補脾益腸丸重塑CD4+T細胞亞群穩態緩解潰瘍性結腸炎的機制研究

肖秋萍，趙暢，劉端勇，李姍姍，施旻，陳麗玲，鐘友寶，△

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種由多種病因引起、異常免疫介導的慢性非特異性腸道炎癥，其發病機制不明，多反復發作，甚至癌變［1］。近20年全球UC發病率和患病率呈明顯增長趨勢［2］；其治療藥物能迅速緩解UC 癥狀，但仍難以徹底治愈，同時伴有一些不良反應，因此亟需尋找更加有效的策略來控制UC 的發生與發展。補脾益腸丸（Bupi Yichang pill，BPYCP）具有益氣養血、溫陽行氣、澀腸止瀉之功，治療結腸炎的有效率超過90%，且復發率低、不良反應少［3］；然而BPYCP的作用機制鮮有報道。近期研究發現，CD4+T 細胞分化失衡是UC的重要發病機制，腸道組織炎性CD4+T細胞大量浸潤是UC患者常見的病理特征，嚴格控制調節性和炎性CD4+T細胞數量之間的平衡有助于防止失控的CD4+T細胞反應和隨后的腸道組織損傷［4］。基于此，本研究旨在探討BPYCP 對UC 小鼠CD4+T 細胞亞群分化的影響，為明確BPYCP 臨床治療UC 的作用機制和靶點提供實驗證據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 7～8周齡雄性SPF 級C57BL/6小鼠48只，體質量19～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK（湘）2019-0004。所有小鼠飼養于SPF屏障環境內，自由飲水和進食，實驗動物使用許可證號：SYXK（贛）2022-0002；本研究方案得到江西中醫藥大學動物倫理委員會的批準（許可號：JZLLSC2020-334）。

1.2 試劑及儀器 BPYCP購自白云山陳李濟藥廠有限公司（批號：K05190）；葡聚糖硫酸鈉（DSS，分子質量：36～50 ku；批號：160110）購自美國MP Biomedicals 公司；美沙拉嗪（5-ASA）購自Sigma-Aldrich 公司。4%多聚甲醛、切片石蠟、蘇木素伊紅染色液、BCA 檢測試劑盒（北京索萊寶）；實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒（北京聚合美）；流式細胞CD4、趨化因子受體3（CXC chemokine receptor 3，CXCR3）、白細胞介素（IL）-33 受體（IL-33R）、趨化因子受體6（CC chemokine receptor 6，CCR6）、CD25、叉頭狀轉錄因子P3（transcription factor forkhead box protein P3, Foxp3）、趨化因子受體5（CXCR5）抗體（美國BD Biosciences）；小鼠干擾素-γ（INFγ）、IL-4、IL-17A、IL-21、IL-10酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（美國Thermo）。EG1150H 型石蠟包埋機、RM2255 型石蠟切片機（德國Leica 公司），BX43 型光學顯微鏡（日本Olympus 公司），FACSCanto Ⅱ流式細胞儀（美國BD 公司），VCX150 型組織超聲勻漿機（美國Sonics 公司），Varios-kan Flash型多功能酶標儀（美國Thermo Fisher公司）。

1.3 動物分組及UC 模型建立 小鼠適應性飼養3 d 后，采用隨機數字表法分為對照組（Control 組，n=10）、模型組（DSS組，n=13）、模型+補脾益腸丸組（DSS+BPYCP 組，n=13）、模型+5-ASA組（DSS+5-ASA組，n=12），實驗為期3周。復發性UC 模型建立方法：Control 組連續3 周自由飲水；其他3 組于第1 周和第3 周自由飲用2.5%（w/v）DSS 溶液，第2 周自由飲水。藥物干預方法：從第2 周開始至實驗結束，DSS+BPYCP組、DSS+5-ASA 組小鼠分別灌胃3.0 g/kg BPYCP 和0.3 g/kg 5-ASA，每日1次，1 mL/次，Control 組和DSS組以相同體積生理鹽水灌胃。

1.4 結腸長度、質量及指數測定 每天同一時間對小鼠稱質量，觀察小鼠精神及進食狀態，并統計糞便黏稠度及便血情況。于實驗第21天2%戊巴比妥鈉深度麻醉安樂死小鼠，迅速分離結腸并測量結腸長度；清洗腸腔，濾紙吸干，結腸稱質量并計算相應指數。每組小鼠檢測10只，結腸質量指數=結腸質量（g）/體質量（g）×100%，單位結腸質量指數=結腸質量（g）/結腸長度（cm）×100%。

1.5 結腸組織病理變化觀察 近端結腸組織經固定、脫水、透明、包埋、切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光學顯微鏡采集圖片，由2位病理學老師隨機、盲法對各組結腸病理圖片進行病理損傷評分（n=6）。評分標準分為炎細胞浸潤程度、組織損傷程度兩個維度，分別為0～3分［5］。

1.6 流式細胞術檢測CD4+T 細胞亞群水平 小鼠腸系膜淋巴結經碾磨、過濾、洗滌，制備單細胞懸液；CD16/CD32 抗體封閉15 min；流式抗體（CD4、CXCR3、IL-33R、CCR6、CD25、CXCR5）室溫避光孵育30 min；Stain buffer洗滌2次，Fix/Perm溶液孵育30 min；Stain buffer 重懸，Perm/Wash 溶液孵育15 min 破核；流式抗體Foxp3 室溫孵育30 min 胞內染色；Perm/Wash 溶液重懸，Stain buffer 洗滌2 次；Stain buffer 定容500 μL，經流式細胞儀上機檢測；采用Flowjo 7.6.1 軟件分析流式結果（n=6）。 采用CD4+CXCR3+標記Th1 細胞，CD4+IL-33R+標記Th2 細胞，CD4+CCR6+標記Th17 細胞，CD4+CD25+、CD4+CD25+Foxp3+標記Treg 細胞，CD4+CXCR5+標記Tfh細胞。

1.7 ELISA 檢測細胞因子表達水平 結腸組織經裂解、勻漿、離心，BCA法檢測總蛋白水平，PBS標準化至2 000 μg/L。根據ELISA 檢測試劑盒說明書，檢測結腸組織中CD4+T細胞亞群分泌的炎性細胞因子INF-γ、IL-4、IL-17A、IL-10及IL-21水平（n=6）。

1.8 qPCR檢測CD4+T細胞亞群核轉錄因子表達水平 結腸組織經裂解、勻漿、離心、提取，檢測總RNA濃度及RNA完整性。將RNA 逆轉錄為cDNA，進行實時熒光定量檢測，反應體系共20 μL：cDNA 模板2 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 7 μL，SYBRgreen qPCR mix 10 μL。反應條件：95 ℃預變性60 s；95 ℃變性15 s，55～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共計40個循環。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，見表1。以β-actin為內參，根據2-ΔΔCt法計算目的基因表達水平（n=6）。目的基因包括：Th1 細胞核轉錄因子T-框蛋白21（T-box 21，T-bet）、Th2 細胞核轉錄因子GATA 結合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA-3）、Th17 核轉錄因子維甲酸相關核孤兒受體γt（retinoicr acid-related orphanreceptor γt，RORγt）、Tfh 細胞核轉錄因子B 細胞淋巴瘤-6（B cell lymphoma 6，Bcl-6）及Treg細胞核轉錄因子大鼠叉頭蛋白P3（rat forkhead protein P3，Foxp3）的mRNA。

Tab.1 Primer sequence for qPCR表1 qPCR引物序列

1.9 統計學方法 采用SPSS 22.0 軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BPYCP 對UC 小鼠的體質量及結腸質量的影響 實驗期間Control 組小鼠采食、活動狀態正常。第3 天，DSS 組、DSS+BPYCP 組及DSS+5-ASA 組多數小鼠糞便隱血檢測呈陽性，隨著造模時間推移，其陽性增強；第6 天，除Control 組外，其他組小鼠均表現出蜷縮、少進食、精神倦怠、體質量下降，并伴隨不同程度腹瀉、便血。第16天，DSS+BPYCP及DSS+5-ASA組的小鼠活動及體質量逐漸恢復，腹瀉、便血癥狀逐漸好轉，但DSS組小鼠的癥狀未見改善。

與Control 組比較，DSS 組小鼠的體質量及結腸長度減小，而結腸質量、結腸質量指數及單位結腸質量指數均增加（P＜0.05）；與DSS 組比較，DSS+BPYCP 組和DSS+5-ASA 組小鼠體質量及結腸長度均增加，且結腸質量、結腸質量指數及單位結腸質量指數均減小（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Changes of body weight and colon weight in mice of each group表2 各組小鼠的體質量及結腸質量的變化（n=10，±s）

Tab.2 Changes of body weight and colon weight in mice of each group表2 各組小鼠的體質量及結腸質量的變化（n=10，±s）

＊＊P＜0.01；a與Control組比較，b與DSS組比較，P＜0.05。

組別Control組DSS組DSS+BPYCP組DSS+5-ASA組F體質量/g 25.00±1.10 20.90±1.14a 24.00±1.34b 23.19±1.35ab 19.893＊＊結腸質量/g 0.22±0.02 0.34±0.05a 0.24±0.03b 0.28±0.05ab 20.206＊＊結腸質量指數/%0.90±0.09 1.64±0.20a 0.98±0.13b 1.19±0.23ab 36.325＊＊結腸長度/cm 8.70±0.70 7.16±0.65a 8.33±0.66b 8.01±0.70ab 9.216＊＊單位結腸質量指數/%2.58±0.18 4.82±0.70a 2.85±0.49b 3.45±0.60ab 34.355＊＊

2.2 BPYCP 對UC 小鼠結腸黏膜組織損傷的影響 HE染色顯示，Control組結腸的上皮及腺體結構完整，黏膜下無潰瘍，亦無炎性細胞浸潤；DSS 組腸壁增厚、固有層腺體排列紊亂，黏膜下存在明顯的潰瘍，黏膜層和黏膜下層有大量的淋巴細胞、單核細胞等炎性細胞浸潤；DSS+BPYCP 組和DSS+5-ASA 組的黏膜上皮較DSS組更為完整，腺體排列更規整，炎性細胞浸潤更少，見圖1。Control 組、DSS 組、DSS+BPYCP 組和DSS+5-ASA 組的結腸病理損傷評分依次為（0.17±0.41）、（4.67±1.03）、（2.33±1.03）、（2.50±1.05）分（n=6，F=23.856，P＜0.01）。DSS組評分高于Control 組；而與DSS 組比較，DSS+BPYCP 組和DSS+5-ASA組的結腸病理損傷評分降低（P＜0.05）。

Fig.1 Changes of colonic mucosal injury in mice of each group(HE stanining)圖1 各組小鼠結腸黏膜損傷的變化（HE染色）

2.3 BPYCP對UC小鼠CD4+T細胞亞群的影響

2.3.1 Th1細胞 與Control組比較，DSS組Th1細胞比例升高，且結腸組織中IFN-γ 水平增加（P＜0.05）；與DSS 組比較，DSS+BPYCP 組的Th1 細胞比例降低（P＜0.05），但IFN-γ 水平差異無統計學意義；DSS+5-ASA 組的Th1 細胞比例及IFN-γ 水平較DSS組降低（P＜0.05），見圖2、表3。

Fig.2 Changes of Th1 cell ratio in mice of each group圖2 各組小鼠Th1細胞比例的變化

Tab.3 Changes of Th1 cell proportion and IFN-γ inmice of each group表3 各組小鼠Th1細胞比例及IFN-γ的變化（n=6，±s）

Tab.3 Changes of Th1 cell proportion and IFN-γ inmice of each group表3 各組小鼠Th1細胞比例及IFN-γ的變化（n=6，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a 與Control 組比較，b 與DSS 組比較，P＜0.05，表4—8同。

IFN-γ/（ng/L）472.00±81.82 714.67±181.52a 517.83±107.22 467.33±103.84b 5.280＊組別Control組DSS組DSS+BPYCP組DSS+5-ASA組F CD4+CXCR3+Th1/%1.08±0.55 2.37±0.62a 1.22±0.42b 1.12±0.37b 9.056＊＊

2.3.2 Th2細胞 與Control組比較，DSS組Th2細胞比例升高，IL-4水平增加（P＜0.05）；與DSS組比較，DSS+BPYCP 組及DSS+5-ASA 組Th2 細胞比例降低（P＜0.05），但IL-4 水平差異無統計學意義，見圖3、表4。

Fig.3 Changes of Th2 cell ratio in mice of each group圖3 各組小鼠Th2細胞比例的變化

Tab.4 Changes of Th2 cell proportion and IL-4 level in mice of each group表4 各組小鼠Th2細胞比例及IL-4的變化（n=6，±s）

組別Control組DSS組DSS+BPYCP組DSS+5-ASA組F CD4+IL-33R+Th2/%0.44±0.17 2.02±0.52a 0.52±0.13b 1.14±0.54ab 21.051＊＊IL-4/（ng/L）360.17±97.07 530.00±110.16a 394.83±88.43 463.83±84.08 3.742＊

2.3.3 Th17 與Control 組相比，DSS組Th17細胞比例及IL-17A 水平均升高（P＜0.01）；與DSS 組比較，DSS+BPYCP組和DSS+5-ASA組的Th17細胞比例及IL-17A水平降低（P＜0.01），見圖4、表5。

Fig.4 Changes of Th17 cell ratio in mice of each group圖4 各組小鼠Th17細胞比例的變化

Tab.5 Changes of Th17 cell proportion and IL-17A level in mice of each group表5 各組小鼠Th17細胞比例及IL-17A的變化（n=6，±s）

Tab.5 Changes of Th17 cell proportion and IL-17A level in mice of each group表5 各組小鼠Th17細胞比例及IL-17A的變化（n=6，±s）

組別Control組DSS組DSS+BPYCP組DSS+5-ASA組F CD4+CCR6+Th17/%0.99±0.26 3.59±0.91a 1.15±0.27b 1.42±0.33b 33.020＊＊IL-17A/（ng/L）50.55±16.53 161.50±44.18a 65.75±21.19b 80.23±19.13b 19.347＊＊

2.3.4 Treg 與Control組比較，DSS組CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例及IL-10水平均降低（P＜0.01）；與DSS 組比較，DSS+BPYCP 組的CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例及IL-10 水平均升高（P＜0.05），DSS+5-ASA 組的CD4+CD25+Treg、CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞比例及IL-10水平差異無統計學意義，見圖5、表6。

Fig.5 Changes of Treg cell ratio in mice of each group圖5 各組小鼠Treg細胞比例的變化

Tab.6 Changes of Treg cell proportion and IL-10 level in mice of each group表6 各組小鼠Treg細胞比例及IL-10的變化（n=6，±s）

Tab.6 Changes of Treg cell proportion and IL-10 level in mice of each group表6 各組小鼠Treg細胞比例及IL-10的變化（n=6，±s）

組別Control組DSS組DSS+BPYCP組DSS+5-ASA組F CD4+CD25+Treg/%13.19±3.52 4.16±1.88a 15.37±3.76b 7.94±2.89a 16.072＊＊CD4+CD25+Foxp3+Treg/%18.73±4.58 8.60±2.87a 19.10±5.16b 12.42±2.90 9.715＊＊IL-10/（ng/L）1 138.50±230.64 651.33±139.71a 1 455.67±288.92b 828.33±137.10 17.212＊＊

2.3.5 Tfh 與Control 組比較，DSS 組Tfh 細胞比例及IL-21 水平均升高（P＜0.05）；與DSS 組比較，DSS+BPYCP 組Tfh 細胞比例和IL-21 水平降低（P＜0.05），而DSS+5-ASA 組的Tfh 細胞比例降低，IL-21水平差異無統計學意義，見圖6、表7。

Fig.6 Changes of Tfh cell ratio in mice of each group圖6 各組小鼠Tfh細胞比例的變化

Tab.7 Changes of Tfh cell proportion and IL-21 level in mice of each group表7 各組小鼠Tfh細胞比例及IL-21的變化（n=6，±s）

Tab.7 Changes of Tfh cell proportion and IL-21 level in mice of each group表7 各組小鼠Tfh細胞比例及IL-21的變化（n=6，±s）

組別Control組DSS組DSS+BPYCP組DSS+5-ASA組F CD4+CXCR5+Tfh/%4.81±1.46 21.65±6.22a 6.19±2.08b 5.95±2.45b 30.210＊＊IL-21/（ng/L）294.67±98.06 602.67±122.60a 391.83±92.46b 448.83±86.15 9.820＊＊

2.4 BPYCP調節UC小鼠CD4+T細胞亞群核轉錄因子表達 與Control 組比較，DSS 組T-bet、GATA-3、RORγt 及Bcl-6 mRNA 表達水平均升高，而Foxp3 mRNA 表達水平下降（P＜0.01）。與DSS 組比較，DSS+BPYCP 組和DSS+5-ASA 組的T-bet、GATA-3、RORγt、Bcl-6 mRNA 水平降低，DSS+BPYCP 組的Foxp3 mRNA 水平升高（P＜0.05），而DSS+5-ASA 組的Foxp3 mRNA水平差異無統計學意義，見表8。

Tab.8 Changes of the expression of nuclear transcription factors in CD4+T cell subsets in mice of each group表8 各組小鼠CD4+T細胞亞群核轉錄因子表達的變化（n=6，±s）

Tab.8 Changes of the expression of nuclear transcription factors in CD4+T cell subsets in mice of each group表8 各組小鼠CD4+T細胞亞群核轉錄因子表達的變化（n=6，±s）

組別Control組DSS組DSS+BPYCP組DSS+5-ASA組F T-bet 0.91±0.44 3.15±1.05a 1.80±0.57b 1.59±0.54b 11.174＊＊GATA-3 1.09±0.42 5.10±1.67a 2.30±0.69b 3.19±0.62ab 17.970＊＊RORγt 1.22±0.53 12.16±3.61a 5.38±1.92ab 7.71±2.20ab 22.917＊＊Bcl-6 0.83±0.27 20.27±6.30a 8.69±2.80ab 13.49±3.72ab 26.148＊＊Foxp3 1.01±0.34 0.20±0.11a 0.55±0.18ab 0.35±0.15a 16.252＊＊

3 討論

基于補脾、澀腸、止瀉等多種功效，中藥復方BPYCP 治療UC 具有良好療效［6］。中醫將UC 歸為“久痢”、“痢疾”范疇，病因為邪盛正虛、飲食不潔、情志不調，以致脾腎虧虛；應以養血生肌、補脾益腸、涼血止痢為治療原則［7］。BPYCP 具有補中益氣、健脾和胃、托毒排膿和澀腸止瀉等功效，臨床報道BPYCP 可提高UC 患者的臨床總有效率、改善黏膜癥狀和臨床癥狀積分，且不良反應少［3］。目前，BPYCP 臨床常用于慢性結腸炎、UC 等疾病的治療。本研究結果亦顯示出了BPYCP緩解小鼠UC癥狀及結腸組織損傷的良好療效，表現為便血、腹瀉等癥狀的緩解，小鼠體質量、結腸長度增加，結腸質量、結腸質量指數減小，結腸組織黏膜上皮，腺體排列更規整。5-ASA是臨床治療輕中度UC的首選藥物，對于實驗性UC 小鼠亦具有良好療效，因此本研究選擇5-ASA 作為陽性對照藥，發現BPYCP 改善UC 的臨床癥狀及結腸相關指數的療效與5-ASA 相當，這進一步表明BPYCP有臨床治療UC的潛力。

UC 的發病涉及遺傳、環境、免疫失調等多因素及其相互作用的影響。輔助性CD4+T細胞在穩態下可調節免疫反應，抵御病原體侵襲，失調時可導致過敏和自身免疫疾病（包括UC）［8］。腸道組織炎性CD4+T細胞大量浸潤是UC患者常見的病理特征，表現為腸道組織中記憶表型CD4+T細胞數量顯著高于健康人，而Treg 數量卻顯著減少［9］。在識別抗原主要組織相容性復合物分子和適當的共刺激后，靜止狀態的naive CD4+T 細胞將增殖并分化為多種功能不同的效應細胞，這些效應細胞根據其功能、轉錄因子和標志性細胞因子被分類為不同的亞群，如Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、Treg 和Tfh［8］。機體處于穩態時，T 細胞主要表現為調節性表型，而在UC 病理生理過程中Th1、Th2、Th9、Th17反應增強，而Treg反應降低，表現為T細胞失衡狀態［10-11］。與健康者相比，活動期UC患者結腸內存在更高比例的CD4+T細胞，其亞群分化存在明顯的紊亂［9］，表現為Th1、Th2、Th17 及Tfh 的細胞數量增加［12］，Treg 細胞數量下降［13］；且Th1、Th2、Th17 細胞分泌的INF-γ、IL-4、IL-17A 等炎性因子水平升高，而其核轉錄因子Tbet、GATA-3、RORγt 表達水平亦上升［12，14-15］；Tfh 細胞高表達Bcl-6［16］；然而，Treg 分泌的IL-10 抗炎因子水平及其選擇性表達的轉錄因子Foxp3 水平下降［17］。與既往研究相同，本研究中UC小鼠的CD4+T細胞亞群分化失調，顯示為Th1、Th2、Th17、Tfh細胞數量明顯增多，并高表達核轉錄因子T-bet、GATA-3、RORγt、Bcl-6以及炎性細胞因子INF-γ、IL-4、IL-17A、IL-21，而Treg 細胞數量減少且Foxp3 和IL-10水平明顯下降。

越來越多成功的T 細胞治療方法（如誘導T 細胞凋亡、干擾Th1/Th17平衡）表明失調的T淋巴細胞是慢性炎癥的關鍵中介因子［9，13，18］。藥物干預可拮抗CD4+T細胞亞群異常分化并達到治療UC的療效，如烏梅湯抑制Th1/Th17 細胞分化和促炎細胞因子分泌緩解UC［14］。筆者推測BPYCP 或可通過重塑CD4+T 細胞亞群分化平衡發揮治療UC 的療效。本研究發現，BPYCP可拮抗DSS導致的UC小鼠CD4+T細胞亞群分化失衡現象，如下調結腸炎小鼠腸系膜淋巴結的Th1、Th2、Th17 及Tfh 細胞比例，降低促炎因子INF-γ、IL-4、IL-17A 及IL-21 的分泌及核轉錄因子T-bet、GATA-3、RORγt 及Bcl-6 的mRNA 水平，而上調Treg細胞比例、IL-10水平及Foxp3表達。

綜上所述，本研究表明BPYCP 可有效緩解DSS誘導的實驗性UC，其潛在作用機制與調節腸道組織CD4+T 細胞亞群分化失衡相關，這為后續BPYCP 抗UC 作用機制研究奠定了良好基礎。課題組后期將通過藥代動力學及高效液相色譜技術解析BPYCP抗UC的關鍵物質基礎；通過單細胞測序、轉錄組學、蛋白質組學進一步解析BPYCP 調控CD4+T 細胞分化的信號網絡，進而明確BPYCP 抗UC 的物質基礎及作用機制，豐富中醫藥治療疾病的理論內涵。