以心臟肥大、心室結構改變以及舒張和收縮功能障礙為特征，也是心力衰竭的主要原因［1-2］。目前DCM 的發病機制尚未完全闡明。有研究表明，DCM的關鍵病理改變是心肌細胞凋亡［3］。因此，探索與心肌細胞凋亡相關的分子機制對了解DCM 的發病機制具有重要意義。長鏈非編碼RNA（LncRNA）參與轉錄和轉錄后調控，招募遺傳修飾因子，分離轉錄因子，并控制mRNA的衰減［4］。牛磺酸上調基因1（taurine up-regulated gene 1，TUG1）是首次在牛磺酸處理的小鼠視網膜細胞中檢測到的LncRNA，位于22q12 染色體上，被認為是光受體和視網膜發育的一部分［5］。有報道稱，TUG1參與了糖尿病腎病的發展［6］。此外，TUG1 在DCM小鼠心肌細胞中表達上調，敲低其表達可減輕DCM誘導的心肌肥厚［7］。然而，TUG1 在DCM 發病機制中的相關分子機制尚未完全闡明。生物信息學（https://rnasysu.com/encori/agoClipRNA.php?source=mRNA）分析發現miR-181b-5p可能是TUG1的靶基因。有文獻報道miR-181b 通過調節心肌肥厚和心肌重構影響DCM 的進展，而miR-181b-5p 是miR-181b的亞型之一，推測其可能與DCM有關［8］。程序性細胞死亡蛋白4（programmed cell death protein 4，PDCD4）作為多種miRNAs 的靶基因，在肺癌、乳腺癌等癌癥中都具有抑制腫瘤發生和誘導凋亡的作用［9］。相關研究表明，miR-181a-5p 通過抑制PDCD4 提高小鼠對鏈脲佐菌素誘導的DCM 的抵抗力，并抑制高糖處理的人心肌細胞的凋亡和炎性因子表達［10］，而其與miR-181b-5p 同屬于miR-181 的亞型，故筆者猜測miR-181b-5p可能通過PDCD4影響DCM 發病機制。基于此，本研究旨在探討TUG1和miR-181b-5p在DCM發病機制中的作用及關系，為了解DCM的發病機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 針對TUG1 的短發夾RNA（sh-TUG1）和陰性對照（sh-NC）、miR-181b-5p mimic 和inhibitor（miR-181b-5p 和anti-miR-181b-5p）及其陰性對照（miRNC 和anti-miR-NC）均購自GenePharma；Dulbecco 公司改良的Eagle's 培養基（DMEM）、葡萄糖、Annexin V-熒光素異硫氰酸鹽（FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒購自美國Sigma公司；Lipofectamine 3000 試劑、TRIzol 購自美國Invitrogen 公司；細胞計數試劑盒-8（CCK-8）購自北京利維寧生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒購自南京建成生物公司；PrimeScript 逆轉錄試劑盒、SYBR Premix Dimer Eraser Kit購自大連寶生物公司；miRNA 逆轉錄試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；兔抗B 細胞淋巴瘤2-相關X（Bax）、活化的胱天蛋白酶3（cleaved caspase 3）、PDCD4、GAPDH 及山羊抗兔二抗均購自英國Abcam 公司；ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substrate 購自Millipore；caspase-Glo3 檢測試劑盒、螢光素酶報告試劑盒購自美國Promega 公司。酶標儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；流式細胞儀購自美國BD Biosciences。

1.2 細胞培養及處理 AC16細胞（成人心室心肌細胞系）購自中國江蘇蘇州BeNa培養庫。用含胎牛血清（10%）、鏈霉素（100 g/mL）、青霉素（100 U/mL）、葡萄糖（5 mmol/L）的DMEM培養AC16 細胞。在37 ℃、5%CO2的培養箱中培養AC16 細胞。以高糖（25 mmol/L）處理48 h 構建DCM 的細胞模型［11］，正常糖（5.5 mmol/L）作為對照組。

1.3 細胞轉染及分組 將處于對數生長期的AC16 細胞以1×105個/孔的密度接種到6 孔板中，使用Lipofectamine 3000試劑將寡核苷酸轉染至AC16細胞，并設NG組（5.5 mmol/L葡萄糖）、HG 組（25 mmol/L 葡萄糖）、HG+sh-NC 組（轉染sh-NC）、HG+sh-TUG1組（轉染sh-TUG1）、HG+miR-NC組（轉染miR-NC）、HG+miR-181b-5p 組（轉染miR-181b-5p）、HG+sh-TUG1+anti-miR-NC 組（共轉染sh-TUG1 和anti-miRNC）、HG+sh-TUG1+anti-miR-181b-5p 組（共轉染sh-TUG1和anti-miR-181b-5p）、HG+miR-181b-5p+pcDNA組（共轉染miR-181b-5p 和pcDNA）、HG+miR-181b-5p+pc-PDCD4 組（共轉染miR-181b-5p 和pc-PDCD4），除NG 組外，其余各組細胞均使用含25 mmol/L葡萄糖的DMEM培養基進行培養。

1.4 CCK-8法檢測細胞活力 采用不同濃度的葡萄糖（5.5、25 mmol/L）處理AC16細胞（5×103個/孔）12、24、48 h，并以5×103個/孔接種到96 孔板中，培養48 h，然后每孔加入CCK-8試劑（10 μL）。孵育2 h后，通過酶標儀分析450 nm波長處的光密度（OD）值，并計算其細胞活力（OD實驗組/OD對照組×100%）。

1.5 LDH 釋放測定 采用LDH 測定試劑盒檢測LDH 活性。不同濃度的葡萄糖（5.5、25 mmol/L）處理AC16細胞（5×103個/孔）12、24、48 h，并以5×103個/孔接細胞種到96孔板中，培養48 h，分別收集細胞上清液用于評估LDH的活性。用酶標儀記錄上清液在490 nm波長處的OD 值。LDH 釋放總量（%）=（OD實驗組-OD對照組）/OD對照組×100%。

1.6 實時定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測TUG1、PDCD4和miR-181b-5p 的表達 各組AC16 細胞以1×105個/孔接種于6 孔板中，培養48 h 后用TRIzol 試劑提取AC16 細胞總RNA。通過PrimeScript 逆轉錄試劑盒或miRNA 逆轉錄試劑盒生成cDNA。采用SYBR Premix Dimer Eraser Kit 進行qRTPCR 分析。反應條件：95 ℃5 min；95 ℃30 s，56.5 ℃20 s，68 ℃15 s，共40 個循環；反應體系：PCR Master Mix 12.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，加雙蒸水至20 μL；采用2-ΔΔCt法計算TUG1、PDCD4 和miR-181b-5p 的表達，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）或U6 小核RNA（snRNA）作為內參照，引物序列見表1。

Tab.1 Primers for qRT-PCR表1 qRT-PCR引物列表

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 將各組細胞以1×105個/孔的密度接種于6 孔板中，培養48 h，胰蛋白酶消化后收集細胞，PBS洗滌細胞3遍后，重新懸浮在100 μL結合緩沖液中，并與Annexin V-FITC（5 μL）和PI（10 μL）染液混合室溫避光染色15 min，參照Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒檢測AC16細胞凋亡情況，采用流式細胞儀分析細胞凋亡率。

1.8 Western blot 檢測細胞Bax、cleaved caspase 3、PDCD4 蛋白表達 將各組細胞以1×105個/孔接種于6 孔板中培養48 h，PBS 洗滌后加入裂解緩沖液，從細胞中提取總蛋白，BCA法測定細胞蛋白濃度。提取的總蛋白經10%SDS-PAGE凝膠電泳（100 V 恒壓）分離，然后將分離的蛋白質以0.65 mA/cm2恒流電轉移1.5 h 至PVDF 膜，然后用5%脫脂奶粉封閉1 h 后加入兔抗Bax（1∶1 000）、cleaved caspase 3（1∶500）、PDCD4（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 500），于4 ℃孵育過夜。一抗孵育后PVDF膜經TBST沖洗后，用辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗（1∶2 000）孵育2 h。之后用ECL化學發光法對蛋白條帶進行顯影，通過ImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substrate 顯示蛋白條帶，用Image J 軟件對條帶灰度值進行量化，GAPDH 為內參蛋白。實驗重復3次。

1.9 試劑盒法檢測細胞caspase 3 活性 根據方案使用caspase-Glo3 檢測試劑盒評估caspase 3 活性。各組AC16 細胞以5×103個/孔接種到96 孔板中，培養48 h 后，每孔加入caspase-Glo3試劑（100 μL），室溫孵育1 h。然后在光度計平板閱讀器中檢測發光，caspase 3活性用發光信號強度表示。

1.10 雙螢光素酶報告基因實驗檢測miR-181b-5p 與TUG1或PDCD4 的靶向關系 通過starBase 3.0（https://starbase.sysu.edu.cn/）預測miR-181b-5p 與TUG1 或PDCD4 的結合位點。擴增TUG1的結合位點WT-TUG1和WT-PDCD4片段及其突變體（MUT）序列，并克隆到pGL3載體中。AC16細胞通過Lipofectamine 3000試劑與螢光素酶報告載體、對照載體和miR-181b-5p 或miR-NC 共轉染。轉染48 h 后，通過螢光素酶報告試劑盒評估AC16細胞的螢光素酶強度。

1.11 統計學方法 采用SPSS 24.0 軟件和GraphPad Prism 6.0 軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高糖對AC16 細胞活力、LDH 釋放及TUG1、miR-181b-5p 表達的影響 與NG 組相比，HG 處理后的AC16 細胞在12、24 和48 h 的細胞活力和miR-181b-5p表達水平降低，LDH釋放總量和TUG1表達水平升高（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of viability,LDH release and expression of TUG1 and miR-181b-5p between two groups of AC16 cells表2 各組AC16細胞活力、LDH釋放及TUG1、miR-181b-5p表達比較（n=6，±s）

Tab.2 Comparison of viability,LDH release and expression of TUG1 and miR-181b-5p between two groups of AC16 cells表2 各組AC16細胞活力、LDH釋放及TUG1、miR-181b-5p表達比較（n=6，±s）

＊P＜0.05；a與NG組比較，P＜0.05。

組別NG組HG組12 h 24 h 48 h F細胞活力/%100.00±10.03 81.23±9.24a 60.45±5.16a 38.72±2.35a 76.862＊LDH釋放總量/%100.00±1.47 126.34±3.95a 176.51±5.87a 228.63±7.68a 697.645＊TUG1 1.00±0.08 1.35±0.11a 2.16±0.18a 3.31±0.32a 164.702＊miR-181b-5p 1.00±0.11 0.76±0.09a 0.51±0.06a 0.37±0.03a 75.206＊

2.2 TUG1 和miR-181b-5p 對高糖刺激的AC16 細胞活力、LDH釋放和凋亡的影響 與NG組相比，HG組TUG1 表達水平、LDH 釋放總量、凋亡率、Bax、cleaved caspase 3表達水平及caspase 3活性均升高，miR-181b-5p 表達水平和細胞活力均降低（均P＜0.05）；與HG 組和HG+sh-NC 組相比，HG+sh-TUG1組TUG1 表達水平、LDH 釋放總量、凋亡率、Bax、cleaved caspase 3表達水平及caspase 3活性均降低，miR-181b-5p 表達水平和細胞活力升高（均P＜0.05）；與HG 組和HG+miR-NC 組相比，HG+miR-181b-5p組TUG1表達水平、LDH釋放總量、凋亡率、Bax、cleaved caspase 3 表達水平及caspase 3 活性均降低，miR-181b-5p 表達水平和細胞活力升高（均P＜0.05），見圖1、2，表3、4。

Fig.1 Flow cytometry detection of apoptosis in each group of AC16 cells圖1 流式細胞術檢測各組AC16細胞凋亡

Fig.2 Western blot assay of Bax,cleaved caspase 3 protein expression in each group of AC16 cells圖2 Western blot檢測各組AC16細胞中Bax、cleaved caspase 3蛋白表達

Tab.3 Comparison of TUG1 and miR-181b-5p expression as well as viability and LDH release between six groups of AC16 cells表3 各組AC16細胞TUG1和miR-181b-5p表達以及細胞活力、LDH釋放比較（n=6，±s）

Tab.3 Comparison of TUG1 and miR-181b-5p expression as well as viability and LDH release between six groups of AC16 cells表3 各組AC16細胞TUG1和miR-181b-5p表達以及細胞活力、LDH釋放比較（n=6，±s）

＊P＜0.05；a與NG組比較，b與HG組比較，c與HG+sh-NC組比較，d與HG+miR-NC組比較，P＜0.05；表4同。

組別NG組HG組HG+sh-NC組HG+sh-TUG1組HG+miR-NC組HG+miR-181b-5p組F TUG1 1.00±0.05 3.46±0.37a 3.42±0.35 1.23±0.11bc 3.44±0.36 1.38±0.14bd 128.928＊miR-181b-5p 1.00±0.05 0.31±0.02a 0.33±0.03 0.74±0.04bc 0.32±0.02 2.89±0.31bd 353.223＊細胞活力/%100.00±9.42 42.31±2.36a 42.28±2.34 81.25±5.47bc 43.12±2.41 80.42±4.65bd 148.302＊LDH釋放總量/%10.03±0.05 59.43±3.62a 58.27±3.71 22.34±1.52bc 60.13±3.84 27.52±1.68bd 382.182＊

Tab.4 Comparison of apoptosis and related protein expression between six groups of AC16 cells表4 各組AC16細胞凋亡及相關蛋白表達比較（n=6，±s）

Tab.4 Comparison of apoptosis and related protein expression between six groups of AC16 cells表4 各組AC16細胞凋亡及相關蛋白表達比較（n=6，±s）

組別NG組HG組HG+sh-NC組HG+sh-TUG1組HG+miR-NC組HG+miR-181b-5p組F凋亡率/%3.48±0.11 26.59±2.31a 26.72±2.35 14.12±1.06bc 25.89±2.42 14.56±1.11bd 169.000＊Bax 1.00±0.02 2.51±0.17a 2.48±0.19 1.65±0.11bc 2.45±0.23 1.52±0.08bd 106.345＊cleaved caspase 3 1.00±0.03 2.38±0.21a 2.45±0.26 1.32±0.09bc 2.29±0.31 1.49±0.12bd 61.122＊caspase 3/（×103 RLU）21.43±1.14 68.54±4.69a 69.72±5.11 38.63±2.15bc 66.49±6.04 32.41±0.17bd 161.682＊

2.3 雙螢光素酶報告基因檢測miR-181b-5p 與TUG1 的關系 starBase 3.0 預測顯示，miR-181b-5p具有TUG1 的結合位點，見圖3。在共轉染miR-181b-5p mimic 和WT-TUG1 螢光素酶活性低于miR-NC+WT-TUG1 組（0.36±0.02vs.1.00±0.06，t=24.787，P＜0.05）。然而，在共轉染miR-181b-5p mimic 與MUT-TUG1 螢光素酶報告基因的AC16 細胞中，螢光素酶活性差異無統計學意義（0.98±0.05vs.1.00±0.08，t=0.519，P＞0.05）。此外，sh-TUG1 組AC16 細胞中miR-181b-5p 表達水平升高（2.54±0.36vs.1.02±0.03，t=10.307，P＜0.05）；pc-TUG1 組AC16 細胞中miR-181b-5p 表達水平降低（0.42±0.03vs.1.00±0.02，t=39.403，P＜0.05）。

Fig.3 Prediction of TUG1 binding sites in miR-181b-5p by starBase 3.0圖3 通過starBase 3.0預測TUG1在miR-181b-5p中的結合位點

2.4 TUG1 調控miR-181b-5p 對高糖刺激的AC16細胞活力、LDH 釋放和凋亡的影響 與HG+sh-TUG1組和HG+sh-TUG1+anti-miR-NC組比較，HG+sh-TUG1+anti-miR-181b-5p 組AC16 細胞內miR-181b-5p 表達水平和細胞活力均降低，LDH 釋放總量、凋亡率、Bax、cleaved caspase 3 表達水平及caspase 3活性均升高（均P＜0.05），見圖4、5，表5。

Fig.4 Flow cytometry results of apoptosis in each group of AC16 cells圖4 流式細胞術檢測各組AC16細胞凋亡

Fig.5 Western blot assay of Bax,cleaved caspase 3 protein expression in each group of AC16 cells圖5 Western blot檢測各組AC16細胞中Bax、cleaved caspase 3蛋白表達

Tab.5 Comparison of miR-181b-5p expression,viability,LDH release and apoptosis and its related protein expression between three groups of AC16 cells表5 各組AC16細胞miR-181b-5p表達、活力、LDH釋放和凋亡及其相關蛋白表達比較（n=6，±s）

Tab.5 Comparison of miR-181b-5p expression,viability,LDH release and apoptosis and its related protein expression between three groups of AC16 cells表5 各組AC16細胞miR-181b-5p表達、活力、LDH釋放和凋亡及其相關蛋白表達比較（n=6，±s）

＊P＜0.05；a與HG+sh-TUG1組比較，b與HG+sh-TUG1+anti-miR-NC組比較，P＜0.05。

組別HG+sh-TUG1組HG+sh-TUG1+anti-miR-NC組HG+sh-TUG1+anti-miR-181b-5p組F miR-181b-5p 0.75±0.06 0.77±0.05 0.35±0.02ab 155.446＊細胞活力/%81.27±5.45 80.63±5.51 53.45±2.36ab 69.163＊LDH釋放總量/%23.41±1.54 23.45±1.49 45.38±2.62ab 252.339＊凋亡率/%14.18±1.05 14.21±1.08 23.96±1.21ab 153.264＊Bax 1.68±0.15 1.69±0.13 2.27±0.18ab 28.604＊cleaved caspase 3 1.35±0.11 1.38±0.09 2.14±0.23ab 49.354＊caspase 3/（×103 RLU）38.54±2.12 38.68±2.31 59.15±4.58ab 82.171＊

2.5 PDCD4 與miR-181b-5p 的靶向關系 starBase 3.0 預測顯示，PDCD4 可能是miR-181b-5p 的靶點，見圖6。雙螢光素酶報告基因實驗表明，共轉染WT-PDCD4 螢光素酶報告基因和miR-181b-5p mimic的AC16細胞螢光素酶活性降低（0.41±0.02vs.1.00±0.03，t=40.083，P＜0.05），而共轉染MUTPDCD4 和miR-181b-5p mimic 的AC16 細胞無明顯變化（0.97±0.03vs.1.00±0.05，t=1.260，P＞0.05）。此外，過表達miR-181b-5p 降低了AC16 細胞中PDCD4 蛋白表達水平（0.32±0.01vs.1.00±0.02，t=74.490，P＜0.05），但敲低miR-181b-5p 表達則增高了AC16 細胞中PDCD4 蛋白表達水平（2.24±0.33vs.1.02±0.04，t=8.990，P＜0.05），見圖7。

Fig.6 Prediction of PDCD4 binding sites in miR-181b-5p by starBase 3.0圖6 通過starBase 3.0預測PDCD4在miR-181b-5p中的結合位點

Fig.7 Western blot assay of PDCD4 protein expression in each group of AC16 cells圖7 Western blot檢測各組AC16細胞中PDCD4蛋白表達

2.6 miR-181b-5p 調控PDCD4 對高糖刺激的AC16細胞活力、LDH 釋放和凋亡的影響 與HG+miR-181b-5p 組和HG+miR-181b-5p+pcDNA 組比較，HG+miR-181b-5p+pc-PDCD4 組 AC16 細胞中PDCD4 mRNA 和蛋白表達水平、LDH 釋放總量、凋亡率、Bax、cleaved caspase 3 表達水平及caspase 3 活性均升高，細胞活力降低（P＜0.05），見表6，圖8、9。

Fig.8 Flow cytometry results of apoptosis in each group of AC16 cells圖8 流式細胞術檢測各組AC16細胞凋亡

Fig.9 PDCD4,Bax and cleaved caspase 3 protein expression in each group of AC16 cells detected by Western blot assay圖9 Western blot檢測各組AC16細胞中PDCD4、Bax、cleaved caspase 3蛋白表達

Tab.6 Comparison of PDCD4 expression,viability,LDH release and apoptosis and its related protein expression between three groups of AC16 cells表6 各組AC16細胞PDCD4表達、活力、LDH釋放和凋亡及其相關蛋白表達比較（n=6，±s）

Tab.6 Comparison of PDCD4 expression,viability,LDH release and apoptosis and its related protein expression between three groups of AC16 cells表6 各組AC16細胞PDCD4表達、活力、LDH釋放和凋亡及其相關蛋白表達比較（n=6，±s）

＊P＜0.05；a與HG+miR-181b-5p組比較，b與HG+miR-181b-5p+pcDNA組比較，P＜0.05。

組別HG+miR-181b-5p組HG+miR-181b-5p+pcDNA組HG+miR-181b-5p+pc-PDCD4組F PDCD4 mRNA 1.00±0.08 1.02±0.01 2.59±0.25ab 189.863＊PDCD4蛋白0.98±0.06 1.00±0.09 2.13±0.18ab 176.857＊細胞活力/%80.35±4.63 80.48±4.69 51.85±2.17ab 101.696＊LDH釋放總量/%27.56±1.72 27.59±1.70 43.78±2.54ab 128.099＊凋亡率/%14.53±1.08 14.51±1.05 24.15±1.28ab 142.406＊Bax 1.54±0.11 1.56±0.12 2.19±0.15ab 50.192＊cleaved caspase 3 1.51±0.13 1.53±0.15 2.08±0.21ab 22.556＊caspase 3/（×103 RLU）32.45±2.03 32.48±2.13 61.23±4.64ab 164.458＊

2.7 高糖對沉默TUG1 的AC16 細胞中PDCD4 表達的影響 與NG 組相比，HG 組PDCD4 mRNA、蛋白表達水平升高（P＜0.05）；與HG 組和HG+sh-NC 組相比，HG+sh-TUG1組PDCD4 mRNA、蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與HG+sh-TUG1 組和HG+sh-TUG1+anti-miR-NC 組相比，HG+sh-TUG1+anti-miR-181b-5p 組PDCD4 mRNA、蛋白表達水平升高（P＜0.05），見圖10、表7。

Fig.10 PDCD4 protein expression in each group of AC16 cells detected by Western blot assay圖10 Western blot檢測各組AC16細胞中PDCD4蛋白表達

Tab.7 Comparison of PDCD4 expression between six groups表7 各組PDCD4表達比較 （n=6，±s）

Tab.7 Comparison of PDCD4 expression between six groups表7 各組PDCD4表達比較 （n=6，±s）

＊P＜0.05；a與NG組比較，b與HG組比較，c與HG+sh-NC組比較，d 與HG+sh-TUG1 組比較，e 與HG+sh-TUG1+anti-miR-NC 組比較，P＜0.05。

組別NG組HG組HG+sh-NC組HG+sh-TUG1組HG+sh-TUG1+anti-miR-NC組HG+sh-TUG1+anti-miR-181b-5p組F PDCD4 mRNA 1.00±0.02 2.48±0.31a 2.51±0.35 1.29±0.21bc 1.27±0.23 2.21±0.34de 38.625＊PDCD4蛋白1.00±0.03 1.76±0.22a 1.78±0.24 1.23±0.16bc 1.25±0.19 1.75±0.21de 19.805＊

3 討論

高糖可引起心肌細胞氧化應激和凋亡，損傷心肌細胞［12］。高糖誘導的心肌細胞常用于建立DCM細胞模型［13］。Ma等［11］發現25 mmol/L葡萄糖可導致心肌細胞氧化應激，并誘導細胞異常凋亡，降低細胞活性。本研究結果顯示，高糖誘導AC16 細胞后，細胞活力降低，細胞LDH釋放總量、細胞凋亡率，以及Bax、cleaved caspase 3 蛋白表達水平均升高，表明DCM 細胞模型構建成功，高糖會導致細胞氧化應激，并誘導細胞凋亡，損傷心肌細胞。

有研究表明，LncRNA是治療DCM的潛在靶點，TUG1 可在體內和體外調節心肌細胞損傷［7，14］。研究發現下調TUG1 表達可抑制心肌細胞凋亡，改善心肌損傷并預防急性心肌梗死后心肌缺血-再灌注損傷［14］。Zhao 等［7］研究亦發現下調TUG1 表達能改善DCM 小鼠心臟肥大和舒張功能障礙。本研究結果顯示，經高糖處理的AC16 細胞中TUG1 表達上調，抑制TUG1表達可提高高糖處理下AC16細胞的活力，降低LDH 釋放總量和細胞凋亡率，與Zhao等［7］研究一致，提示抑制TUG1表達可改善高糖誘導的心肌細胞損傷。另有研究顯示，糖尿病腎病模型小鼠腎小管和高糖誘導的人腎小管上皮細胞中TUG1表達水平降低，其過表達可通過抑制細胞凋亡改善糖尿病腎病［15］。這一結果與本研究結果相反，推測其原因可能是TUG1在不同組織中的生物學功能不同，其作用于腎小管上皮細胞，TUG1 表達下調可能會導致腎小管上皮細胞增殖減少，加劇糖尿病腎病病理損傷，但在心肌細胞中，TUG1 表達下調可能會抑制心肌細胞異常凋亡而緩解細胞損傷，其具體作用機制尚待進一步驗證。

TUG1 作為miRNA 的海綿參與視網膜母細胞瘤［16］、糖尿病視網膜病變［17］等疾病的進展。本研究使用starBase 3.0 預測發現TUG1 和miR-181b-5p 間有相互結合位點，并通過雙螢光素酶實驗證實TUG1可靶向調控miR-181b-5p。有研究顯示，miR-181b-5p 過表達促進高糖刺激的血管內皮細胞增殖，抑制凋亡［18］。此外，上調miR-181b-5p能夠抑制缺氧/復氧處理的心肌細胞氧化應激和凋亡［19］。本研究結果顯示，經高糖處理的AC16 細胞中miR-181b-5p 表達下調，過表達miR-181b-5p 可提高高糖刺激的心肌細胞活力，并降低LDH釋放總量和細胞凋亡，這一結果與上述研究結果基本一致，且下調miR-181b-5p 可明顯減弱TUG1 抑制對高糖處理AC16 細胞活力和凋亡的保護作用，提示TUG1 通過靶向調節miR-181b-5p影響高糖誘導的心肌細胞增殖和凋亡，參與DCM的發病機制。

為進一步探究miR-181b-5p參與高糖誘導的心肌細胞損傷機制，本研究使用starBase 3.0 預測發現PDCD4 是miR-181b-5p 的靶點，并經雙螢光素酶實驗證實。有研究顯示PDCD4 在DCM 大鼠中表達上調，下調PDCD4 的表達會通過減弱心肌細胞凋亡、炎癥和纖維化防止DCM大鼠發生左心室重塑、功能障礙和胰島素抵抗，進而改善DCM［20］。Zhao等［10］研究發現PDCD4 在高糖處理的人心肌細胞中表達上調，過表達PDCD4 會減弱miR-181a-5p 過表達對高糖誘導的細胞凋亡和炎癥的抑制作用。本研究結果顯示，PDCD4在高糖誘導的AC16細胞中表達上調，且過表達PDCD4 可部分減弱miR-181b-5p 上調對高糖處理AC16 細胞活力的促進作用和對凋亡的抑制作用。這一結果與Zhao等［10］研究結果基本一致。另外，在高糖誘導的AC16細胞中，TUG1可通過競爭性結合miR-181b-5p調控PDCD4的表達，表明高糖誘導的TUG1 通過抑制miR-181b-5p，上調PDCD4表達，促進心肌細胞凋亡。

綜上所述，沉默TUG1可通過吸收miR-181b-5p來降低PDCD4的表達，從而抑制高糖誘導的心肌細胞凋亡。但是本研究僅通過體外細胞實驗研究LncRNA TUG1/miR-181b-5p/PDCD4 軸對高糖誘導的心肌細胞凋亡的影響，未經動物實驗驗證。后續將通過建立DCM 大鼠模型深入探究TUG1 在DCM發病機制中的作用，為DCM的靶向治療提供依據。