腸道菌群改變影響CG-IUGR大鼠糖代謝的初步研究

袁冰舒，李麗娟

糖尿?。―M）發病的關鍵為胰島素（insulin，INS）分泌減少和胰島素抵抗（insulin resistance，IR），主要臨床表現為糖原合成功能降低引起的血糖增高。糖原合成酶（glycogen synthetase，GYS）是調控糖原合成及維持血糖水平穩定的重要因素。目前DM 的發生機制仍不清楚。有學者指出宮內發育遲緩（intrauterine growth retardation，IUGR）個體，尤其是具有生長追趕的宮內發育遲緩（catch-up growth intrauterine growth retardation，CG-IUGR）個體，對DM等代謝性疾病的易感性明顯增加［1-2］。已有研究表明腸道菌群異常與DM 的發生明顯相關［3］。腸道菌群的組成及豐度變化受宿主遺傳、生活方式和藥物等多種因素影響，參與機體的多種生理和病理活動［4］。Nuli 等［5-6］研究發現，2 型糖尿?。═2DM）患者腸道菌群多樣性顯著低于健康人群；DM或T2DM個體腸道菌群的豐度均與正常個體有明顯不同，表明腸道菌群變化與DM 的發生緊密相關，但腸道菌群改變是否介導CG-IUGR大鼠糖代謝異常尚不清楚。本研究通過檢測糖代謝相關指標和腸道菌群的變化，分析CG-IUGR大鼠糖代謝功能降低與腸道菌群改變之間的關聯，為CG-IUGR 個體DM 高易感提供潛在的防治靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 體質量180～200 g 的8 周齡SD 大鼠雌性15只和雄性3只購自北京維通利華實驗技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006。

1.2 主要試劑和儀器 戊巴比妥鈉購自北京化學試劑公司，125I 胰島素放射免疫試劑購自北方生物技術研究所有限公司，PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自日本TaKaRa 公司，GYS 酶活性試劑盒和BCA 試劑盒購自Solarbio 公司，兔抗鼠糖原合成酶（GYS）1 及GYS2 多克隆抗體購自英國Abcam 公司，兔抗β-actin 單克隆抗體購自Absin 公司，羊抗兔IgG 抗體購自Sigma 公司，E.Z.N.ATMDNA 提取試劑盒購自美國Omega 公司，Qubit3.0 DNA 檢測試劑盒購自美國Life 公司，Illumina MiSeq/HiSeq 測序平臺由上海生物工程有限公司提供。

1.3 實驗分組及處理 大鼠適應性喂養1周后，按照雌∶雄=5∶1比例交配，通過陰道涂片法確定受孕后，將孕鼠按照隨機數字表法分為正常飼養組（3只）和營養不良組（12只）。正常飼養組孕期采用常規飼料飼養（飼料質量為30 g/d，熱量為1 031.9 kJ/d），所產子代大鼠常規喂養至8 周齡后為Control組（8 只）。營養不良組孕期采用低熱量飼料飼養（40%常規飼養量，飼料質量為12 g/d，熱量為412.8 kJ/d），產下子代大鼠后，選取出生體質量低于Control 組新生大鼠平均體質量2個標準差的大鼠進行常規飼養，把3周齡時具有生長追趕的IUGR 大鼠（在早期生長發育過程中體質量追趕上或者超過Control組的大鼠）采用隨機數字表法分為CG-IUGR組（8只）和CG-IUGR+腸菌組（8 只）。CG-IUGR+腸菌組用Control 組大鼠的糞便菌液進行灌胃，每周1 次，共6 次。Control 組和CG-IUGR組用同量生理鹽水灌胃，同時3組大鼠均繼續采用常規飼養至8 周齡。在0～8 周齡期間，每周測量3 組大鼠的體質量和身長（從鼻尖到尾根部），計算體質量指數（BMI），評估大鼠生長發育情況。所有動物生長至8周齡時進行后續指標的檢測。菌液制備：在無菌超凈臺中，采用提尾反射法收集Control組大鼠新鮮排出的糞便，稱質量后用生理鹽水將糞便10倍稀釋，細致研磨后過濾糞便殘渣得到新鮮菌液。

1.4 葡萄糖代謝功能檢測

1.4.1 空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）和空腹胰島素（fasting serum insulin，FINS）水平檢測 每組取6 只大鼠，空腹12 h后，通過斷尾法取尾靜脈血，用強生血糖儀檢測3組大鼠的FBG水平；腹腔注射2%戊巴比妥鈉（2 mL/kg）麻醉大鼠后，分離頸動脈取血并提取血清，按照試劑盒說明書檢測血清FINS水平。

1.4.2 葡萄糖耐量試驗（glucose tolerance test，GTT）和胰島素耐量試驗（insulin tolerance test，ITT） 每組取6 只大鼠。GTT：大鼠空腹12 h 后，經腹腔緩慢注射20%葡萄糖注射液（2 g/kg），并在注射后的0、15、30、60、90 及120 min 采集尾靜脈血，用強生血糖儀檢測血糖水平；ITT：大鼠空腹12 h后，經腹腔緩慢注射INS 注射液（0.1 U/kg），檢測血糖，檢測方法同GTT。

1.4.3 放射免疫法檢測葡萄糖負荷后15 min 血清INS 水平 每組取6 只大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（2 mL/kg）麻醉大鼠后，經腹腔注射20%葡萄糖注射液（2 g/kg）15 min后，取頸動脈血后分離血清，按照試劑盒說明書檢測大鼠血清INS水平。

1.5 大鼠糞便16S rDNA 測序及分析 每組取5 只大鼠，收集大鼠糞便，按照試劑盒說明書提取DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 完整性，進行PCR 擴增及DNA 純化回收，然后用Qubit3.0 DNA試劑盒進行定量，上機終濃度為20 pmol/L。對樣本序列進行聚類分析，在97%相似水平下的操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）進行生物信息統計分析；基于OTU 計算出Alpha 多樣性指數，包括反應物種豐富度的ACE 指數和Chao1 指數，以及反應物種多樣性的Shannon 指數和Simpson指數；將序列進行物種分類，最后整理得到屬水平物種差異性比較結果。

1.6 骨骼肌及肝臟GYS 的表達及活性檢測 每組取6 只大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥鈉（2 mL/kg）麻醉后，取其骨骼肌和肝臟組織，檢測GYS 的mRNA 和蛋白表達水平及其酶活性。

1.6.1 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qPCR）檢測骨骼肌GYS1 和肝臟GYS2 的mRNA 表達水平 提取骨骼肌和肝臟組織總RNA，并按照PrimeScriptTMRT reagent Kit 說明書將其逆轉成為cDNA。根據SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書進行檢測，反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，55～65 ℃退火30 s，40 個循環。反應體系為20 μL：cDNA 2 μL，SYBR Premix Ex Taq TMⅡ10 μL，PCR上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，ddH2O 6 μL。引物由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成，見表1。采用2-ΔΔCt法分析骨骼肌GYS1和肝臟GYS2mRNA的相對表達水平。

Tab.1 Primer sequences表1 引物序列

1.6.2 Western blot 檢測骨骼肌GYS1 和肝臟GYS2 的蛋白表達水平 提取骨骼肌和肝臟組織總蛋白，并用BCA試劑盒測定蛋白濃度，經電泳、轉膜、封閉，加一抗兔抗GYS1 多抗（1∶10 000）/兔抗GYS2 多抗（1∶500）/兔抗β-actin 單抗（1∶5 000），4 ℃搖動孵育過夜，加二抗羊抗兔IgG抗體（1∶5 000），室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，ECL顯影拍照。通過Image J軟件分析各個蛋白條帶灰度值，以目的蛋白/β-actin 灰度值比值表示目的蛋白的相對表達量。

1.6.3 骨骼肌和肝臟GYS 酶活性檢測 提取骨骼肌和肝臟組織總蛋白，用BCA 試劑盒測定蛋白濃度后，按照GYS 酶活性試劑盒說明書測定GYS的酶活性。

1.7 統計學方法 采用SPSS 18.0 軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法；多個時間點體質量分析采用重復測量方差分析；采用STAMP 軟件對菌群豐度進行差異性分析并結合SPSS進行Welch'st-test分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠的生長發育情況 CG-IUGR 組出生時的身長、體質量均明顯低于Control 組大鼠，隨著周齡增加，與CG-IUGR 組大鼠相比較，CG-IUGR+腸菌組大鼠的體質量和BMI 增長速度均有減緩（P＜0.05），見圖1—3。

Fig.1 Changes of body length from birth to 8 weeks in three groups of rats圖1 3組大鼠0—8周齡的身長變化

Fig.2 Changes of body weight from birth to 8 weeks in three groups of rats圖2 3組大鼠0—8周齡的體質量變化

Fig.3 Changes of body mass index from birth to 8 weeks in three groups rats圖3 3組大鼠0—8周齡的BMI變化

2.2 大鼠葡萄糖代謝功能的變化

2.2.1 FBG 和FINS 水平 與Control 組比較，CGIUGR組FINS水平降低（P＜0.05），與CG-IUGR組比較，CG-IUGR+腸菌組FINS水平升高（P＜0.05）；3組大鼠的FBG水平差異無統計學意義，見表2。

Tab.2 Comparison of FBG and FINS levels between three groups表2 各組大鼠FBG及FINS水平比較 （n=6，±s）

Tab.2 Comparison of FBG and FINS levels between three groups表2 各組大鼠FBG及FINS水平比較 （n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與CG-IUGR組比較，P＜0.05。

組別Control組CG-IUGR組CG-IUGR+腸菌組F FBG/（mmol/L）5.22±0.52 5.62±0.44 5.35±0.29 1.367 FINS/（mIU/L）55.45±5.76 45.54±2.81a 55.61±4.50b 9.755＊＊

2.2.2 葡萄糖耐量及INS 耐量情況 GTT 結果顯示，3 組大鼠在葡萄糖負荷后各個時間點的血糖均升高，且均在15 min 時達最大值。與Control 組比較，CG-IUGR組糖負荷后各時間點的血糖水平均升高（P＜0.05）；ITT結果顯示，CG-IUGR組INS負荷后血糖水平明顯高于Control 組（P＜0.05）；與CGIUGR 組比較，CG-IUGR+腸菌組大鼠糖負荷和INS負荷后的血糖均有所下降（P＜0.05）。見圖4—5。

Fig.4 Changes of GTT blood glucose in 3 groups of rats圖4 3組大鼠GTT血糖的變化

Fig.5 Changes of ITT blood glucose in 3 groups of rats圖5 3組大鼠ITT血糖的變化

2.2.3 葡萄糖負荷后15 min血清INS水平比較 葡萄糖負荷后15 min，Control 組、CG-IUGR 組和CGIUGR+腸菌組血清INS 水平（mIU/L）分別為67.23±13.44、169.43±37.19 和119.24±31.81，其差異有統計學意義（n=6，F=18.247，P＜0.05）；CG-IUGR 組和CG-IUGR+腸菌組血清INS 水平均高于Control 組（P＜0.05），CG-IUGR+腸菌組血清INS 水平低于CG-IUGR組（P＜0.05）。

2.2.4 骨骼肌GYS1 和肝臟GYS2 的mRNA 表達水平 與Control 組相比，CG-IUGR 組骨骼肌GYS1 和肝臟GYS2 mRNA 表達水平均降低（P＜0.05）；與CG-IUGR組相比，CG-IUGR+腸菌組骨骼肌GYS1和肝臟GYS2 mRNA 表達水平均升高（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Comparison of mRNA expression levels of GYS1 in skeletal muscle and GYS2 in liver between three groups表3 3組大鼠骨骼肌GYS1和肝臟GYS2 mRNA表達水平比較（n=6，±s）

Tab.3 Comparison of mRNA expression levels of GYS1 in skeletal muscle and GYS2 in liver between three groups表3 3組大鼠骨骼肌GYS1和肝臟GYS2 mRNA表達水平比較（n=6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a 與Control 組比較，b 與CG-IUGR 組比較，P＜0.05。

組別Control組CG-IUGR組CG-IUGR+腸菌組F GYS1 1.00±0.00 0.70±0.19a 0.97±0.25b 4.822＊GYS2 1.00±0.00 0.56±0.17a 0.88±0.20b 13.126＊＊

2.2.5 骨骼肌GYS1 和肝臟GYS2 的蛋白表達水平 與Control 組相比，CG-IUGR 組骨骼肌GYS1 和肝臟GYS2 的蛋白表達均降低（P＜0.05）；與CGIUGR 組相比，CG-IUGR+腸菌組骨骼肌GYS1 和肝臟GYS2的蛋白表達均升高（P＜0.05），見圖6、表4。

Fig.6 Protein expression of GYS1 in skeletal muscle and GYS2 in liver of rats in each group圖6 3組大鼠骨骼肌GYS1和肝臟GYS2的蛋白表達水平

Tab.4 Comparison of skeletal muscle GYS1 and liver GYS2 protein expression between three groups表4 3組大鼠骨骼肌GYS1和肝臟GYS2蛋白表達水平比較（n=6，±s）

Tab.4 Comparison of skeletal muscle GYS1 and liver GYS2 protein expression between three groups表4 3組大鼠骨骼肌GYS1和肝臟GYS2蛋白表達水平比較（n=6，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與CG-IUGR組比較，P＜0.05。

組別Control組CG-IUGR組CG-IUGR+腸菌組F GYS1 1.04±0.15 0.66±0.06a 0.92±0.12b 16.105＊＊GYS2 0.83±0.13 0.53±0.08a 0.68±0.08b 13.605＊＊

2.2.6 骨骼肌和肝臟GYS 酶活性 與Control 組相比，CG-IUGR組骨骼肌和肝臟GYS的酶活性均降低（P＜0.05）；與CG-IUGR 組相比，CG-IUGR+腸菌組骨骼肌和肝臟GYS酶活性均升高（P＜0.05），見表5。

Tab.5 Comparison of skeletal muscle and liver GYS enzyme activity between three groups表5 3組大鼠骨骼肌和肝臟GYS酶活性比較（n=6，U/mg，±s）

Tab.5 Comparison of skeletal muscle and liver GYS enzyme activity between three groups表5 3組大鼠骨骼肌和肝臟GYS酶活性比較（n=6，U/mg，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與CG-IUGR組比較，P＜0.05。

組別Control組CG-IUGR組CG-IUGR+腸菌組F骨骼肌30.49±4.67 15.98±2.22a 22.47±2.23ab 30.005＊＊肝臟24.29±3.54 11.37±4.05a 17.92±2.82ab 20.337＊＊

2.3 3 組大鼠腸道菌群多樣性和結構分析 3 組大鼠腸道菌群OTU 以及Shannon、Simpson 指數比較差異均無統計學意義，而CG-IUGR組的ACE、Chao1指數低于Control 組（P＜0.05）；與CG-IUGR 組相比，CG-IUGR+腸菌組的ACE、Chao1 指數升高（P＜0.05）。見表6。3 組腸道雙歧桿菌相對豐度差異有統計學意義（n=5，F=4.202，P＜0.05），與CG-IUGR組（0.06±0.04）相比，CG-IUGR+腸菌組（1.12±1.00）腸道雙歧桿菌相對豐度增加（P＜0.05），但Control組大鼠（0.40±0.25）和CG-IUGR 組大鼠的雙歧桿菌相對豐度無統計學意義。

Tab.6 Diversity analysis of intestinal flora in each group表6 各組大鼠腸道菌群的多樣性分析（n=5，±s）

Tab.6 Diversity analysis of intestinal flora in each group表6 各組大鼠腸道菌群的多樣性分析（n=5，±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較，b與CG-IUGR組比較，P＜0.05。

組別Control組CG-IUGR組CG-IUGR+腸菌組F OTU 834.60±119.19 740.40±64.72 844.40±71.11 2.109 ACE指數1 295.55±184.59 1 052.62±116.26a 1 324.59±189.60b 4.005＊Chao1指數1 177.70±138.77 1 003.46±104.74a 1 182.60±88.66b 4.101＊Shannon指數3.85±0.43 3.80±0.34 3.86±0.30 0.046 Simpson指數0.07±0.02 0.08±0.02 0.08±0.05 0.176

3 討論

DM是常見的代謝紊亂性疾病，主要與遺傳及環境因素改變等有關。DM 的發病可追溯至胚胎發育的時期。大量研究發現，胚胎期營養不良個體成年后易患肥胖及DM等代謝性疾?。?-2］。Long等［7］采用孕期攝入33%正常飲食量的方法建立IUGR 大鼠模型，IUGR 大鼠出生體質量及BMI 均顯著低于對照組，之后出現生長追趕并在3 周時體質量超過對照組，該大鼠在9 周齡時的BMI 超過對照組。鄭銳丹等［8］采用孕期30%正常飲食量的方法建立IUGR 大鼠模型，發現剛出生的IUGR大鼠體質量及身長明顯低于對照組，在12周齡時該大鼠的體質量及BMI均顯著高于對照組。Wu 等［9］發現低蛋白飲食法建立IUGR 大鼠亦得到相同的結果?？梢姴煌椒◤椭频腎UGR 動物模型可有不同程度的生長追趕及肥胖傾向。本研究通過低熱量飲食法建立的IUGR大鼠，在其生長發育過程中的身長、體質量及BMI 也顯著高于對照組大鼠，提示低熱量飲食法建立的IUGR大鼠也有生長追趕現象及肥胖傾向。

糖尿病的發病機制主要表現為INS分泌減少和IR 效應。Wang 等［10］通過對比正常出生的胎兒與長期處于饑餓環境中的妊娠期母體所產的胎兒在成年后T2DM的患病率，發現后者成年后患T2DM的風險明顯增加。Long等［7-8］發現IUGR大鼠在成年后存在葡萄糖耐受不良及INS敏感性受損現象。Chen等［11］采用缺氧干預妊娠期母體建立IUGR小鼠模型，發現該小鼠成年后出現糖代謝異?，F象。本研究發現8周齡CG-IUGR 大鼠對葡萄糖和INS 的耐受性均降低，糖負荷15 min的血清INS水平均增高，提示低熱量飲食法建立的CG-IUGR 大鼠亦具有葡萄糖耐受不良及IR效應。

GYS 是糖原合成的關鍵限速酶，對維持血糖的動態平衡起重要作用。哺乳動物的GYS主要包括兩個亞型，GYS1主要表達于骨骼肌，GYS2主要表達于肝臟。研究顯示，GYS 的表達及活性降低是DM，特別是T2DM 發病的重要機制［12-14］。Ren 等［12］研究表明T2DM 大鼠肝糖原含量顯著降低，GYS 酶活性同步下調；Oyenihi等［13］采用高糖飲食和腹膜內注射低劑量鏈脲佐菌素的方法復制T2DM 大鼠模型，發現其骨骼肌糖原含量顯著降低，GYS酶活性同步降低；Luo 等［14］的研究證實T2DM 小鼠肝糖原和肌糖原含量顯著降低。這些研究提示T2DM大鼠存在糖原合成功能受損現象，且其機制可能與GYS 的表達水平及活性降低有關。Xirouchaki 等［15］發現GYS1 基因敲除小鼠餐后血糖明顯升高，同時骨骼肌糖原含量明顯下降，表現出明顯的葡萄糖耐受不良和IR 效應。Deng 等［16］采用添加高糖和高胰島素的培養基培養IR-HepG2 細胞，發現其細胞糖原含量顯著降低，同時GYS2的表達水平及活性顯著下調。本研究也發現成年CG-IUGR 大鼠骨骼肌GYS1 和肝臟GYS2 mRNA和蛋白的表達水平下調，同時其相應組織GYS 的酶活性也同步降低，提示低熱量飲食法建立的CG-IUGR大鼠存在糖代謝異常，其機制可能與GYS的表達下調和酶活性降低有關。

腸道菌群與機體的多種生理和病理活動密切相關。Fassatoui等［17］發現，T2DM患者腸道疣微菌門嗜黏蛋白-艾克曼菌的相對豐度降低，且與其血糖水平及糖化血紅蛋白水平呈負相關。Zhang 等［18］通過高脂飲食和腹腔注射鏈脲佐菌素建立T2DM 大鼠，發現其腸道菌群的多樣性降低且組成發生改變，表現為厚壁菌門乳桿菌屬的相對豐度增加。另有學者發現T2DM 大鼠腸道嗜黏蛋白-艾克曼菌的相對豐度降低，硬壁菌門/擬桿菌門的比例升高［19］。Yu 等［20］研究發現，與移植正常小鼠腸菌的無菌小鼠相比，移植了T2DM 小鼠腸菌的無菌小鼠FBG 水平顯著升高，同時腸道擬桿菌門的相對豐度明顯增加。有學者研究發現，移植了正常成人腸道菌群的T2DM 小鼠以及給予雙歧桿菌灌胃的T2DM 小鼠，二者的血糖水平均有所降低［21-22］。這些研究提示T2DM 大鼠和小鼠均表現出不同程度的腸菌組成和豐度改變。本研究中CG-IUGR組大鼠與Control組相比較，腸道菌群ACE、Chao1 指數降低，表明其物種豐富度下降；與CG-IUGR 組相比，CG-IUGR+腸菌組大鼠腸道菌群ACE、Chao1 指數增高，表明其物種豐富度有所增加；與CG-IUGR 組大鼠相比，CG-IUGR+腸菌組大鼠相應組織GYS 的表達及活性均有所提升，其肥胖傾向及對葡萄糖和INS 的耐受性均有所改善。結合既往研究提示，本研究認為IUGR 可降低CGIUGR大鼠的糖代謝能力，其機制可能與腸道菌群豐富度降低下調了GYS 的表達及酶活性有關，但二者之間的關系還需要進一步研究證實。另外，本研究觀察到CG-IUGR+腸菌組腸道雙歧桿菌的相對豐度與CG-IUGR組相比有所增高，但該變化在Control組和CG-IUGR組間差異無統計學意義，可見雙歧桿菌的改變與CG-IUGR 大鼠糖代謝異常之間的關系還需要進一步實驗證實。

Li 等［23］采用8%蛋白飲食法建立IUGR 小鼠，發現IUGR小鼠出生后胰島面積減少及INS表達降低，提示胰腺發育受損。相萌等［24］采用低蛋白飲食法復制IUGR 小鼠模型，亦發現相同結果，證實IUGR 個體存在胰島發育不良的問題。本研究結果發現，CG-IUGR 組大鼠FINS 水平相比Control 組大鼠下調，提示CG-IUGR 大鼠血清FINS 水平的降低可能與其胰腺發育受損有關，也可能是由于模型復制方法及糖代謝受損程度不同等導致IR 效應的進展不同有關。

綜上，本研究結果表明，IUGR 可通過下調骨骼肌和肝臟GYS 的表達及活性降低CG-IUGR 大鼠的糖代謝功能，其機制可能與腸道菌群改變有關。