酒炙對柴胡總黃酮以及皂苷類成分的影響

李雪儀，彭東輝，陳雨嬋，姜帆，秦安琪，曾元寧，匡海學，王秋紅

（1.廣東藥科大學中藥學院/廣東省中藥飲片規范化炮制工程技術研究中心，廣東 廣州 510006；2.黑龍江中醫藥大學藥學院/教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室/黑龍江中藥及天然藥物藥效物質基礎研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

柴胡在《中國藥典》中收錄為傘形科植物柴胡Bupleurum chinenseDC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifoliumWilld.的干燥根，按照2種不同種植物的性狀不同，前者習慣稱之為“北柴胡”，后者習稱“南柴胡”。柴胡性味微苦、微辛、微寒，具有退熱解表、疏肝解郁、截瘧等功效[1-3]。現代研究發現，柴胡主要含有黃酮、皂苷、多糖以及揮發油等物質[4]，在具有抗腫瘤、抗抑郁癥和抗纖維化、抗衰老作用，對肝、肺損傷的保護作用的同時，還有保護心臟、肝臟和腎臟等作用[5-13]。

柴胡的炮制方法有酒制、蜜制、醋制、鱉血制等，酒炙柴胡的應用歷史可追溯到《原機啟微》，附方[14]中提到：“瀉熱黃連湯治內障，癥同上，有眵淚，黃芩（酒炒）、黃連（酒洗）、柴胡（酒炒）、生地黃（酒洗，各一兩）、升麻（半兩）、龍膽草（三錢）”，酒炙后能增強柴胡行血通經、疏肝解郁的作用[15]，柴胡酒炙方法在《全國中藥飲片炮制規范（一）（征求意見稿）》及部分地方炮制規范中有收錄[16]。目前柴胡研究較多的炮制方法是醋炙法和鱉血制法，關于酒炙法以及酒炙法對柴胡化學成分及藥理作用影響的研究較少。邱云等[17]研究發現酒炙后會降低柴胡中SSa和SSd質量分數，李小寧等[18]研究發現酒炙能減少柴胡總多糖的質量分數，葉耀輝等[19]提出酒法炮制后柴胡揮發性成分在總柴胡檢出物中比例升高。酒炙后的柴胡對血瘀證模型大鼠的血液流變學指標和凝血四項指標的改善作用更強[20]，增強了活血行氣作用；酒炙后柴胡能更大范圍地提高虛熱大鼠的D-木糖值，側重于提高機體免疫能力[21]，該效果較生柴胡更顯著。現行研究多關注醋炙柴胡對柴胡功效的影響或炮制對柴胡的總體影響，酒炙對柴胡的影響較少單獨出現，并且對酒炙柴胡所造成的影響及其原因沒有進一步研究。本試驗在現行柴胡總黃酮和柴胡各皂苷測定方法的基礎上，研究柴胡酒炙前后總黃酮以及柴胡皂苷類成分質量分數變化，為后續柴胡酒炙的研究提供參考依據。

1 材料與儀器

1.1 藥材

生柴胡片購于廣州清平藥材市場，經廣東藥科大學中藥學院中藥資源系劉基柱教授鑒定為傘形科植物柴胡（Bupleurum chinenseDC.）的干燥根，屬北柴胡。藥材共9 批，產地為黑龍江、甘肅和內蒙古，由實驗室自行炮制加工，詳細信息見表1。

表1 9批柴胡藥材信息表Table 1 The information of 9 batches of radix bupleuri

1.2 試劑

柴胡皂苷a（SSa，批號：J0901 AS）、柴胡皂苷b1（SSb1，批號：A1130 AS）和柴胡皂苷b2（SSb2，批號：A0319 AS）購自大連美侖生物技術有限公司，質量分數≥98%，柴胡皂苷d（SSd，批號：B20150）和蘆丁（批號：B20771）購自上海源葉生物科技有限公司，質量分數≥98%。乙腈購自賽默飛世爾科技公司，為色譜純；甲醇、氨水購自天津市大茂化學試劑廠，均為分析純。

1.3 儀器

ACQUITY Arc 型超高效液相色譜儀、2489 UV型紫外檢測器（美國Waters 公司），MX-F 型渦旋器（美國Scilogex 公司），CA-1330 型冷卻水循環裝置、SB-1300 型水浴鍋（上海愛朗儀器有限公司），SB25-12 DTD 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司），H1750 R 型高速臺式離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），ME802/104 E 型電子分析天平［梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司］，N-1300 型旋轉蒸發儀（日本EYELA 公司），AllegraX-15R 型臺式離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）。

2 方法

2.1 柴胡飲片的制備

根據《湖北省中藥飲片炮制規范（2018 年版）》[22]所載，取凈柴胡片適量，加10%（體積分數，下同）黃酒拌勻，于室溫中悶透，等待酒液被吸盡后，置于炒制容器內，用文火將其炒干，取出后放涼，打粉，過4號篩，即得生柴胡粉末和酒柴胡粉末。

2.2 柴胡酒炙前后總黃酮成分質量分數的測定

2.2.1 對照品溶液的制備 稱取50 mg干燥至恒重的蘆丁對照品，置于25 mL 容量瓶中，加入適量甲醇，水浴加熱溶解，放冷，加入甲醇定容至容量瓶刻度，搖勻，即得[23]。

2.2.2 供試品溶液的制備 取各批次的生柴胡和酒柴胡粉末（過4號篩）各200 mg，稱定，置于具塞錐形瓶中，加入75%甲醇4 mL，超聲處理（功率800 W，頻率40 kHz）20 min，離心10 min（轉速4 750 r/min）。如上再次重復提取2 次，每次都加入75%甲醇3 mL，合并3 次上清液，轉移至10 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，分別作為生柴胡和酒柴胡粉末的供試品溶液。

2.2.3 標準曲線的繪制 參考周亞福等[24-25]的方法，將“2.2.1”項下制備的對照品溶液分別稀釋，配置成質量濃度分別為0.5、0.25、0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25 mg/mL 的蘆丁對照品溶液。分別量取7 份上述質量濃度的對照品溶液1 mL 于7 個10 mL 具塞試管中，依次加入60%甲醇溶液3.0 mL以及5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，放置6 min，再加入10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻后再次放置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液4.0 mL，搖勻后放置15 min，以等體積蒸餾水為空白對照，同時以1 mL黃酒代替供試品溶液，重復上述步驟重復測定3次，以消除黃酒本身的影響，在510 nm 處測定吸光度值。以吸光度值為縱坐標（Y），總黃酮質量濃度為橫坐標（X）繪制標準曲線，得到回歸方程：Y=0.077 2X-0.008 2（r=0.999 5）。

2.2.4 總黃酮質量分數的測定 取“2.2.2”項下供試品溶液，按“2.2.3”項下方法測定各供試品的吸光度值，代入回歸方程，計算得生柴胡和酒柴胡粉末中總黃酮的質量分數，結果見表2。通過t檢驗可知2 種柴胡總黃酮質量分數差異具有統計學意義（P<0.05），證明酒炙后柴胡總黃酮質量分數升高。

表2 各批次柴胡中總黃酮的質量分數Table 2 Mass fraction of total flavonoids in different batches of radix bupleuri(,n=3) w/（mg·g-1）

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2.3 柴胡酒炙前后皂苷類成分質量分數的測定

2.3.1 對照品溶液的制備 分別取SSa、SSb1、SSb2 和SSd 對照品適量，精確稱定，置于5 mL 容量瓶中，分別加入甲醇制成每1 mL 含SSa 10 mg、SSd 10 mg、SSb1 1 mg、SSb2 1 mg 的各對照品溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液的制備 參考黃江等[26]的方法，分別取各批次生柴胡和酒柴胡粉末0.5 g，稱定，置具塞錐形瓶中，加入5%濃氨甲醇25 mL，密塞，超聲（功率500 W、頻率40 kHz）30 min。取出，放冷，用甲醇20 mL分3次洗滌藥渣以及容器，合并洗液及濾液回收溶劑至蒸干，殘渣加甲醇使溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，定容，搖勻，即得。

2.3.3 色譜條件 色譜柱為SunFireC18柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）；流動相為乙腈（A）和水（B），以梯度方式洗脫（0～60 min，25%A→58%A）；SSb1 和SSb2 的檢測波長為254 nm，SSa 和SSd 的檢測波長為210 nm；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃[27-29]，進樣量為10 μL。

2.3.4 線性關系的考察 分別吸取SSa、SSb1、SSb2、SSd 對照品溶液，分別稀釋至表3 中的質量濃度。按照“2.3.3”項下色譜條件進樣測定，以質量濃度（X）為橫坐標，峰面積值（Y）為縱坐標繪制標準曲線，結果線性關系良好，回歸方程見表4。

表3 4種成分對照品溶液的質量濃度Table 3 Mass concentration of reference solutions for SSa，SSb1，SSb2 and SSd mg/mL

表4 線性關系考察結果Table 4 Results of linear relationship investigation

2.3.5 專屬性試驗 分別精密稱取SSa、SSb1、SSb2、SSd適量，置于5 mL 容量瓶中，加入甲醇制成SSa、SSb1、SSb2、SSd 質量濃度分別為0.02、0.09、0.09、0.2 mg/mL 的混合對照品溶液。以甲醇為陰性對照溶液。

分別精密吸取生柴胡和酒柴胡供試品溶液（S1）、混合對照品溶液、陰性對照溶液，分別按照“2.3.3”項下方法進樣測定，結果見圖1。從圖1 可知，254 nm 處SSb1 和SSb2 互不干擾，210 nm 處SSa和SSd 亦互不干擾，且陰性無干擾，方法專屬性良好[30]。

圖1 生柴胡粉末供試品溶液（S1）、酒柴胡粉末供試品溶液（J1）和混合對照品溶液的HPLC色譜圖Figure 1 H PLC chromatograms of Raw Bupleurum chinense test solution（S1），alcoholic bupleurum chinense test solution（J1）and mixed standard solution

2.3.6 精密度試驗 精密吸取同一批生柴胡粉末（S1），按“2.3.3”項下方法重復進樣6 次，測得SSa、SSb1、SSb2、SSd 峰面積的RSD 值分別為0.34%、0.51%、0.84%和0.81%，表明方法精密度良好[30]。

2.3.7 重復性試驗 取同一批生柴胡粉末（S1）6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣10 μL，按“2.3.3”項下方法測定。得到SSa、SSb1、SSb2、SSd 質量分數的RSD 值分別為0.16%、0.43%、0.10%和0.11%，表明方法重復性良好[30]。

2.3.8 穩定性試驗 取同一批生柴胡粉末（S1）0.5 g，精密稱定，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、12、24、48 h 后依次進樣，按“2.3.3”項下方法測定，計算得到SSa、SSb1、SSb2、SSd峰面積的RSD值分別為0.36%、0.84%、0.84%和0.90%，結果顯示供試溶液中各待測成分在48 h 內基本穩定[30]。

2.3.9 加樣回收率試驗 取已知質量分數的生柴胡粉末（S1）6 份，分別加入SSa（0.6 mg/mL）、SSb1（0.004 mg/mL）、SSb2（0.01 mg/mL）、SSd（1.0 mg/mL）對照品溶液1 mL，進樣量10 μL，按“2.3.3”項下方法測定各柴胡皂苷的質量分數，平行測定3次，表明樣品的加樣回收率良好[30]。見表5。

表5 4種成分加樣回收率試驗結果Table 5 The results of recovery rate of 4 components

2.3.10 樣品中皂苷類化合物質量分數的測定 分別取各批次的柴胡生品和酒炙品的供試品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項下色譜條件進樣，平行測定3 次，見圖2。通過回歸方程計算炮制前柴胡中SSa、SSb1、SSb2、SSd 的質量分數，SSb1 的定量限為0.001 mg/mL，結果如表6－8所示。通過t檢驗可知酒炙能使SSa 和SSd 的質量分數減少（P<0.05），SSb1 和SSb2 的質量分數增加（P<0.05）。

圖2 柴胡炮制前后的HPLC色譜圖Figure 2 HPLC chromatograms of radix bupleuri before and after processing

表6 柴胡生品中SSa、SSb1、SSb2、SSd的質量分數Table 6 The contents of SSa，SSb1，SSb2 and SSd in crude bupleurum chinense DC(,n=3) w/(mg·g-1)

表6 柴胡生品中SSa、SSb1、SSb2、SSd的質量分數Table 6 The contents of SSa，SSb1，SSb2 and SSd in crude bupleurum chinense DC(,n=3) w/(mg·g-1)

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表7 柴胡酒炙品中SSa、SSb1、SSb2、SSd的質量分數Table 7 The contents of SSa，SSb1，SSb2，SSd in radix bupleuri stir-fried in wine(,n=3) w/(mg·g-1)

表7 柴胡酒炙品中SSa、SSb1、SSb2、SSd的質量分數Table 7 The contents of SSa，SSb1，SSb2，SSd in radix bupleuri stir-fried in wine(,n=3) w/(mg·g-1)

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表8 柴胡中4種成分質量分數的t檢驗結果Table 8 T-test results of the mass fractions of four components in radix bupleuri

3 討論

本試驗通過比較酒炙前后柴胡中總黃酮、皂苷類成分質量分數的變化來研究酒炙法對柴胡化學組成的影響。結果顯示，柴胡酒炙后總黃酮成分質量分數升高，其原因可能與輔料黃酒以及加熱情況下化學成分的結構轉化有關，具體機制有待進一步研究。此外，有研究報道柴胡中的總皂苷質量分數為酒柴胡>生柴胡>醋柴胡[31]，本研究發現經酒炙后，SSa 和SSd 的質量分數減少，原因可能是生柴胡在潤洗和浸潤前處理的過程中，皂苷成分隨著水的沖洗而流失減少[32]，與本實驗結果一致；同時，SSa、SSd 中的C13、28 位的有氧醚環在加熱過程中不穩定，易開環[31]，其中SSa 可以轉化生成SSb1[34]，SSd轉化生成SSb2[33]，導致SSb1、SSb2 質量分數增加。但是過程是否定量、轉化的影響因素等還需要進一步研究。

經前期研究得知，柴胡酒炙之后可增強升舉陽氣、活血行氣等功效，但是其化學成分變化以及對功效的影響還沒有深入研究，后續可進一步研究酒炙法對柴胡功效的影響，從而闡明柴胡酒炙的科學內涵。