6種阿達帕林脂質體的制備及透皮性能比較研究

任書杉，付琳，李東澤，王超，趙雅欣，張向宇

（佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007）

痤瘡是一種青少年?；计つw病，臨床表現為非炎性皮損及丘疹、膿皰等炎性皮損[1]。阿達帕林（adapalene,ADA）是如今臨床上應用最廣泛的局部抗痤瘡藥物，是人工合成的第三代維A 酸類藥物，可以調節角質形成細胞分化，促進角質溶解[2]，同時具有抗炎和抗脂溢性的作用，但存在刺激性和光敏性的缺點，且存在“維甲酸反應”的副作用。因此需要采用新的藥物遞送系統，增強藥物活性成分的承載能力并減少其副作用，如將ADA 包載于脂質體中，可以消除藥物的快速高劑量釋放，實現持續和可控的藥物釋放模式，并減少不良反應[3]。

功能化納米結構脂質載體的優勢主要表現為增強藥物吸收、改變藥物分布使其富集于靶標處、降低藥物的消除以延長作用時間等特點[4]。本課題通過查閱文獻篩選了以下6種常見的脂質體進行皮膚滲透量和皮內滯留量的對比。

相比于普通脂質體（liposome），溫敏性脂質體（temperature sensitive liposomes, TSL）加入了具有不同相變溫度的磷脂，能在特定溫度下從凝膠態轉變為液晶態，定點釋放藥物[5]。孫君穎等[6]制備的溫敏脂質體在39~42 ℃下可以快速釋放抗氧化劑，達到保護食品的目的。本課題組前期試驗篩選了二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）與卵磷脂（SPC）的比例，得到符合制備目標相變溫度的溫敏脂質體為本試驗的研究奠定基礎。

柔性脂質體（flexible liposomes, FL）是在脂質體中加入軟化劑使具有較強的柔順性和變形性，使藥物更易透過皮膚[7]；加入表面活性劑、L-薄荷醇、氯化十六烷基吡啶等輔料制成彈性納米脂質體（elastic nano-liposomes, ENL）和可變形脂質體（deformable liposomes, DL），可以通過增加藥物分配和擴散來促進透皮吸收。Hou 等[8]研究制備了功能性彈性脂質體，并應用于皮膚給藥，發現在DL 中加入的表面活性劑為囊泡結構提供彈性和靈活性，從而能夠擠壓角質層細胞，更容易滲透到皮膚深層。

本研究采用薄膜水化法制備上述6種不同的阿達帕林脂質體，通過體外透皮實驗比較不同脂質體的皮膚透過量和皮內滯留量，篩選透皮效果更好的阿達帕林脂質體制劑，為增加藥物滲透、延長藥物作用時間等研究奠定理論和實驗基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

R213 B 旋轉蒸發儀（上海申生科技有限公司）；HP/Agilent 1200 高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；UV2550 紫外可見分光光度儀（日本島津儀器公司）；FEI Tecnai G2 F20 場發射透射電子顯微鏡[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；KQ-200 KDB超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；YB-P6智能透皮試驗儀（天津藥典標準儀器廠）；JY92-2D超聲細胞粉碎機（寧波新芝生物科技有限公司）；Zetasizer Nano ZSE 激光粒度分布儀（英國馬爾文公司）；SHA-BA水浴振蕩器（常州市中貝儀器有限公司）；TGL-16GB 臺式高速離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 材料

阿達帕林對照品（質量分數98%，批號A1200006，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；卵磷脂、氫化大豆磷脂、膽固醇、氯代十六烷基吡啶、L-薄荷醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；吐溫-80（天津市科密歐化學試劑有限公司）；無水乙醇、甲醇、三氯甲烷（天津凱通化學試劑廠）；PBS（pH6.8、pH7.4 北京索萊寶技術有限公司）。

1.3 動物

SD 大鼠（雄性），4~6 周齡，由哈爾濱醫科大學實驗動物學部提供，使用許可證號：SYXK（黑）-2021-018。

2 方法與結果

2.1 阿達帕林脂質體的制備

2.1.1 普通脂質體（AL）的制備 采用薄膜水化法：精密稱取2 mg ADA、50 mg 卵磷脂和12.5 mg 膽固醇溶于20 mL 甲醇-三氯甲烷（體積比1∶1）混合液中，溶解后轉移至圓底燒瓶60 ℃旋轉蒸發直至液體蒸發完全，瓶底出現均勻的薄膜，再加入20 mL PBS溶液（pH 7.4）水化40 min。將水化后的溶液探頭超聲儀進行超聲處理（240~320 W,15 min），經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得AL。

2.1.2 溫敏脂質體（ATSL）的制備 取2 mg ADA、復合磷脂（DPPC∶SPC=3∶1）及12.5 mg膽固醇，按“2.1.1”項下旋轉蒸發后，分別加入20 mL pH 6.8和pH 7.4的PBS溶液進行水化。分別將水化后的溶液探頭超聲儀進行超聲處理（240~320 W，15 min），經0.22 μm微孔濾膜過濾，得到2種ATSL。

2.1.3 柔性納米脂質體（AFL）的制備 將80 mg 大豆卵磷脂、20 mg 膽固醇、2 mg ADA 按“2.1.1”項下溶解、旋轉蒸發后，將得到的薄膜與20 mL含有適量丙二醇的PBS 磷酸鹽溶液（pH 7.4）水化2 h，超聲處理（240~320 W，15 min），經0.22 μm 微孔濾膜過濾，得到AFL[9]。

2.1.4 彈性納米脂質體（AENL）的制備 將30 mg 磷脂、15 mg 吐溫-80 和2 mg ADA 按“2.1.1”項下旋轉蒸發后，加入20 mL PBS 磷酸緩沖溶液（pH 7.4）進行水化，待溶液均一穩定后超聲處理（240~320 W，15 min），經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得AENL。

2.1.5 可變形脂質體（ADL）的制備 用25 mL 三氯甲烷-甲醇溶解80 mg 磷脂、5 mg 膽固醇、2 mg 氯代十六烷基吡啶、2 mg 薄荷醇和2 mg ADA，充分混合。氮氣氣流下旋轉蒸發，將干燥后的脂肪膜用20 mL PBS 磷酸緩沖液（pH 7.4）水化。超聲處理（240~320 W，15 min）后，經0.22 μm微孔濾膜過濾，即得ADL。

2.2 阿達帕林含量測定方法學的建立

2.2.1 檢測波長確定及專屬性考察 以三氯甲烷作為空白對照，配制100 μg/mL 的ADA 溶液，在200~400 nm 波長范圍內進行全波長掃描，結果見圖1?？紤]到溶劑干擾，選取325 nm 為檢測波長。取6 種空白脂質體各1 mL分別溶于10 mL甲醇破乳，于同等條件下進行紫外分析，結果見圖1?？梢?，方法專屬性良好。

圖1 ADA（A）和各樣品空白載體（B）的紫外掃描光譜圖Figure 1 UV scanning spectra of ADA（A）and blank carriers for each sample（B）

2.2.2 線性關系考察 取一定量ADA 對照品，用三氯甲烷配制成質量濃度為8.0、11.0、14.0、17.0、20.0、23.0、25.0 μg/mL的對照品溶液，于325 nm波長下測定，以吸光度（A）為縱坐標、質量濃度（C）為橫坐標，進行線性回歸擬合，得到線性方程A=0.023 2C+0.079 9，R2=0.999 8，表明ADA 質量濃度在8.0~25.0 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.3 精密度試驗 精密吸取質量濃度為8、15、25 μg/mL 的ADA 對照品溶液，重復測定6 次，記錄吸光度，計算質量濃度8、15、25 μg/mL 的溶液吸光度RSD 值分別為2.72%、1.56%、1.59%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩定性試驗 取質量濃度為25 μg/mL的ADA對照品溶液，于0、2、4、6、12、24 h取樣，重復測定6 次，記錄吸光度并計算RSD 值，結果RSD 值為0.63%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.2.5 回收率試驗 精密吸取一定濃度的ADA對照品溶液，同時加入制備好的空白脂質體，配成質量濃度為8、15、25 μg/mL 的待測溶液，重復測定6 次，記錄吸光度，計算回收率。結果顯示加樣回收率（n=6）分別為（100.06±0.12）%、（100.05±0.09）%、（99.98±0.71）%，符合方法學要求。

2.3 阿達帕林脂質體形態考察

透射電鏡下觀察6種阿達帕林脂質體的大小和形態結構，結果見圖2。可見，AL、ATSL、AFL、AENL多為均一球形或類球形，分布較均勻，無聚集，ADL電鏡下大小略有差異。

圖2 6種脂質體樣品的TEM形態圖Figure 2 T EM morphology of six types of liposome samples

2.4 阿達帕林脂質體粒徑分布及電位測定

利用激光粒度分析儀測定平均粒徑、粒徑分布和電位值，平行3 次。取6 種阿達帕林脂質體1.0 mL，用蒸餾水稀釋成5.0 mL，測定粒徑，測得平均粒徑、電位見表1，粒徑分布、電位值見圖3?？梢姡珹TSL、AFL、AENL 和ADL 粒徑較小，粒徑分布范圍較窄，AL 和采用pH 7.4 PBS 制備的ATSL 均勻性不佳，6種脂質體具有表面負電荷，粒子間不易發生聚集使體系相對穩定。

表1 6種阿達帕林脂質體的粒徑及PDITable 1 Particle size and PDI of six types of adapalene liposomes(n=3,)

表1 6種阿達帕林脂質體的粒徑及PDITable 1 Particle size and PDI of six types of adapalene liposomes(n=3,)

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圖3 6種脂質體樣品的粒徑分布及電位分布Figure 3 P article size distribution and zeta potential distribution of six types of liposome samples

2.5 阿達帕林脂質體包封率的測定

取6 種阿達帕林脂質體溶液各1 mL，分別加入甲醇破乳，超聲10 min后過0.45 μm 濾膜，即得總供試品溶液；再分別取6 種阿達帕林脂質體溶液1 mL于離心管中，15 000 r/min，4 ℃低溫離心30 min，取上清液過0.45 μm 濾膜，即得游離供試品溶液。分別將上述樣品進行紫外檢測，每組檢測重復3遍，記錄峰面積，代入標準曲線，所得含量分別記作W總以及W游，按照公式“”計算不同種類的阿達帕林脂質體的包封率，結果見表2。可見，6 種脂質體的包封率均較好。

表2 6種脂質體樣品的包封率Table 2 Encapsulation rate of six types of liposome samples (n=3,)

表2 6種脂質體樣品的包封率Table 2 Encapsulation rate of six types of liposome samples (n=3,)

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2.6 HPLC法測定ADA的質量濃度

2.6.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%磷酸-乙腈（體積比10∶90）；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；檢測波長：325 nm；進樣量：10 μL。

2.6.2 專屬性考察 分別取10 μL 阿達帕林脂質體溶液、阿達帕林對照對照液、皮膚浸出液和空白脂質體溶液，進樣測定，結果見圖4?？梢?，阿達帕林脂質體溶液色譜峰明顯且無拖尾，皮膚浸出液、空白脂質體溶液沒有明顯的色譜峰，表明方法專屬性良好。

圖4 皮膚浸出液（A）、空白脂質體（B）、ADA原料藥（C）和阿達帕林脂質體（D）的高效液相色譜圖Figure 4 HPLC chromatograms of skin extract(A),blank liposome(B),ADA (C)and adapalene liposome(D)

2.6.3 線性關系考察 取ADA 溶解于0.2%PEG-400 PBS 溶液配制成質量濃度為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0、30.0 μg/mL 的對照品溶液，按“2.6.1”項下色譜條件進樣測定，并以峰面積（A）為縱坐標，以質量濃度（C）為橫坐標，進行線性回歸擬合，得到線性方程A=48 499C+4.369 3，R2=0.999 8，表明ADA質量濃度在2.0~30.0 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

2.6.4 精密度試驗 取ADA 溶解于0.2%PEG-400 PBS 溶液配制成質量濃度為4、10 μg/mL 的ADA 對照品溶液。按“2.6.1”項下色譜條件連續進樣6 日，每次測定6 次，記錄峰面積。計算日內、日間精密度，結果見表3?？梢姡琑SD 值均<3%，表明試驗精密度良好。

表3 日內、日間精密度試驗考察結果Table 3 Results of Intraday and interday precision(n=6,)

表3 日內、日間精密度試驗考察結果Table 3 Results of Intraday and interday precision(n=6,)

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2.6.5 回收率試驗 取ADA 溶解于0.2%PEG-400 PBS 溶液，配成質量濃度為6.0、12.0、24.0 μg/mL的待測溶液，加入制備好的空白脂質體，HPLC 分析平行測定6 次，計算濃度。結果測得6.0、12.0、24.0 μg/mL 3個質量濃度溶液的平均回收率分別為99.85%、99.96%、99.80%，RSD 值分別為0.57%、0.92%、0.68%，符合方法學要求。

2.6.6 穩定性試驗 取ADA 溶解于0.2%PEG-400 PBS 溶液，配制成質量濃度為15 μg/mL 的ADA 對照品溶液，于0、2、4、6、12、24 h 時取樣進行HPLC分析，平行測定6 次。計算RSD 值為0.27%（n=6），表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.7 體外經皮滲透及滯留試驗

2.7.1 離體大鼠皮膚的制備 將大鼠安樂死，在不損傷皮膚的情況下剃去大鼠腹部毛發，剪下腹部皮膚，去除皮下脂肪、黏液組織和毛細血管叢，用PBS溶液反復清洗，備用[10]。

2.7.2 體外經皮滲透試驗 采用Franz 擴散池進行滲透試驗。將鼠皮固定于接收池和供給池之間，角質層朝向供給池，用彈簧夾固定，使真皮層與接收液緊密接觸，排出氣泡，平衡30 min 后給藥。試驗時，在接收池內加入15 mL 含有0.2%PEG-400 的PBS緩沖溶液，池中加入待透皮的脂質體，有效擴散面積為1.766 cm2，（37.0±0.2）℃恒溫水浴，并以200 r/min 磁力恒速攪拌[11]。分別于2、4、6、8、10、12、24 h 時精密吸取2 mL 接收液樣品，隨即補回相應量的空白接收液并排除氣泡。吸取的樣品液按“2.6.1”項下色譜條件分析，測定阿達帕林的含量，平行測定3 次，按以下公式計算單位面積累積滲透量（Qn）：

式中：Qn為第n個取樣時間點的單位面積累積滲透量；V0為接收介質總體積；Cn為第n個點的藥物濃度；Ci為第i（i=n-1）個點中藥物濃度；Vi為第i次取樣液體積；A為Franz擴散池有效擴散面積[12]。

根據不同類型脂質體在各時間點的取樣分析結果，繪制不同阿達帕林脂質體的累積滲透量（Qn）-時間（t）曲線。以Qn對時間t進行線性回歸，所得回歸直線的斜率即為穩態滲透速率Js[13]，結果見圖5。

圖5 6種脂質體樣品的體外滲透曲線圖Figure 5 I n vitro drug permeation profiles for six types of liposome samples（n=3）

可見，0~24 h 內，6 種脂質體與ADA 的滲透趨勢基本一致，不同脂質體的Qn均高于ADA 原料藥，不同程度上提高了ADA 的皮膚透過率，其中AENL、ADL、AL 滲透性能相似，比原料藥的累積滲透量略高，ATSL的相變溫度在（36±1）℃。

對12 h 體外滲透情況進行擬合，不同劑型的滲透參數Js和12 hQn結果見表4，12 h 各脂質體組的Qn分別為0.708 8、0.600 9、0.404 8、0.334 1、0.347 1、0.290 1 mg/cm2，均優于ADA 對照溶液，且ATSL（pH6.8 PBS）的最高。

表4 6種脂質體樣品的數學模型擬合方程與相關參數Table 4 M athematical model fitting equation and correlation coefficient of six types of liposome samples

2.7.3 體外皮膚滯留試驗 24 h后從Franz擴散池上取下皮膚，酒精棉球擦拭皮膚表面數次。充分剪碎后分別用3 mL 無水乙醇提取3 次，合并取上清液，10 000 r/min 高速離心10 min，按“2.6.1”項下色譜條件進樣測定ADA 含量[14]。按以下公式計算單位面積皮內滯留量（Qm）：

式中：Cm為提取液濃度；V為提取液體積；A為經皮滲透面積。每組皮膚滯留實驗各進行3 次，結果見圖6。

圖6 6種脂質體樣品的單位面積皮內滯留量（Qm）Figure 6 Intradermal retention per unit area（Qm）of six types of liposome samples（n=3）

結果表明，24 h 累積滲透量與單位面積皮內滯留量的大小順序為ATSL>AFL>AENL>ADL>AL>ADA。24 h 內ATSL 是ADA 溶液的5.11 倍和3.0倍，是其他阿達帕林脂質體的1.7~5 倍。從累積釋放率結果來看，24 h 時ATSL 的滲透率最高，且水相pH值偏酸性的磷酸緩沖液滲透效果更好。

3 討論

據統計，痤瘡在青少年中的發病率高達85%[15]，臨床上治療方法的研究熱點有阿達帕林凝膠結合光療、熱療、抗生素或者其他抗炎藥物協同治療，暫時還沒有關于阿達帕林脂質體應用于臨床治療的報道。

本研究制備了具有不同性質的6種阿達帕林脂質體，對其滲透性和皮內滯留效果進行研究并與ADA 原料藥進行比較，結果表明制備的脂質體均在不同程度上提高了ADA的經皮滲透效果，從各組脂質體滲透曲線圖可知，前12 h 隨著時間增加，原料藥和各脂質體組的經皮滲透量隨著時間的增加而增加，12 h 后，隨著藥物在皮內滯留，穩態滲透速率降低[16]，后續需針對細胞層面的滲透和滯留進一步進行考察。從本文的脂質體粒徑、包封率及累積滲透率結果看，AENL 作為脂質載體對于ADA 的滲透效果增強并不明顯，分析原因可能是藥物并未被完全包裹，游離藥物過多，后續需要進一步探究。

本研究制備的ATSL，24 hQn、Qm均優于其他脂質體，主要原因是ATSL 中的磷脂層結構與皮膚細胞膜結構相似，從而提高了藥物遞送能力以及滯留能力，ATSL 中的藥物滲透速率依賴于皮膚組織的局部溫度，達到相變溫度（37 ℃）后進一步增加了藥物滲透；另外，ATSL 的累積釋放率也高于其他脂質體，原因在于ADA為酸性藥物，在弱酸性環境下解離少，容易透過細胞膜，加快吸收。但是，在溫敏脂質體的制備過程中，旋蒸溫度及時間，超聲功率及時間都會影響脂質體的包封率進而影響脂質體的透皮效果，這也對藥物儲存及運輸提出新的挑戰，因此還需進一步優化處方。

綜上所述，ATSL 有效提高了阿達帕林經皮滲透量以及皮內滯留量，為ADA新型給藥載體的研究提供了基礎，具有更深入研究的價值。

（利益沖突聲明：本研究未受到企業、公司資助，不存在任何利益沖突。）