基于標準湯劑的海金沙草配方顆粒質量標準研究

魏家保，唐雙燕，趙偉志，黃凱偉，蔡素琴，張輝，譚沛

（華潤三九現代中藥制藥有限公司，廣東 惠州 516000/華潤三九醫藥股份有限公司，廣東 深圳 518000）

海金沙草為海金沙科植物海金沙Lygodium japonicum（Thunb.）Sw. 及小葉海金沙Lygodium microphyllum（Cav.）R.Br.的干燥地上部分。收載于《廣東省中藥材標準》（2011 年版）中，具有清熱解毒、利水通淋的功效[1]，主產于廣東、浙江、湖南、四川、重慶、廣西、福建等地[2-3]。海金沙草中的化學成分主要有酚酸類和苯丙素類、黃酮類、三萜類、揮發油類以及脂肪酸類成分[4-6]。研究表明海金沙草具有利膽、降血糖、防治尿結石、抗氧化、抗菌、抗病毒和抗雄性激素等作用[7-9]。

中藥配方顆粒是以標準湯劑為基準，采用現代方法經標準化工藝制備而成，既符合傳統中醫辨證論治的要求，又具備質量穩定、攜帶方便、衛生可靠等優勢[10-12]，在臨床被越來越廣泛使用。為保障中藥配方顆粒臨床用藥與傳統湯劑的一致性，在《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》中，將標準湯劑作為橋接，評價及控制中藥配方顆粒的質量。近年來，對海金沙草的研究多限于成分研究[13-14]、含量測定[15-17]等，關于特征圖譜及薄層的研究甚少[18]，更無海金沙草標準湯劑質量標準的相關報道。故本研究以市售5 個主產地18 批海金沙草飲片為材料，遵循標準湯劑制備方法，計算出膏率，并以咖啡酸為指標成分，考察其在標準湯劑中的轉移率，同時建立了標準湯劑的特征圖譜分析方法及薄層色譜法（TLC）鑒別方法，為建立海金沙草配方顆粒的質量標準提供數據支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀：Thermo Ultimate 3000 色譜系統，包括LPG-3400SDN 型四元梯度輸液泵、WPS-3000SL 型自動進樣器、TCC-3000SD 型色譜柱溫箱、DAD-3000 型二極管陣列紫外檢測器、Chromeleon 7 色譜管理系統（賽默飛世爾科技有限公司）；ME36S 百萬分之一天平［梅特勒托利多科技（中國）有限公司］；XS204十萬分之一天平［梅特勒托利多科技（中國）有限公司］；SK5200H 超聲波儀（上海科導超聲儀器有限公司）；薄層自動成像儀（TLC visualizer2）、展開缸、硅膠GF254薄層板（青島海洋化工廠）。

1.2 試藥

海金沙草對照藥材（批號：280067-202103）購于上海鴻永生物科技有限公司；對照品咖啡酸（批號：110885-201703，質量分數：99.7%）、原兒茶酸（批號：110809-202207，質量分數：97.5%）、4-香豆酸（批號：112037-202102，質量分數：99.7%）、異槲皮苷（批號：111809-202205，質量分數：96.3%）、山柰酚-3-O-蕓香糖苷（批號：112007-202103，質量分數：94.0%）、蒙花苷（批號：111528-202213，質量分數：94.6%）均購于中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水；三氯甲烷、甲酸、甲醇、正丁醇等其他試劑均為分析純。

1.3 樣品及制備方法

18 批海金沙草藥材分別來源于四川宜賓縣、重慶合川區、江西泰和縣、廣東湛江遂溪縣以及廣西來賓合山市。經安徽中醫藥大學劉守金教授鑒定為海金沙科植物海金沙Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.的干燥地上部分。詳細信息見表1。

表1 18批海金沙草藥材信息及編號Table 1 Sample information and number of 18 batches of Lygodium japonicum（Thunb.）Sw

本研究根據《中藥配方顆粒質量控制與標準制定技術要求》[19]制備海金沙草標準湯劑，并根據標準湯劑的標準制備海金沙草配方顆粒。

海金沙草標準湯劑制備方法：取海金沙草飲片100 g，加12 倍水，浸泡30 min，采用砂鍋先武火煮沸，再文火煎煮30 min，200 目濾布趁熱濾過，藥渣再加10 倍水，先武火煮沸，再文火煎煮25 min，200目濾布趁熱濾過，合并濾液；減壓濃縮（60°C）成浸膏，冷凍干燥，即得標準湯劑凍干粉。

海金沙草配方顆粒制備方法：取海金沙草飲片7 500 g，加12 倍量水，浸泡30 min，武火煮沸，再文火煎煮30 min，200目濾布過濾；藥渣再加10倍量水煎煮25 min，合并2 次濾液，經70 ℃減壓濃縮為相對密度1.02~1.10 g/mL 的流浸膏，噴霧干燥（進風溫度：150~210 ℃，出風溫度：70~115 ℃），加麥芽糊精至1 000 g，混勻，制粒，即得海金沙草配方顆粒（每1 g配方顆粒相當于7.5 g飲片）。

2 方法與結果

2.1 含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse XDBC18（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相為甲醇∶乙腈∶0.2%磷酸溶液（6∶6∶88），檢測波長為320 nm，柱溫為30 ℃，流速為1.0 mL/min，進樣量為10 μL，理論板數按咖啡酸峰計算應不低于3 000。

2.1.2 對照品溶液的制備 取咖啡酸對照品適量，精密稱定，加50%（體積分數，下同）甲醇制成每1 mL含10 μg的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取海金沙草飲片粉末（過3 號篩）1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

取海金沙草標準湯劑、配方顆粒適量，研細，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率350 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 含量測定方法學驗證

2.1.4.1 專屬性試驗 分別精密吸取“2.1.2”項下的對照品溶液、“2.1.3”項下供試品溶液及陰性樣品（空白溶劑）溶液10 μL，按“2.1.1”項下色譜條件依法進樣測定，結果見圖1。結果顯示，待測成分咖啡酸與相鄰成分達到基線分離，陰性樣品無干擾。

圖1 海金沙草飲片、標準湯劑及配方顆粒中咖啡酸測定的HPLC色譜圖Figure 1 HPLC chromatograms of caffeic acid determination in decoction pieces，standard decoction and formula granules of Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.

2.1.4.2 精密度試驗 取同一份海金沙草標準湯劑供試品溶液（批號：BT01），重復進樣6 次，結果顯示咖啡酸峰面積RSD為0.9%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 重復性試驗 取同一批海金沙草標準湯劑（批號：BT01），制備6 份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件測定。結果顯示，咖啡酸平均質量分數為0.74 mg/g，RSD為1.5%，表明方法重復性良好。

2.1.4.4 穩定性試驗 取同一份海金沙草標準湯劑供試品溶液（批號：BT01），配制后在第0、2、6、10、12、18、24 h 按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，結果顯示，咖啡酸峰面積的RSD 值為1.4%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.4.5 線性關系考察 精密稱取咖啡酸對照品10.360 mg，置25 mL 容量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL 含咖啡酸413.157 μg 的對照品儲備液。精密量取對照品儲備液0.5、1、2、2.5、5、10 mL，分別置于100 mL容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，制得咖啡酸質量濃度分別為2.066、4.132、8.263、10.329、20.658、41.316 μg/mL 的系列對照品溶液，進樣測定，記錄各濃度的色譜峰面積。以色譜峰峰面積為縱坐標（Y），對照品質量濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線，得到回歸方程Y=5.288 261×104X-8.935 719×104，R2=0.999。結果表明咖啡酸對照品在2.066~41.316 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.4.6 加樣回收率考察 分別精密稱取咖啡酸對照品1.911、3.612、5.621 mg，置3 個25 mL 量瓶中，加50% 甲醇制成每1 mL 含咖啡酸0.076、0.144、0.224 mg的對照品儲備液。精密量取上述對照品儲備液1 mL，分別置于100 mL 容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，制得咖啡酸質量濃度分別為0.000 76、0.001 44、0.002 24 mg/mL的系列對照品溶液。取海金沙草標準湯劑（批號：BT01）約0.05 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，平行操作9份，每份分別精密加入25 mL 上述對照品溶液，按“2.1.3”項下方法制備9份供試品溶液，進樣測定，結果顯示，咖啡酸的平均加樣回收率分別為100.1%、98.9%、99.4%，結果見表2，表明回收率良好。

表2 海金沙草標準湯劑中咖啡酸加樣回收率試驗結果Table 2 The caffeic acid of recovery rate of Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.standard decoction

2.1.5 樣品的測定 按照“2.1.1”項下色譜條件，測定18 批海金沙草飲片、標準湯劑以及3 批配方顆粒中的咖啡酸質量分數，標準湯劑中咖啡酸轉移率按照以下公式進行計算：

式中：Wa 為標準湯劑中咖啡酸的質量分數，X為飲片出膏率（標準湯劑出膏率根據標準湯劑凍干粉質量占飲片投入量比例計算），Wb 為飲片中咖啡酸的質量分數。配方顆粒理論含量值按照以下公式進行計算：

式中：Wa為標準湯劑中咖啡酸的質量分數，Wc為配方顆粒中咖啡酸的理論質量分數，X為飲片出膏率（標準湯劑出膏率根據標準湯劑凍干粉質量占飲片投入量比例計算），Y為配方顆粒對應飲片量，結果見表3。

表3 海金沙草標準湯劑中咖啡酸質量分數及轉移率結果Table 3 The caffeic acid content and transfer rate of Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.standard decoction

2.1.6 質量分數測定結果分析 由測定結果可知，海金沙草配方顆粒中咖啡酸質量分數理論值范圍為0.17~1.05 mg/g，均值為0.60 mg/g，均值±30%為0.42~0.78 mg/g，最終以實測范圍確定配方顆粒的咖啡酸質量分數為0.17~1.10 mg/g，在均值±2SD 范圍內（0.05~1.11 mg/g）；18 批標準湯劑中咖啡酸轉移率范圍為48.7%~92.8%，均值73.8%，均值±30%范圍為51.7%~96.0%。確定配方顆粒中咖啡酸轉移率范圍為48.0%~93.0%。

另外，3 批配方顆粒中咖啡酸實測質量分數（轉移率）分別為0.65 mg/g（86.5%）、0.64 mg/g（85.1%）、0.61mg/g（81.1%），均在相關范圍內，且與對應批次的標準湯劑凍干粉各質量屬性（出膏率、含量及轉移率）基本一致，表明該制備工藝及質量范圍較為合理。

2.2 特征圖譜的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱為CAPCELL CORE C18柱（4.6 mm × 150 mm，2.7 μm），流動相為乙腈（A）和0.2%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0~20 min，6%A→15%A；20~40 min，15%A→20%A；40~50 min，20%A→32%A；50~55 min，32%A），檢測波長0~14 min 為254 nm，14 min~55 min 為320 nm，柱溫為20 ℃，流速為0.70 mL/min，進樣量為10μL，理論板數以咖啡酸峰計算應不低于3 000。

2.2.2 參照物溶液的制備 取海金沙草對照藥材0.6 g，置具塞錐形瓶中，加水25 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次25 mL，合并正丁醇液，蒸干，放冷，殘渣加70%甲醇20 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，濾過，取續濾液，作為對照藥材參照物溶液。另取“2.1.2”項下的咖啡酸對照品溶液，作為對照品參照物溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 分別取海金沙草標準湯劑、配方顆粒0.1 g，加水10 mL使溶解，用水飽和正丁醇萃取2 次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，放冷，殘渣加70%甲醇20 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

2.2.4 特征圖譜方法學驗證

2.2.4.1 精密度試驗 取同一份供試品溶液（批號：BT01），連續進樣6 次，記錄色譜圖，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 值，結果表明，11 個特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值均小于2%。表明方法的精密度良好。

2.2.4.2 重復性試驗 取同一批樣品（批號：BT01），制備6 份供試品溶液，進樣分析，記錄色譜圖，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 值。結果表明，11 個特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD均小于2%。表明本方法的重復性良好。

2.2.4.3 穩定性試驗 取同一份供試品溶液（批號：BT01），分別在配制后第0、4、8、12、16、24 h 進樣。記錄色譜圖，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 值。結果表明，11個特征峰的相對保留時間和相對峰面積RSD 均小于2%，供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.5 特征圖譜的建立與分析

2.2.5.1 特征峰的指認 參照“2.2.1”項下色譜條件，經對照品比對，確認色譜峰1 為原兒茶酸，色譜峰4 為咖啡酸，色譜峰6 為4-香豆酸，色譜峰7 為異槲皮苷，色譜峰8 為山柰酚-3-O-蕓香糖苷，色譜峰11為蒙花苷，結果見圖2。

圖2 海金沙草標準湯劑對照品定位液相色譜圖Figure 2 Reference location chromatograms of Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.standard decoction

2.2.5.2 特征圖譜的建立 取“1.3”項下18 批海金沙草藥材制備成海金沙草標準湯劑，同時制備3 批海金沙配方顆粒，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.1”項下色譜條件進行測定，將實驗數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，將各色譜峰匹配，建立對照特征圖譜，結果見圖3－圖4，18批海金沙草標準湯劑對照特征圖譜具有11個特征峰，共有特征峰峰面積之總和占總峰面積91.8%，表明選定的11 個特征峰可以作為海金沙草鑒定的標志峰。根據各峰響應值，選擇以峰4（咖啡酸）參照峰相應的峰為S 峰，計算其余特征峰與S峰相對保留時間，相對保留時間應在規定值的±10%之內，規定值為：0.48（峰1）、0.77（峰2）、0.94（峰3）、1.06（峰5）、1.45（峰6）、1.93（峰7）、2.17（峰8）、2.32（峰9）、2.52（峰10）、3.16（峰11）。

圖3 海金沙草標準湯劑對照特征圖譜Figure 3 Reference fingerprints of Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.standard decoction

圖4 18批海金沙草標準湯劑特征圖譜共有模式圖Figure 4 Common pattern chromatograms of 18 batches of Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.standard decoction

2.2.5.3 相似度評價 測得18 批海金沙草標準湯劑結果見表4－表5，將圖譜中各色譜峰匹配后，建立對照特征圖譜，計算得到各批次與對照圖譜的相似度在0.954~0.996之間，見表6。相似度較高，結果表明18 批樣品的化學成分較為類似，測得3 批配方顆粒的相似度分別為0.974、0.988、0.989，表明配方顆粒與標準湯劑具有較好的一致性。

表4 18批海金沙草標準湯劑相對保留時間結果Table 4 Results of relative retention time of 18 batches Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.standard decoction

表5 18批海金沙草標準湯劑的相對峰面積結果Table 5 Results of relative peak area of 18 batches Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.standard decoction

表6 18批海金沙草標準湯劑的相似度結果Table 6 Similarity results of 18 batches Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.standard decoction

2.2.5.4 聚類分析評價 采用SPSS 22.0 軟件，以共有峰的峰面積為變量，采用組間聯接法、歐平方式距離對18批海金沙草標準湯劑進行聚類分析，結果如圖5 所示。根據聚類分析結果，歐式間距小于5時，18 批海金沙草標準湯劑樣品可以分為3 類：第1類為BT16、BT17、BT18；第2 類為BT01、BT02、BT08、BT10、BT11、BT12、BT13、BT14、BT15；第3類為BT03、BT04、BT05、BT06、BT07、BT09，由聚類分析的結果可知，共有峰的峰面積與產地分布無明顯關聯。而特征峰峰面積在一定程度上反映了標準湯劑凍干粉中所含有的特征成分的質量分數高低，因此間接表明所含化學成分的種類與質量分數高地與產地關聯性不強。

圖5 系統聚類分析結果Figure 5 Results of systematic cluster analysis

2.2.5.5 主成分分析評價 采用SPSS 22.0 軟件，以11 個共有峰的峰面積為變量，進行主成分分析，結果見表7。以特征值大于1 和貢獻率達到85%以上作為提取原則，提取的主成分1 的特征值為7.146，貢獻率達到64.97%；提取的主成分2 的特征值為2.113，貢獻率達到19.21%；提取的主成分3 的特征值為1.065，貢獻率達到9.68%，這3個主成分的貢獻率達到了93.86%。對成分矩陣進行了具有Kaiser標準化的正交旋轉，得到11 個指標（峰）在3 個主成分旋轉成分矩陣，見表8。成分載荷矩陣的數值及符號代表變量在主成分當中的載荷，載荷越大，表明該化合物在主成分分析中作用越大。由表8結果可知，峰2、7、9、11 對主成分1 的影響力較大，其中峰7為異槲皮苷。峰6對主成分2的影響力較大，峰6 為4-香豆酸。峰1、10 對主成分3 的影響力較大，峰1為原兒茶酸，峰11為蒙花苷。

表7 主成分的特征值和方差貢獻率Table 7 Eigenvalues and variance contribution rates of principal components

表8 旋轉成分矩陣Table 8 Rotational component matrix

2.3 TLC法鑒別

2.3.1 TLC 法條件 取海金沙草標準湯劑凍干粉或配方顆粒1 g，研細，加無水乙醇30 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇1 mL 使溶解，作為供試品溶液。另取海金沙草對照藥材1 g，加水50 mL，加熱回流30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加無水乙醇30 mL，同法制成對照藥材溶液。按照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2020 年版“通則0502”）進行試驗。分別吸取供試品溶液4 μL、對照藥材溶液8 μL，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（10∶1∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，分別置紫外光燈254、365 nm 下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點和熒光斑點，結果見圖6－圖7。

圖6 18批海金沙草標準湯劑TLC色譜圖Figure 6 Results of TLC of 18 batches Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.standard decoction

圖7 3批海金沙草配方顆粒的TLC色譜圖Figure 7 Results of TLC of 18 batches Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.formula granules

2.3.2 TLC法鑒別結果 由圖6－圖7可見，海金沙草標準湯劑凍干粉供試品色譜中，在254、365 nm下，與海金沙草對照藥材色譜相應的位置上，均顯示相同顏色的斑點和熒光斑點，且斑點清晰、分離度好。3 批海金沙草配方顆粒的TLC 結果表明，斑點與標準湯劑基本一致、信息豐富，因此該方法可作為海金沙草標準湯劑及配方顆粒的有效鑒別方法。

3 討論

2020 年版《中華人民共和國藥典》[20]僅收載了海金沙藥材，來源為海金沙科植物海金沙Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.的干燥成熟孢子，而海金沙草被廣泛收載于各地方藥材標準，其中《廣東省中藥材標準》（2011 年版）[1]規定海金沙草為海金沙科植物海金沙Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.及小葉海金沙Lygodium microphyllum（Cav.）R.Br.的干燥地上部分。因此本研究過程中收集了海金沙基原，建立了相關標準。

本研究在特征圖譜方法開發過程中發現，海金沙草中化學成分色譜峰信息量極為豐富，采用的常規梯度洗脫方法也很難保證各特征峰的有效分離，因此在供試品制備方法考察中對比了不同提取溶劑（水、50%甲醇、甲醇、乙醇）、不同萃取溶劑（乙酸乙酯、三氯甲烷、水飽和正丁醇）的效果。三氯甲烷、乙酸乙酯因極性較小，導致萃取時部分特征峰缺失，水、50%甲醇、甲醇、乙醇所得特征峰數量雖多，但基線噪音過大，分離效果不佳。水飽和正丁醇萃取所得特征峰數量多且能呈現標準湯劑水溶性成分，共有峰峰面積占總峰面積90%以上，能較好地代表海金沙草配方顆粒整體質量，且特征峰更容易辨別和指認，因此最終確定了使用水飽和正丁醇進行萃取，可用于海金沙草配方顆粒的質量監測。

本文通過對海金沙草標準湯劑出膏率、主要成分質量分數及轉移率、HPLC 特征圖譜以及TLC 鑒別方法的研究，建立了海金沙草標準湯劑的質量標準，并驗證了配方顆粒與標準湯劑的一致性，可全面反映其質量，為相關質量控制和臨床應用提供依據。