液相色譜串聯質譜法和電化學發光免疫分析法檢測25-羥維生素D的一致性評價

趙 柯,任偉丹,劉玉霞,岳文兵,韓雪瑩,丁利霞

鄭州金域臨床檢驗中心有限公司,河南鄭州 450000

維生素D是一種脂溶性甾體激素前體,主要包括維生素D2(麥角鈣化醇)、維生素D3(膽鈣化醇),其主要功能為促進小腸黏膜細胞吸收磷及鈣離子,還可減輕炎癥反應,調控免疫系統功能及幫助控制血糖水平[1]。25-羥維生素D[25(OH)D]是維生素D在人體內的主要作用形式,其在血液中的濃度較高且半衰期較長,是監測體內維生素D水平及營養狀況的可靠指標[2]。

隨著臨床實驗室維生素D檢測的大范圍開展,不同檢測方法間結果不一致的情況愈來愈多,甚至部分結果差異會影響臨床對維生素D缺乏的診斷。故本研究使用液相色譜串聯質譜法(LC-MS/MS)和電化學發光免疫分析法(ECLIA)這兩種方法檢測臨床血清標本中的25(OH)D,并對測定結果進行分析和比較,評價這兩種方法檢測結果的相關性和差異性,以期指導臨床選擇合適的項目,合理解讀這兩種方法結果差異的原因。

1 材料與方法

1.1標本來源 收集本實驗室臨床血清標本94例,分別用ECLIA與LC-MS/MS兩個檢測系統檢測25(OH)D濃度,并對結果相關性進行分析,入組的所有標本均為單純隨機抽樣的方法挑選。

1.2儀器與試劑 LC-20ADXR 液相色譜儀(日本島津公司)、API3200質譜儀(美國AB公司)、Milli-Q Gradient超純水機、默克Ascentis Express C18(5.0 cm×2.1 mm×2.7 μm)色譜柱、電化學發光免疫分析儀(羅氏E602)。甲醇、乙腈、正己烷均為色譜純,購自德國默克公司;甲酸(分析純)購自廣東光華化學廠有限公司;25(OH)D2和25(OH)D3標準品、色譜純購自西格瑪中國有限公司;d6-25(OH)D2和d6-25(OH)D3內標品購自美國Medical Isotopes公司;25(OH)D檢測試劑盒購自羅氏診斷產品有限公司。

1.3方法 (1)25(OH)D檢測采用ECLIA:使用電化學發光免疫分析儀和配套試劑盒,依據試劑盒說明書的標準操作流程進行標本的處理和檢測。檢查儀器清洗液、反應杯、緩沖液等是否足夠使用,開機后在儀器試劑盤中加入平衡至室溫的相應試劑(避免產生氣泡),儀器將自動按照設定程序進行檢測。LC-MS/MS,色譜條件:色譜柱柱溫50 ℃;流速:0.55 mL/min;進樣量為40 μL;流動相A相為含0.1%甲酸的去離子水,B相為含0.1%甲酸的甲醇,采用梯度洗脫模式。質譜參數:采用正離子電噴霧電離離子化的多反應監測模式,25(OH)D2和25(OH)D3定量離子通道質荷比分別為413.3∶395.4和401.3∶383.4;定性離子通道質荷比分別為413.3∶355.4和401.3∶365.4;內標離子通道質荷比分別為416.3∶398.4和407.3∶389.4。離子源溫度:550 ℃,離子源電壓5 500 V,氣簾氣20,霧化器55,輔助氣55。實驗步驟:吸取200 μL血清標本至2 mL離心管中,加入400 μL的內標工作液[含50.0 ng/mL的d6-25(OH)D2、50.0 ng/mL的d6-25(OH)D3及1.00 μg/mL雌三醇的乙腈溶液],充分震蕩5 min,加入800 μL正己烷震蕩10 min后,室溫10 000 r/min離心10 min;吸取700 μL上清液60 ℃加熱氮氣吹干,加入100 μL復溶液,可得待測標本,轉移至進樣瓶后上機檢測。進樣順序為空白樣品-標準工作曲線-空白樣品-質控-空白樣品-待測血清標本-空白樣品-質控-空白樣品,查看標準曲線及質控是否在控,查看質譜圖峰形、出峰時間及分離度是否正常,確認后導出數據。(2)維生素D營養狀況判定:根據血清25(OH)D濃度,將血清25(OH)D<20.0 ng/mL判定為維生素D缺乏,20～<30.0 ng/mL判定為維生素D不足。

1.4質量控制

1.4.1LC-MS/MS 25(OH)D2和25(OH)D3檢出限分別為0.31 ng/mL、0.46 ng/mL,定量限分別為1.56 ng/mL、1.66 ng/mL。25(OH)D2重復性精密度為12.03%(低濃度)、9.57%(高濃度),25(OH)D2中間精密度為8.90%(低濃度)、8.78%(高濃度);25(OH)D3重復性精密度為4.64%(低濃度)、2.26%(高濃度),25(OH)D3中間精密度為4.76%(低濃度)、2.47%(高濃度)。該檢測通過國家衛生健康委臨床檢驗中心(NCCL)組織的室間質評及正確度驗證。

1.4.2ECLIA 25(OH)D檢出限為3.00 ng/mL,定量限為4.39 ng/mL,重復性精密度為5.99%(低濃度)、4.58%(高濃度),中間精密度為7.98%(低濃度)、5.92%(高濃度),該檢測通過NCCL組織的室間質評。

1.5統計學處理 采用Medcala11.0及SPSS18.0軟件進行統計分析。使用配對t檢驗分析兩種方法檢測結果差異是否有統計學意義;使用Passing-Boblok回歸分析兩種檢測方法之間的相關性;Bland-Altman及Mountain plot進行兩種方法的一致性檢驗;使用Kappa分析判斷兩種方法評估維生素D營養狀況的診斷符合率。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兩種方法的檢測結果 本實驗室LC-MS/MS與ECLIA法均經過嚴格的方法學驗證,并參與了NCCL的室間質評,使用LC-MS/MS與ECLIA檢測25(OH)D,當日質控結果均在控。使用LC-MS/MS與ECLIA檢測94例血清標本25(OH)D濃度,兩種方法測定的25(OH)D濃度結果比較,差異有統計學意義(P<0.05)。LC-MS/MS系統檢測25(OH)D最低值為4.82 ng/mL,最高值為76.23 ng/mL。ECLIA系統檢測最低值為6.41 ng/mL,最高值為127.78 ng/mL。見表1。

表1 LC-MS/MS與ECLIA對94例血清標本25(OH)D濃度的檢測結果比較(ng/mL)

2.2兩種方法的相關性和一致性 Passing-Bablok 回歸分析顯示兩種方法檢測25(OH)D濃度的回歸方程為YECLIA=-4.558 1+1.719 8XLC-MS/MS,斜率為1.719 8(95%CI1.586 3～1.828 4),不包含1,截距為-4.558 1(95%CI-7.692 2 ～ -2.122 1),不包含0,提示兩種方法存在系統差異或比例差異,見圖1。Bland-Altman圖顯示兩種方法差值的均值為-12.7,差值的95%CI為-35.7～10.4,有3個點[界外點數(比率)為3.19%]落在95%一致性界限以外,見圖2。山形圖的山頂值為-9.17 ng/mL,偏離0較多,見圖3。以上結果顯示兩種方法檢測的結果一致性較差。

圖1 ECLIA與LC-MS/MS檢測25(OH)D濃度的Passing-Bablok回歸圖

圖2 ECLIA與LC-MS/MS法檢測25(OH)D濃度的Bland-Altman 圖

圖3 ECLIA與LC-MS/MS法檢測25(OH)D濃度的山形圖

2.3兩種方法診斷維生素D缺乏的一致性評價 將94例血清標本LC-MS/MS與ECLIA檢測結果進行比較,判斷受檢者維生素D營養狀況。使用Kappa分析判斷兩種方法診斷維生素D營養狀況的符合率。兩種方法判斷維生素D缺乏的符合率為94.68%,Kappa=0.875≥0.750,P<0.001,表明兩種方法診斷結果具有一致性,一致性較好[3]。兩種方法判斷維生素D不足的符合率為75.53%,Kappa=0.538,0.400

3 討 論

研究表明,維生素D不僅可以維持體內鈣磷平衡及骨骼代謝,其在免疫調節、癌癥、抗炎及心血管健康等方面也起著至關重要的作用[5]。維生素D缺乏或不足易導致佝僂病及骨質疏松癥等常見病的發生,過量也會導致高鈣血癥等相關疾病[6]。相關研究指出,血清25(OH)D濃度檢測已被公認為反映維生素D狀態的最合理指標[7]。因此,需要選擇合適的25(OH)D檢測方法以輔助臨床進行疾病診斷及預防。

目前臨床實驗室25(OH)D檢測方法主要有放射免疫法(RIA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、ECLIA、高效液相色譜法(HPLC)及LC-MS/MS等[8]。不同檢測系統由于采用的方法學不同,抗干擾能力也不同,會出現同一標本在不同檢測系統上得到不同的檢測結果,這種結果差異的出現可能會影響臨床對疾病的判讀。為了改變不同檢測系統結果差異的這種情況,有機構成立了維生素D標準化項目,其宗旨是促進全球所有實驗室25(OH)D檢測方法(包括商業化和自建方法)的標準化,從而提高醫療安全,保障全民健康[9-10]。目前越來越多廠商及大型臨床實驗室加入美國疾病控制和預防中心標準化認證程序的行列中,參加實驗室數與日俱增,但距離25(OH)D檢測結果一致的目的仍任重而道遠[11]。因此,對不同檢測系統所得到的結果之間的相關性及一致性進行評估是非常有意義的工作。

本研究采用LC-MS/MS與ECLIA這兩種方法檢測血清中25(OH)D濃度,LC-MS/MS測定25(OH)D濃度明顯低于ECLIA,統計分析結果顯示兩種方法一致性較差。引起這種結果差異的原因可能有以下幾點:ECLIA原理為利用抗原抗體反應進行有效結合,易受基質及抗體狀態影響,特異性較差,而LC-MS/MS經過對血清標本前處理、色譜分離、串聯質譜根據分子量進行區分檢測,可實現25(OH)D2、25(OH)D3的精準檢測,從方法學角度來分析,ECLIA較之LC-MS/MS測定結果偏高[7,12-13]。再者,ECLIA無法避免25(OH)D3的3-epi-25(OH)D3異構體造成的影響,導致交叉反應,從而可能使得檢測結果較高[14]。25(OH)D與維生素D結合蛋白是否解離完全,也是影響其檢測結果準確性的重要影響因素,受試者維生素D結合蛋白濃度差異也導致了其對維生素D代謝物的親和力不同,這也是ECLIA與LC-MS/MS產生檢測結果差異的可能原因[15]。

兩種方法在診斷維生素D缺乏時診斷符合率為94.68%,Kappa系數為0.875,一致性較好,診斷維生素D不足的診斷符合率為75.53%,Kappa系數為0.538,一致性中等,整體來看,依據營養狀況診斷維生素D缺乏與不足的符合率較高。LC-MS/MS因其高靈敏度、特異度等優勢,被認為是血清25(OH)D檢測的金標準,但目前質譜儀器價格較高,且對實驗室環境條件及人員技術要求較高,在大型醫院及第三方醫學檢驗實驗室應用較多,在小型醫院暫未廣泛使用。而ECLIA自動化程度高,成本較低,適用于小型醫院及健康體檢。這兩種方法在應用和選擇時,臨床應考慮可能存在的干擾因素,根據實際情況選擇合適檢測系統。在進行維生素D檢測時,25(OH)D2雖檢出率較高,但大多數標本濃度較低,對無LC-MS/MS檢測能力的實驗室可選擇傳統免疫方法作為替代方法;當受試者服用過25(OH)D2時,LC-MS/MS是更可靠的檢測方法。在解讀維生素D報告時,應充分考慮所選用的檢測方法,建立本實驗室所用方法檢測25(OH)D的參考范圍,并盡快實施維生素D檢測一致化計劃。

本研究尚有不足,僅比對了羅氏電化學發光免疫分析儀與LC-MS/MS檢測25(OH)D的一致性,入組樣本量不大,后續可進行其他平臺的比對。3-epi-25(OH)D3是25(OH)D3的同分異構體,在結構上僅有一個羥基空間方向上的差異,需高靈敏度質譜儀器才能將其分離檢測,它的存在會造成25(OH)D檢測結果的假陽性,3-epi-25(OH)D3在一歲以下嬰幼兒中濃度較高,影響更為明顯。同時檢測25(OH)D2、25(OH)D3、3-epi-25(OH)D3的濃度有助于真實準確地評估維生素D營養水平,對于骨質疏松、佝僂病的治療防治可提供有效診斷依據,同時可為心血管及腫瘤疾病等提供輔助診斷。后續仍需繼續開發可分離3-epi-25(OH)D3的LC-MS/MS檢測方法,助力實現25(OH)D的精準檢測。同時提示檢驗實驗室應定期進行比對,保證檢測結果的準確性。臨床在解讀報告時也應考慮到不同檢測系統對檢測結果的影響。

綜上所述,ECLIA與LC-MS/MS檢測結果一致性較差,但依據營養狀況診斷維生素D缺乏與不足的符合率較高。兩種檢測方法都可以應用于臨床檢測,臨床可根據實際需求選擇相應檢測方法。