臍帶間充質干細胞外泌體對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺部炎癥的作用機制探討

聶進，劉代順，張建勇，劉楚，周亮△

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種以持續氣道癥狀和氣流受限為特征的異質性疾病，具有高發病率、高病死率和高疾病負擔的特點，嚴重影響患者的生存生活質量［1-2］。據調查統計，我國COPD 的發病形勢仍然嚴峻［3］。間充質干細胞具有促進損傷組織修復和再生、免疫調節抑制炎癥反應、維持組織穩態的功能［4］。大量研究表明，間充質干細胞的治療潛力主要取決于其通過旁分泌產生的細胞外囊泡，而外泌體（Exosomes）是囊泡中主要的效應活性物質［5］。外泌體通過其攜帶的蛋白質、脂質、mRNA 和miRNA等生物活性因子轉移至免疫細胞、內皮細胞等受體細胞中發揮調節修復作用［6］，可應用于炎癥性疾病［7］、自身免疫性疾病［8］、癌癥［9］等多種疾病的治療。間充質干細胞來源的外泌體是一種基于無細胞的新的治療策略。研究發現，間充質干細胞外泌體是COPD、哮喘等肺部疾病的潛在治療藥物［10-11］，但其具體機制尚未完全明確。本研究通過香煙煙熏聯合脂多糖（LPS）霧化吸入的方法構建COPD大鼠模型，探究人臍帶間充質干細胞來源的外泌體對COPD氣道炎癥的作用及其機制，為外泌體治療COPD 提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8 周齡雄性SPF 級SD 大鼠18 只，體質量190～210 g，購自長沙天勤生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0014。本研究經遵義醫科大學附屬醫院動物倫理委員會審批后實施（批準號：KLL-2019-019）。

1.2 實驗試劑與儀器 遵義牌香煙（焦油量13 mg，煙堿量1.3 mg，一氧化碳量14 mg）購自貴州中煙工業有限責任公司遵義卷煙廠；LPS購自美國Sigma公司；人臍帶間充質干細胞外泌體購自天九再生醫學（天津）科技有限公司；白細胞介素（IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF）-α 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自湖南艾方生物科技有限公司；磷酸化核因子κB（p-NF-κB p65）兔單克隆抗體、核因子抑制蛋白（IκBα）兔單克隆抗體、β-肌動蛋白（β-actin）兔多克隆抗體購自英國Abcam 公司；Toll 樣受體4（TLR4）兔多克隆抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司；核纖層蛋白B1（Lamin B1）兔多克隆抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；放射免疫沉淀法緩沖液（RIPA）裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司；蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；RNAeasyTM動物RNA 抽提試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；StarScript Ⅲ反轉錄試劑盒、2×RealStar Fast染料法qPCR預混液購自北京康潤誠業生物科技有限公司；全波長酶標儀（1510）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；高速冷凍離心機（TGL-16）購自湖南湘儀有限公司；熒光定量PCR 儀（Mx3005P）購自美國Agilent公司；高速低溫組織研磨儀購自武漢賽維爾生物科技有限公司，全自動輪轉式切片機（RM2255）購自德國Leica 公司；希森美康全自動血細胞分析儀（XE2100）購自日本Sysmex公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 COPD 大鼠模型建立與分組 18 只SD 大鼠采用隨機數字表法分成Control 組、COPD 組、COPD+Exosome（Exo）組，每組6 只。COPD 組和COPD+Exo 組大鼠采用香煙煙熏聯合LPS 霧化吸入的方法建立COPD 模型，COPD 模型在Shu等［12-13］研究的基礎上進行適當調整，方法如下：將大鼠置于自制煙熏玻璃箱（50 cm×40 cm×40 cm）中，每周連續煙熏5 d，2 次/d（每次8 支煙，兩次間隔8 h），然后第6—7 天予10 mL LPS溶液（0.1 g/L）加入振動超聲霧化器中霧化吸入1 h，共持續24周。參考Shi等［14］研究，建模后第2天，COPD+Exo 組尾靜脈注射100 μL人臍帶間充質干細胞外泌體稀釋液（含外泌體2×107個），Control 組、COPD 組注射等量磷酸鹽緩沖液（PBS），各組注射1次，觀察1周。觀察大鼠的一般情況，記錄其行為學及呼吸系統癥狀的變化。本實驗研究的流程圖見圖1。

Fig.1 Flow chart of experimental study on inhibition of lung inflammation by human umbilical mesenchymal stem cell exosomes in COPD rats圖1 人臍帶間充質干細胞外泌體抑制COPD大鼠肺部炎癥的實驗流程圖

1.3.2 標本收集 各組大鼠經上述分組處理后1 周，經3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，固定，充分暴露腹腔，經腹主動脈采集外周血1 mL，室溫靜置2 h后，4 ℃、4 000 r/min離心15 min，收集上清液，置于-80 ℃冰箱保存備用；另外經真空抗凝管采血0.5 mL，于2 h 內在全自動血細胞分析儀上計數白細胞（WBC）、中性粒細胞（NEU）、單核細胞（MON）、淋巴細胞（LYM）等炎性細胞。放血處死大鼠，暴露胸腔及氣管，在氣管環狀軟骨上方作一小切口，結扎右肺門，用注射器及留置針經氣管切口向左肺緩慢注入2 mL PBS，反復沖洗3次后進行回收（回收率＞80%），獲得肺泡灌洗液（BALF），重復3次，4 ℃、1 500 r/min離心15 min，收集上清液，-80 ℃保存備用。

1.3.3 肺組織HE染色 取各組右下肺組織，4%多聚甲醛室溫固定24 h，然后50%～100%梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋并制作4 μm 厚的切片，行HE 染色，通過顯微鏡觀察肺組織的病理學變化。

1.3.4 BALF、血清及肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α水平的檢測 （1）ELISA 檢測BALF 和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。取1.3.2中各組收集的BALF及血清90 μL，嚴格參照IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA 試劑盒說明書檢測BALF 及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。（2）qRT-PCR 檢測肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 的表達。取各組右上肺組織20 mg，根據動物組織RNA 提取試劑盒說明書進行操作提取組織RNA 并進行濃度測定，按照反轉錄試劑盒說明書逆轉錄為cDNA，應用SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法進行實時熒光定量PCR 檢測。反應體系：DNA 模板1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×RealStar Fast SYBR qPCR Mix 10 μL，ddH2O 8 μL；反應條件：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。采用2-ΔΔCt法計算各基因相對表達水平。引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequence for qRT-PCR表1 qRT-PCR引物序列

1.3.5 Western blot 檢測肺組織中TLR4、p-NF-κB p65 和IκBα 蛋白的表達 取各組右中肺組織100 mg，剪切成細小碎片，加入1 mL含蛋白酶、磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液，在低溫研磨儀中充分研磨。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液，BCA 法測定蛋白濃度。SDS-PAGE 電泳后電轉至PVDF 膜上，封閉、TLR4（1∶600）、p-NF-κB p65（1∶1 000）、IκBα（1∶5 000）、Lamin B1（1∶1 000）及β-actin（1∶3 000）一抗4 ℃孵育過夜，山羊抗兔IgG（1∶1 000）室溫孵育90 min，ECL化學發光顯色成像，采用Image J軟件對條帶進行灰度分析。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0 及GraphPad Prism 8.0 軟件對數據進行統計分析和作圖，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況變化 制備COPD模型過程中，Control 組大鼠毛發干凈有光澤，活動劇烈，飲食規律，無咳嗽、喘息的表現；COPD 組大鼠出現咳嗽、氣促喘息的表現，并且毛發發黃無光澤，神情倦怠，活動緩慢，飲食減少；COPD+Exo 組經外泌體干預后，大鼠間斷咳嗽，無明顯喘息氣促，毛發較黃，精神良好，食欲較好，整體狀態較COPD組良好。

2.2 大鼠肺組織病理特征 HE 染色結果顯示，Control組大鼠肺泡結構完整，形態規則，無明顯炎性細胞浸潤；COPD 組大鼠肺泡結構紊亂，部分肺泡不規則擴張、融合成肺大皰甚至破裂，肺泡間隔增寬且可見較多炎性細胞浸潤，結合大鼠的一般情況提示香煙煙霧及LPS 吸入可成功建立COPD 大鼠模型；而COPD+Exo組大鼠肺泡結構較COPD組完整，肺泡擴張減輕，肺泡間隔炎性細胞浸潤減弱，見圖2。

Fig.2 Representative images of HE staining of lung tissue in each group of rats(×200)圖2 各組大鼠肺組織HE染色情況（×200）

2.3 大鼠外周血中炎性細胞計數 與Control 組相比，COPD組大鼠外周血WBC、NEU、MON、LYM計數均升高，而COPD+Exo組僅有WBC和LYM升高（P＜0.05）；與COPD 組相比，COPD+Exo 組大鼠外周血WBC、NEU、MON、LYM 計數均降低（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Number of inflammatory cells in peripheral blood of rats in each group表2 各組大鼠外周血炎性細胞計數（n=3，×109/L，±s）

Tab.2 Number of inflammatory cells in peripheral blood of rats in each group表2 各組大鼠外周血炎性細胞計數（n=3，×109/L，±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較，b與COPD組比較，P＜0.05。

組別Control組COPD組COPD+Exo組F LYM 0.25±0.00 2.63±0.19a 1.20±0.47ab 33.116＊WBC 0.48±0.07 3.10±0.27a 1.59±0.55ab 27.197＊NEU 0.77±0.24 2.01±0.20a 0.35±0.15b 39.738＊MON 0.03±0.00 0.15±0.01a 0.06±0.02b 51.100＊

2.4 大鼠BALF 和血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 炎性因子的表達 ELISA 結果顯示，與Control 組相比，COPD 組大鼠BALF 及外周血血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平升高（P＜0.05），COPD+Exo 組中除BALF 中的TNF-α 水平升高外（P＜0.05），其余指標差異均無統計學意義（P＞0.05）；與COPD 組相比，COPD+Exo 組大鼠BALF 及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平均降低（P＜0.05），見表3。

Tab.3 Expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in BALF and serum of rats in each group表3 各組大鼠BALF及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平（n=6，ng/L，±s）

Tab.3 Expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in BALF and serum of rats in each group表3 各組大鼠BALF及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平（n=6，ng/L，±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較，b與COPD組比較，P＜0.05。

組別Control組COPD組COPD+Exo組F BALF IL-1β 55.05±11.49 85.23±13.44a 61.02±6.42b 10.827＊IL-6 71.58±8.77 104.16±7.92a 84.66±12.84b 13.234＊TNF-α 290.51±28.28 513.71±59.00a 406.74±52.32ab 26.634＊組別Control組COPD組COPD+Exo組F血清IL-1β 64.02±6.84 88.54±8.44a 73.22±4.92b 9.708＊IL-6 72.00±4.45 90.99±0.97a 73.41±7.93b 8.036＊TNF-α 309.18±5.25 483.74±9.74a 364.64±2.40b 11.869＊

2.5 大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達 qRT-PCR 結果顯示，COPD 組和COPD+Exo 組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達水平均高于Control 組（P＜0.05）；COPD+Exo 組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA 表達水平低于COPD組（P＜0.05），見表4。

Tab.4 Expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in lung tissue of rats in each group表4 各組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達水平（n=6，±s）

Tab.4 Expression levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in lung tissue of rats in each group表4 各組大鼠肺組織中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表達水平（n=6，±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較，b與COPD組比較，P＜0.05。

組別Control組COPD組COPD+Exo組F TNF-α 1.02±0.18 5.17±0.35a 2.52±0.31ab 104.294＊IL-1β 1.00±0.02 3.10±0.31a 1.56±0.12ab 62.411＊IL-6 1.00±0.10 6.58±1.03a 1.65±0.02ab 51.588＊

2.6 大鼠肺組織TLR4/NF-κB通路中關鍵蛋白的表達水平 Western blot 結果顯示，與Control 組相比，COPD 組大鼠肺組織中TLR4、IκBα 表達水平降低，p-NF-κB p65 表達水平升高（P＜0.05）；COPD+Exo組大鼠肺組織中TLR4表達水平降低，p-NF-κB p65表達水平升高（P＜0.05），IκBα 表達水平變化差異無統計學意義（P＞0.05）；與COPD 組相比，COPD+Exo組大鼠肺組織TLR4、IκBα表達水平升高，p-NFκB p65表達水平降低（P＜0.05），見圖3、表5。

Tab.5 Comparison of TLR4,IκBα and p-NF-κB p65 protein levels in lung tissue between the three groups of rats表5 各組大鼠肺組織中TLR4、IκBα、p-NF-κB p65蛋白表達水平的比較（n=4，±s）

Tab.5 Comparison of TLR4,IκBα and p-NF-κB p65 protein levels in lung tissue between the three groups of rats表5 各組大鼠肺組織中TLR4、IκBα、p-NF-κB p65蛋白表達水平的比較（n=4，±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較，b與COPD組比較，P＜0.05。

組別Control組COPD組COPD+Exo組F p-NF-κB p65 0.31±0.02 0.92±0.10a 0.58±0.06ab 59.341＊TLR4 0.73±0.01 0.30±0.00a 0.56±0.02ab 824.637＊IκBα 0.50±0.03 0.23±0.01a 0.46±0.02b 130.246＊

Fig.3 Expression levels of TLR4,IκBα and p-NF-κB p65 protein in lung tissue of rats in each group detected by Western blot assay圖3 Western blot檢測各組大鼠肺組織中TLR4、IκBα、p-NF-κB p65蛋白的表達

3 討論

COPD 是以慢性氣道炎癥、不可逆氣流受限、肺功能損害為特征的復雜的異質性慢性呼吸系疾病，已成為全球負擔最重的疾病之一。COPD 的發病機制及最佳的治療方案仍未明確。80%～90%的COPD是由接觸香煙煙霧等有害氣體顆粒引起的［15］。吸煙會增加小氣道和肺組織中中性粒細胞、B細胞、巨噬細胞的數量，這些細胞釋放炎性因子、蛋白酶、趨化因子等導致氣道上皮及肺實質的損傷退化，最終導致COPD的發生［16］。

本研究在充分文獻復習的基礎上采用香煙煙霧煙熏聯合LPS 霧化吸入構建COPD 大鼠模型。既往研究顯示，COPD 動物模型可以由被動吸煙、氣管滴入或直接暴露于化學物質（LPS、NO2等）、氣管滴入彈性蛋白酶、腹腔注射香煙煙霧提取物、嚴重饑餓等誘發建立［17-18］。其中，被動吸煙能更好地模擬人患上COPD 的發病過程，是最經濟、操作簡單、成功率高的建模方法；LPS主要通過刺激中性粒細胞、單核細胞和內皮細胞釋放TNF-α、IL-1 等一系列炎性介質，引發蛋白酶-抗蛋白酶失衡，引起氣道和肺組織炎癥，最終發生肺氣腫［17］。雖然有許多實驗是通過滴鼻、靜脈注射或氣管插管滴入LPS 誘導肺部炎癥［19］，但環境中最常見的暴露途徑是吸入，吸入LPS或煙霧等有害顆粒更符合臨床疾病的發病過程。另外，低劑量LPS 霧化吸入可導致明顯且均勻分布的肺部炎癥［20-21］。本研究結果顯示，與Control組相比，COPD 組大鼠毛發發黃、暗淡，活動緩慢，飲食攝入減少，精神萎靡，出現咳嗽、喘息氣促的表現，肺組織HE 染色顯示肺泡結構紊亂，肺泡擴張融合成肺大皰、甚至破裂，肺泡間隔有大量炎性細胞浸潤，與文獻報道［22-24］一致，提示香煙煙熏聯合LPS 霧化吸入可成功建立COPD 動物模型。目前使用LPS 霧化吸入制備COPD 動物模型較少，這種造模方式值得在實驗研究中進行推廣應用。

針對現階段COPD的防治，尋找一種安全可靠、有效的治療策略，以減輕COPD肺部的炎癥性損傷，是一個亟需解決的重大課題。許多COPD的臨床前研究結果顯示，間充質干細胞通過抑制COPD 的炎癥反應［25］、細胞凋亡［26］，改善肺功能［27］及免疫調節［28］等達到治療的效果，提示間充質干細胞療法可能是一種有前景的COPD治療策略。然而有研究表明，干細胞療法存在臨床應用的安全問題，主要為干細胞移植伴隨的不良分化或惡性轉化，另外，其不易儲存、難以達到靶器官及體外擴增過程中易發生衰老等問題嚴重限制了其在臨床上的廣泛應用［29-30］。隨著研究的不斷深入，發現間充質干細胞通過旁分泌產生的外泌體具有與干細胞相同的作用，參與免疫調節與再生，已在許多動物模型中得到驗證［30-31］。外泌體是由多種細胞釋放的直徑為40～100 nm的多泡體小膜泡，具有靶向遞送、低免疫原性和高修復性的優點，其攜帶的蛋白質、脂質、mRNA 和miRNA 等生物活性物質在細胞間通訊中充當信使分子，并在組織損傷部位發揮修復作用［31］。有研究顯示，尾靜脈注射間充質干細胞外泌體可有效抑制小鼠急性肺損傷的肺部炎癥［32］，抑制成纖維細胞的增殖分化從而抑制肺纖維化的進程［33］，減輕肺氣腫［34］等。

本研究對COPD+Exo 組大鼠尾靜脈注射人臍帶間充質干細胞源外泌體，與COPD組大鼠相比，肺泡擴張減輕，炎性細胞浸潤減少，BALF、肺組織、血清中炎性細胞因子明顯降低，表明人臍帶間充質干細胞外泌體抗炎效果顯著，可減輕COPD 大鼠的肺部炎癥。

慢性炎癥是COPD 發病的關鍵機制。研究報道，香煙煙霧或LPS 可與氣道上皮細胞表面的Toll樣受體（如TLR4）結合誘導炎性細胞激活，并誘發促炎細胞因子（IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 等）的釋放，從而啟動機體免疫反應［35］。TLR4 介導的信號通路涉及多種轉錄因子，包括NF-κB、信號轉導和激活因子1（STAT1）、干擾素調節因子（IRFs）和激活蛋白1（AP1）等，均是調節炎癥反應的關鍵因子［36］。多項研究報道，TLR4/NF-κB信號通路介導COPD動物或患者的肺部炎癥［35，37］。本研究結果顯示，COPD組大鼠TLR4、IκBα 蛋白表達水平降低、p-NF-κB p65 蛋白表達水平升高，促使炎性因子釋放，從而導致COPD 的發生發展，這與既往研究一致，而間充質干細胞外泌體干預后可抑制炎癥反應，促使肺康復。

綜上，人臍帶間充質干細胞來源的外泌體可能通過調控TLR4/NF-κB 信號通路減輕COPD 大鼠肺部炎癥，促進肺康復，為外泌體治療COPD提供了實驗依據，有望作為COPD的無細胞治療的候選藥物。