沉默Sp5對mEPMCs中Wnt信號通路相關因子及增殖能力的影響

柏宇，蘭雪嬌，唐璟，文雨，呂明敏，宋慶高

腭裂是常見的先天性出生缺陷之一，是一種基因與環境相互作用引起的多基因遺傳病［1-2］。其易感基因包括干擾素調節轉錄因子6（IRF6）、亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）、骨形態發生蛋白4（BMP4）等［3-4］。研究發現，轉錄因子特異蛋白5（Sp5）與胚胎發育相關，Sp5基因敲除會引起非洲爪蟾色素沉著、顱面軟骨、背鰭等嚴重缺損［5-6］。本課題組前期研究微量元素鋅與C57BL/6J 小鼠腭裂的關系時，利用基因芯片檢測腭突組織中鋅指蛋白Sp家族成員，發現在胚胎14.5 d 時缺鋅組腭突組織中Sp5mRNA表達高于常鋅組和富鋅組，故推測鋅指蛋白Sp5基因可能是腭裂候選基因［7］。進一步采用不同濃度鋅飼料喂養孕鼠，發現在腭突融合期缺鋅導致腭裂的發生，并使其子代Sp5基因表達水平升高，推測Sp5 在調控腭的發育過程中起到負性調節作用［8］。利用免疫組織化學染色檢測胎鼠腭胚突中Sp5表達變化，發現腭發育期間Sp5在腭突間充質及上皮細胞中表達均為陽性［9］。Wnt 信號通路在多項研究中被證明參與調控腭的發育［10-11］。然而，目前關于Sp5、Wnt信號通路是否參與小鼠腭發育過程的研究尚少見。本研究利用慢病毒載體沉默小鼠胚胎腭突間充質細胞（mouse embryo palatal mesenchymal cells，mEPMCs）中的Sp5基因，探討Sp5 表達變化對Wnt信號通路及體外mEPMCs增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 DMEM/F12 培養基、胰酶均購自美國Gibco公司；BI胎牛血清購自北京沃卡威生物技術有限公司；中性蛋白酶粉購自北京索萊寶科技有限公司；Sp5 沉默慢病毒、聚凝胺Polybrene 購自漢恒生物科技（上海）有限公司；高效RIPA 裂解液、BCA 蛋白含量檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；超敏化學發光底物（ECL）試劑盒購自美國Millipore 公司；Sp5 兔多克隆抗體購自北京博奧森生物技術有限公司；廣譜細胞角蛋白（Pan-Cytokeratin，P-CK）兔單克隆抗體、絲氨酸/蘇氨酸激酶（GSK-3β）兔單克隆抗體、Wnt家族成員3a（Wnt3a）兔單克隆抗體、特異性周期蛋白D1（CyclinD1）兔單克隆抗體購自美國CST 公司；波形蛋白（Vimentin）兔單克隆抗體、β-連環蛋白（β-catenin）兔單克隆抗體購自英國Abcam公司；微管蛋白（β-tubulin）兔單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；PCR引物購自上海生工生物工程股份有限公司/擎科生物有限公司；TRIzol購自美國Thermo 公司；SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ購自日本TaKaRa；細胞計數（CCK-8）試劑盒購自日本同仁化學研究所；5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷（EdU）試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司；CO2培養箱購自美國Forma；熒光顯微鏡購自日本Olympus；酶標儀購自美國Thermo；凝膠成像分析儀購自美國Bio-Bad；PCR檢測儀器購自美國Bio-Bad。體式顯微鏡購自瑞士Leica；流式細胞儀購自貝克曼庫爾特商貿（中國）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物 C57BL/6J小鼠60只（其中雌鼠40只，雄鼠20只），8～10周齡，體質量20 g及以上，購自貴州省遵義醫科大學動物中心［動物生產許可證號：SCXK（黔）-2021-0002］，飼養于遵義醫科大學動物中心無特定病原體級的動物房中。本實驗所有涉及實驗動物的操作均由遵義醫科大學動物實驗倫理委員會倫理審查并同意后實施［批準號：遵醫倫審（2021）1-053號］。

1.2.2 原代mEPMCs 的獲取、培養 按照雌雄比例為2∶1 于每晚20：00合籠，次日早晨8:00檢查小鼠陰道栓，有陰道栓的小鼠記為孕期0.5 d（GD0.5），稱體質量并記錄。GD10.5 時，雌鼠體質量增加超過2 g且腹部隆起判定為妊娠。于GD14.5時，采用脫頸法處死孕鼠，75%乙醇消毒，無菌眼科剪剖開孕鼠腹部，取出腹中胚胎置于無菌培養皿中。剝離羊膜及絨毛膜，體式顯微鏡下用無菌眼科剪及眼科鑷獲取1 塊大小約0.5 cm×0.4 cm 的腭突組織，放入現配的中性蛋白酶液（由0.037 g 中性蛋白酶粉劑和5 mL PBS 液配制而成）中，4 ℃冰箱內過夜。次日取出腭突組織，PBS 液清洗3 次，加入1 mL 0.125%胰酶消化腭突組織6～8 min，至無明顯組織塊時即消化完成。消化結束后加入含10%血清的DMEM/F12 完全培養基2 mL 終止消化，1 000 r/min 離心5 min，棄上清液，加入3 mL 完全培養基，重懸細胞沉淀制成細胞懸液，接種于T25培養瓶中，置于5%CO2、37 ℃細胞培養箱培養。

1.2.3 原代mEPMCs 的鑒定 0.125%胰酶消化細胞制成細胞懸液并計數，1 000 r/min離心5 min，重懸細胞，以8 000個/孔細胞接種于96孔板。待細胞長至70%～80%時，4%多聚甲醛固定15 min；0.5% Triton X-100 通透室溫孵育30 min；5%山羊血清封閉30 min；吸凈封閉液，將一抗Vimentin（稀釋比例1∶500）及P-CK（稀釋比例1∶250）加入相應的孔內，4 ℃冰箱內過夜；熒光二抗孵育1 h（稀釋比例1∶500，此步開始注意避光操作），DAPI染核，滴加抗熒光衰減劑，熒光顯微鏡下采集圖像。

1.2.4 慢病毒載體轉染mEPMCs 慢病毒包裝的Sp5基因沉默載體由漢恒生物科技（上海）有限公司設計、構建、包裝完成。載體為pHBLV-U6-MCS-CMV-ZsGreen-PGK-PURO，抗性標簽為嘌呤霉素（Puromycin），熒光標簽為綠色熒光蛋白（ZsGreen）。基于Sp5基因的編碼序列CDS 區，公司設計了3個shRNA 干擾靶點并將其命名為shRNA4、shRNA5、shRNA6。Sp5基因shRNA干擾靶點序列及病毒滴度見表1。

Tab.1 Sp5 gene shRNA interfered with target sequences and viral titers表1 Sp5基因shRNA干擾靶點序列及病毒滴度

（1）最佳感染復數（MOI）篩選及轉染效率測定。將實驗分為5組：空白對照組（在常規培養基上培養細胞）、空載病毒組（空載慢病毒載體轉染細胞）、shRNA4 組（攜帶Sp5-shRNA4 的慢病毒載體轉染細胞）、shRNA5 組（攜帶Sp5-shRNA5 的慢病毒載體轉染細胞）、shRNA6 組（攜帶Sp5-shRNA6的慢病毒載體轉染細胞）。將MOI設置為10、30、50，Polybrene 為4 mg/L［12］進行測定。以8 000 個/孔細胞接種于96 孔板。培養24 h 后轉染，向每孔加入25 μL 病毒混合液（具體配制見表2）和0.05 μL Polybrene；轉染4 h后加入25 μL完全培養基，置于5%CO2、37 ℃細胞培養箱培養。轉染72 h后，熒光顯微鏡下觀察各組細胞ZsGreen的表達情況，同時采用Western blot 法篩選出干擾效果最好的Sp5-shRNA，生長穩定后可繼續后續實驗。（2）實驗分組及轉染。實驗設3組：空白對照組（在常規培養基上培養細胞）、空載病毒組（空載慢病毒載體轉染細胞）、Sp5-shRNA組（干擾效果最好的攜帶Sp5-shRNA 慢病毒載體轉染細胞）。以2×105個/孔細胞接種于6孔板，置于5%CO2、37 ℃細胞培養箱培養。細胞培養24 h后轉染，轉染操作同上。

Tab.2 Preparation of virus mixture in each group表2 各組病毒混合液配制情況（μL）

1.2.5 Western blot 檢測Sp5、β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1蛋白的表達 轉染72 h后收集細胞樣品，加入蛋白裂解液裂解細胞30 min，用BCA蛋白定量測定試劑盒檢測總蛋白量。樣品經10%SDS-PAGE 凝膠電泳（80 V恒壓）分離，然后通過半干轉印法（電壓25 V、電流2.5 A、時間10 min）轉印到PVDF膜。將膜放入5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h。孵育一抗Sp5（1∶1 000）、β-catenin（1∶7 500）、GSK-3β（1∶1 000）、Wnt3a（1∶1 000）、CyclinD1（1∶30 000）、β-tubulin（1∶4 500）。4 ℃孵育過夜后TBST 清洗3 次，加入HPR 標記的山羊抗兔IgG 二抗（1∶6 000）室溫孵育2 h。TBST 清洗3 次，然后加入200 μL 顯色液覆蓋膜的表面，顯影拍照。用Image J 圖像分析軟件各蛋白條帶進行灰度值分析，以β-Tubulin為內參，計算各蛋白條帶相對表達量。

1.2.6 RT-qPCR 檢測β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1mRNA 表達 轉染72 h 后收集mEPMCs，用TRIzol 提取其總RNA，測定總RNA 濃度。按照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA。反應體系：5×PrimeScript Buffer（4 μL）、PrimeScriptRT Enzyme Mix I（1 μL）、Oligo dT Primer（1 μL）、Random 6 mers（1 μL）、Total RNA（1 000 ng/所測總RNA 濃度），加RNase Free ddH2O 補足至20 μL。按照TaKaRa 公司SYBR Green 染料法進行RT-qPCR 擴增反應實驗。以GAPDH為內參，反應條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。引物序列見表3。每個樣本均設3個復孔，重復3次取均值，以2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達量。

Tab.3 PCR primer sequence表3 PCR引物序列

1.2.7 CCK-8實驗 以8 000個/孔細胞、100 μL/孔體積接種至96 孔板，每組重復3 個復孔。待細胞長至50%～70%進行轉染。以換液的形式加入CCK-8 液（完全培養基∶CCK-8液=10∶1，110 μL/孔），孵箱中孵育2 h，培養24、48、72 h時通過酶標儀檢測其在450 nm波長處的光密度（OD）值。

1.2.8 EdU 實驗 細胞轉染72 h，向各組細胞加入EdU 染料孵育8 h，對各組細胞進行固定、通透、孵育Apollo?染色反應液及Hoechst 33342復染細胞核，熒光顯微鏡拍照。EdU染色后呈紅色熒光，Hoechst 33342 染色后呈藍色熒光，將這兩種熒光重疊后得到EdU陽性增殖細胞，呈粉紫色熒光。用FIJI軟件計數相同視野下EdU 標記細胞及Hoechst 陽性細胞數，細胞增殖率=（EdU 陽性增殖細胞數/Hoechst 陽性細胞數）×100%。

1.2.9 流式細胞術檢測細胞周期 細胞轉染72 h后，按組別用PBS液清洗1次，1 mL 0.125%胰酶消化細胞制成單細胞懸液，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入2 mL完全培養基，混勻。1 500 r/min離心5 min，棄上清液，加入500 μL 70%預冷乙醇，置于4 ℃冰箱固定過夜。次日用PBS 清洗細胞，1 500 r/min 離心5 min，棄上清液，向細胞沉淀中加入100 μL RNaseA，吹打重懸細胞，放入37 ℃水浴鍋，孵育30 min。加入400 μL PI染色液混勻，置于4 ℃冰箱避光孵育30 min。采用流式儀檢測各組細胞周期的分布情況，用modifit軟件分析不同時相的細胞百分比。

1.3 統計學方法 采用Graph Pad Prism 8.0.2軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行Tukey法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 倒置相差顯微鏡下小鼠原代mEPMCs 形態變化 小鼠原代mEPMCs接種后6～8 h時，細胞開始貼壁生長，多為三角形或多邊形，其中可見大量漂浮的死細胞；接種24 h 時，細胞數量增多，細胞體積開始增大，細胞相互接觸；接種48 h時，細胞快速生長，細胞接觸更加緊密，細胞逐漸鋪滿培養瓶底，呈長梭形或漩渦狀排列生長；接種48～72 h 時，細胞鋪滿培養瓶瓶底。見圖1。

Fig.1 Morphology of primary mouse palatal mesenchymal cells under inverted phase contrast microscope(×40，scale=200 μm)圖1 倒置相差顯微鏡下小鼠原代mEPMCs形態（×40，標尺=200 μm）

2.2 小鼠mEPMCs的免疫熒光鑒定 Vimentin染色見細胞質著色，綠色熒光表達較強，胞核呈藍色熒光表達；P-CK 染色胞質未見綠色熒光表達，胞核呈藍色熒光表達，見圖2。

Fig.2 Identification of primary mouse palatal mesenchymal cells Vimentin and P-CK by fluorescence(×200，scale=50 μm)圖2 小鼠mEPMCs Vimentin及P-CK免疫熒光鑒定（×200，標尺=50 μm）

2.3 各組細胞轉染后綠色熒光表達情況 當MOI=10 時，ZsGreen 表達約50%；當MOI=30 或50 時，ZsGreen 表達達80%以上，見圖3。確定后續實驗轉染條件為MOI=30，Polybrene=4 mg/L。

Fig.3 The expression of ZsGreen in each group 72 h after transfection(×40，scale=200 μm)圖3 轉染72 h后各組細胞ZsGreen表達情況（×40，標尺=200 μm）

2.4 各組細胞轉染效率的測定 空白對照組、空載病毒組、shRNA4組、shRNA5組、shRNA6組中Sp5蛋白表達水平分別為：0.703±0.118、0.742±0.059、0.677±0.050、0.594±0.051、0.406±0.028。shRNA6 組中Sp5蛋白表達最低（F=11.400，P＜0.05），故后續實驗使用shRNA6慢病毒。見圖4。

Fig.4 The influence of Sp5-shRNA on mEPMCs of Sp5 expression圖4 Sp5-shRNA對mEPMCs Sp5表達的影響

2.5 沉默Sp5基因后對mEPMCs中β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1 蛋白表達的影響 Sp5-shRNA組mEPMCs 中β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1蛋白表達水平高于空白對照組和空載病毒組（P＜0.05），空載病毒組與空白對照組差異無統計學意義（P＞0.05），見圖5、表4。

Fig.5 Western blot results of mouse palatal mesenchymal cells β-catenin,GSK-3β,Wnt3a and CyclinD1圖5 小鼠mEPMCs中β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1蛋白印跡圖

Tab.4 Comparison of β-catenin,GSK-3β,Wnt3a and CyclinD1 protein between three groups of cells表4 各組細胞中β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1蛋白表達比較（n=3，±s）

Tab.4 Comparison of β-catenin,GSK-3β,Wnt3a and CyclinD1 protein between three groups of cells表4 各組細胞中β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1蛋白表達比較（n=3，±s）

＊P＜0.05；a與空白對照組比較，b與空載病毒組比較，P＜0.05。

組別空白對照組空載病毒組Sp5-shRNA組F CyclinD1 0.76±0.22 0.81±0.33 1.73±0.04ab 16.760＊β-catenin 0.55±0.06 0.62±0.02 1.12±0.22ab 16.640＊GSK-3β 2.26±0.08 2.67±0.120 4.19±0.74ab 16.180＊Wnt3a 0.24±0.03 0.28±0.04 0.34±0.03ab 14.500＊

2.6 沉默Sp5基因后對mEPMCs中β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1 mRNA 表達的影響 Sp5-shRNNA 組mEPMCs 中β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1 mRNA相對表達量高于空白對照組和空載病毒組（P＜0.05），空載病毒組與空白對照組差異無統計學意義（P＞0.05），見表5。

Tab.5 Expression of β-catenin,GSK-3β,Wnt3a and CyclinD1 mRNA in each group of cells表5 各組細胞中β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1 mRNA表達比較（n=3，±s）

Tab.5 Expression of β-catenin,GSK-3β,Wnt3a and CyclinD1 mRNA in each group of cells表5 各組細胞中β-catenin、GSK-3β、Wnt3a、CyclinD1 mRNA表達比較（n=3，±s）

＊P＜0.05；a與空白對照組比較，b與空載病毒組比較，P＜0.05。

組別空白對照組空載病毒組Sp5-shRNA組F β-catenin 0.83±0.09 1.02±0.02 1.26±0.10ab 24.550＊GSK-3β 0.96±0.22 0.96±0.09 1.96±0.39ab 14.310＊Wnt3a 0.90±0.36 1.03±0.08 1.92±0.30ab 12.370＊CyclinD1 0.70±0.24 1.01±0.01 1.61±0.33ab 11.940＊

2.7 沉默Sp5基因后對mEPMCs增殖的影響 轉染mEPMCs 48 h、72 h 后，Sp5-shRNNA 組細胞增殖能力高于空白對照組和空載病毒組（P＜0.05），空載病毒組與空白對照組差異無統計學意義（P＞0.05），見表6。

Tab.6 Comparison of cell proliferation ability between three groups表6 各組不同時點細胞增殖能力比較 （n=3，±s）

＊P＜0.05；a與空白對照組比較，b與空載病毒組比較，P＜0.05。

組別空白對照組空載病毒組Sp5-shRNA組F OD450 72 h 1.24±0.19 1.21±0.21 1.81±0.11ab 8.457＊24 h 0.31±0.05 0.33±0.06 0.39±0.03 2.419 48 h 0.64±0.06 0.67±0.05 0.84±0.01ab 16.500＊

2.8 沉默Sp5基因后對EdU 陽性細胞增殖率的影響 空白對照組、空載病毒組、Sp5-shRNNA 組EdU陽性細胞增殖率分別為：14.00%±0、14.67%±0.58%、22.67%±4.62%，Sp5-shRNA 組高于空白對照組和空載病毒組（F=9.662，P＜0.05），空載病毒組與空白對照組差異無統計學意義（P＞0.05），見圖6。

Fig.6 Cell proliferation indexes in each group detected by EdU immunofluorescence(×40，scale=200 μm)圖6 EdU免疫熒光檢測各組細胞增殖情況（×40，標尺=200 μm）

2.9 沉默Sp5基因后對細胞周期的影響 Sp5-shRNA 組mEPMCs 處于S 期的細胞比例高于空白對照組和空載病毒組，G0/G1 期細胞比例低于空白對照組和空載病毒組（P＜0.05），各組G2/M 期細胞比例差異無統計學意義（P＞0.05）；空載病毒組各細胞周期與空白對照組差異無統計學意義（P＞0.05），見表7。

Tab.7 Cell cycle distribution of each group of cells表7 各組細胞的細胞周期分布（n=3，%，±s）

Tab.7 Cell cycle distribution of each group of cells表7 各組細胞的細胞周期分布（n=3，%，±s）

＊P＜0.05；a與空白對照組比較，b與空載病毒組比較，P＜0.05。

組別空白對照組空載病毒組Sp5-shRNA組F G0/G1期87.15±0.72 87.75±0.33 84.66±0.16ab 37.200＊S期7.65±0.16 7.40±0.07 10.48±0.20ab 371.900＊G2/M期5.20±0.82 4.85±0.26 4.85±0.28 0.430

3 討論

腭裂是常見的先天性出生缺陷，不僅造成患者面部畸形等生理功能及心理障礙，也給患者及其家庭帶來沉重的經濟負擔［13-15］。目前臨床上已有成熟的手術治療方案，但對于其發病機制尚未完全闡明，因此積極進行病因研究，建立早期干預措施，對于唇腭裂的發生、預防、治療和預后均至關重要［16］。

慢病毒載體是一種逆轉錄病毒載體，具有轉染到分裂或非分裂細胞的能力，轉染效率高以及擴大靶基因片段等優勢［17］。本實驗選用特異性強、攜帶ZsGreen 的慢病毒載體轉染mEPMCs。轉染72 h后，熒光顯微鏡下觀察空載病毒組、Sp5-shRNA 組中均可見ZsGreen表達，初步提示細胞轉染成功。隨后經Western blot驗證轉染效率，shRNA6組Sp5蛋白表達水平最低，提示成功轉染mEPMCs，達到實驗要求，選擇shRNA6慢病毒進行后續實驗。

鋅指蛋白是真核細胞中表達較為廣泛的轉錄蛋白之一，其通過鋅離子與特殊的氨基酸殘基結合折疊后形成鋅指結構，具有發育和分化過程、轉錄以及轉錄后的調節和激活、信號轉導等多種生物學功能［18］。轉錄因子特異蛋白Sp5是鋅指蛋白超家族中的一族成員，其在肝細胞癌、胃癌和結腸癌中表達上調，將Sp5 轉入不表達內源性Sp5 蛋白的MCF-7 細胞，可誘導出顯著的促生長活性，并與Wnt/βcatenin 信號通路有關［19］。另有研究發現，Sp5基因可作為特異性轉錄共激活因子，在小鼠胚胎和胚胎干細胞分化Wnt/β-catenin 通路信號傳遞中起重要作用［20］。本課題組前期通過GO 富集數據分析發現，Sp5在調控器官形成和發育、骨骼系統形成和發育等生物功能存在明顯差異，故推測Sp5基因對腭骨乃至顱頜面骨骼的生物學發育可能起到關鍵作用［7］。有研究發現，在mEPMCs 中過表達Sp5，Wnt信號通路中β-catenin、GSK-3β、Wnt3a 表達均下調［12］。本研究結果顯示，在mEPMCs 中沉默Sp5后，Wnt 信號通路相關因子β-catenin、GSK-3β、Wnt3a表達均上調，提示Sp5 可能通過Wnt 信號通路參與調控腭的發育。

腭部的發育涉及增殖、遷移和凋亡等細胞過程之間的緊密協調［21］。本研究CCK-8實驗結果顯示，Sp5-shRNA組細胞增殖能力較空白對照組和空載病毒組升高；EdU熒光染色實驗結果顯示，Sp5-shRNA組細胞增殖率較空白對照組和空載病毒組增加；提示沉默Sp5基因可促進mEPMCs細胞增殖。

細胞增殖能力的改變與細胞周期有關。本研究結果顯示，沉默Sp5基因后mEPMCs 處于DNA 合成期（S期）的細胞比例升高，DNA合成前期（G0/G1期）的細胞比例降低，提示沉默Sp5基因后處于S 期的mEPMCs細胞增多。多種基因蛋白參與調控細胞周期，其中CyclinD1是調控細胞周期的關鍵蛋白［22］，可通過調節細胞周期蛋白依賴性激酶（Cyclindependent kinases，CDKs）的活性，促進細胞從G1 期向S 期轉變，從而促進細胞增殖［23］。本研究結果顯示，沉默Sp5基因后，mEPMCs 中CyclinD1 蛋白和mRNA 表達水平高于空白對照組和空載病毒組，提示沉默Sp5基因后CyclinD1 表達上調，可能會使mEPMCs細胞周期由G0/G1期向S期轉換，從而促進mEPMCs 細胞增殖。陳玨蓉等［24］研究表明，地塞米松可影響小鼠胚胎腭突Shh下游信號傳遞和初級纖毛解聚，抑制CyclinD1表達，從而抑制小鼠胚胎腭突細胞增殖，與本研究結果相似，提示Sp5通過Wnt信號通路調控mEPMCs細胞增殖及細胞周期參與腭的發育，但沉默Sp5基因后，Wnt 信號通路分子間是否存在相互作用尚需進一步探究。

綜上所述，沉默Sp5基因可提高Wnt 信號通路相關因子β-catenin、GSK-3β、Wnt3a 表達，促進mEPMCs 細胞增殖及使其細胞周期從G0/G1 期向S期轉變。深入研究Sp5基因在腭裂發生發展中的作用及其機制，這將為唇腭裂畸形的病因、早期篩查研究、疾病預防、診療提供新思路。