液體活檢技術在胰腺癌早期篩查和診斷中的應用*

趙宇婷,楊宇晨 綜述,蔡智慧 審校

1.內蒙古醫科大學內蒙古臨床醫學院,內蒙古呼和浩特 010110;2.內蒙古自治區人民醫院腫瘤內科,內蒙古呼和浩特 010017

近年來,胰腺癌發病率在國內外都呈現上升趨勢,胰腺癌雖然不是高發癌種,但卻是導致死亡的第7大癌種。胰腺癌的5年生存率約為10%,據有關數據顯示,胰腺癌占我國腫瘤發病率的第9位,死亡率占第6位[1],其中,約90%為起源于腺管上皮的導管腺癌(PDAC),PDAC的5年生存率不足1%。有研究表明,胰腺癌存在早期診斷率、手術切除率和藥物有效率低的“三低”特征,胰腺癌起病隱匿,早期癥狀不典型,常表現為消化不良、腹瀉、上腹部不適或腰背部疼痛等癥狀,易與其他消化系統疾病混淆而不能及時診治[2]。不過有研究表明,從胰腺癌發生病變到進展為轉移性胰腺癌要近21年的時間[3],這為胰腺癌早期篩查提供了較長的時間窗。

胰腺癌早期診斷的關鍵在于盡早確診小胰腺癌,但迄今尚無統一的診斷標準,美國癌癥分期委員會將腫瘤最大徑≤2 cm且無區域淋巴結及遠處轉移的早期腫瘤稱為小胰腺癌,TNM分期為ⅠA期[4]。另外,還有學者將最大徑≤1 cm的胰腺癌定義為微小胰腺癌,術后5年生存率可達到67%[5]。臨床上胰腺癌早期診斷的目的就是發現早期胰腺癌或小胰腺癌,以便早期手術治療改善預后。若胰腺癌已非早期或最大徑>2 cm,則其生存率明顯降低[6]。有數據顯示,0期(原位)患者的5年生存率為85.8%,ⅠA期患者的5年生存率為68.7%[7],而發展到中、晚期,失去了最佳治療時機,5年生存率僅為10%[8],生存時間差異明顯。因此及早篩查并診治胰腺癌至關重要。

1 常規胰腺癌篩查手段

在胰腺癌傳統檢測方法中,計算機斷層掃描(CT)、血管造影聯合胸部和盆腔CT可用于評估血管解剖結構和疾病分期,是診斷時的常規治療方法;磁共振成像和胰膽管造影可以用于判斷胰腺病變是否有轉移,并識別CT成像中可能表現不良的癌癥;內鏡超聲檢查可以更直接地顯示胰腺腫塊,明確細胞學或組織學診斷,確定腫瘤血管受累程度,評估區域淋巴結,并評估腫塊完全切除的可能性,在內鏡超聲引導下對腫瘤進行細針穿刺活檢,可以獲得組織學診斷并為分子檢測提供材料;糖類抗原(CA)199是胰腺癌公認的生物標志物,可用于監測治療反應[9]。

然而,傳統檢測方法都存在一定缺陷,而無法作為可靠的早期篩查方法。如CT伴隨著碘造影劑的腎毒性風險、輻射暴露風險,且在獲得實質增強方面也存在個體差異而無法保證可靠性;內鏡超聲在某些國家或地區可用性較低,操作員技術差異較大,且無法檢測到遠處轉移;磁共振成像因昂貴且禁忌使用某些金屬植入物[10],且磁共振由于靈敏度(80%)和特異度低(75%)[11],可與其他疾病包括梗阻性黃疸、急性膽管炎和慢性胰腺炎混淆,易出現假陰性結果[12],所以目前磁共振可能并不能作為早期胰腺癌常規篩查的手段。總之,胰腺癌總體發病率較低,篩查成本高,在無癥狀人群中用上述方法進行篩查可能會帶來過度診斷和假陽性的風險,因此需要更有效地富集高危人群使其在后續的監測中獲益是胰腺癌篩查的關鍵,所以將液體活檢作為早期篩查胰腺癌的方法引起了廣泛討論。

2 液體活檢的應用優勢

液體活檢是一種基于血液、腦脊液、尿液、痰液、腹水和理論上任何其他體液采樣的微創手術,正在成為用于早期癌癥診斷、治療、預后預測和隨訪的生物標志物[13]。作為非侵入性工具,液體活檢可以從體液中獲取腫瘤相關的重要信息,大多數重要信息都是從循環腫瘤DNA(ctDNA)、循環腫瘤細胞(CTC)及細胞外囊泡的分析中收集的[14]。1994年首次報道了用等位基因特異性引物的PCR在胰腺癌患者的循環游離DNA(cfDNA)中檢測到突變序列[15],由此提出,液體活檢可應用于胰腺癌的臨床應用中。在癌癥早期篩查領域,液體活檢相較傳統檢測方法有諸多優點。與傳統的組織活檢不同,液體活檢是非侵入性操作,易于重復,并且可以方便地了解腫瘤負荷和治療反應。此外,液體活檢可以給出原發腫瘤的分子快照,從而最大限度地減少由采樣偏重和腫瘤內異質性引起的活檢結果偏倚[16]。因此在實體腫瘤早期篩查、監測疾病進展等方面均有巨大前景。

2.1CTC的特性及相關應用 CTC是血液中存在的惡性細胞,被認為是轉移的“種子”。CTC從原發腫瘤脫落,通過血管系統到達第二個部位,若環境適宜,這些細胞便定居并增殖,從而形成轉移性腫瘤[17]。因此推測CTC可能成為癌癥轉移的可靠生物標志物。目前CTC已被研究證實其可作為乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌的預后生物標志物[17]。但其在胰腺癌中的作用尚未得到廣泛探討。2004年CellSearch系統計數首次檢測到CTC的存在,美國食品藥品監督管理局評估了此系統對胰腺癌的診斷,結果準確度在11%～78.5%,檢出率差異很大[18];隨著新的功能測試模型的開發,更多用于體內檢測和捕獲CTC的設備為CTC研究開辟了新的途徑,這可能會克服傳統7.5 mL血液管(CellSearch系統)中CTC計數低的限制,從而提高檢出率[19]。

早期CTC檢測可識別胰腺癌轉移風險增加的患者,可為手術或局部進展PDAC患者提供定制輔助治療的機會。考慮到轉移階段通常發生在癌癥進展的晚期,所以普遍認為在PDAC的癌前和早期階段不會檢測到CTC。但有研究發現,循環胰腺上皮細胞(CEC)僅在胰腺囊性病變和胰腺導管腺癌患者中發現,在體檢健康者、PDAC患者和囊性病變患者中的CEC計數存在明顯差異[20]。另一項研究也表明,CEC有可能對不同級別的導管內乳頭狀黏液性腫瘤(IPMN)和其他良性囊腫進行區別[17]。在PDAC的癌前階段可以檢測到CEC,因此提高了CTC作為早期診斷標志物的可能性。LEE等[12]使用GEDI芯片,分別在3個不同的受試組:PDAC組、胰腺癌癌前囊性病變(IPMN或黏液性囊性腫瘤)組及無癌組,分別檢測CTC,結果顯示,胰腺癌癌前囊性病變組、PDAC組和無癌組的CTC檢出率分別為40%、73%和0%。但由于PDAC早期循環細胞數量較少且提取技術尚未完全成熟,CTC用于胰腺癌早期篩查仍需要更多的驗證性研究。

除了早期篩查,近年來發現了CTC與胰腺癌在其他方面的相關性:(1)與預后相關,相對未檢測到CTC的患者,檢測到至少一種CTC的患者無進展生存時間更短;(2)CTC可能在評估晚期PDAC患者的治療反應方面具有積極作用,經檢測PDAC患者化療后的CTC計數大幅減少[21];(3)判斷腫瘤復發,CTC有上皮細胞和間充質細胞兩種表型,且可表達波形蛋白,而波形蛋白是間充質細胞的一種標志物,與胰腺導管腺癌外科治療后的高復發率有關[22];(4)監測化療效果進而指導臨床治療,CTC計數在疾病晚期增加,所以如果檢測到PDAC患者血液中CTC計數增加,即使影像學檢查未檢測到轉移,也應考慮全身化療而不是前期手術[23]。例如目前已有學者考慮采用分子生物標志物來預測呋喹替尼針對結直腸癌的療效,未來應該設計并實施利用分子生物標志物預測免疫靶向治療在胰腺癌療效中的試驗[24],并以此來指導、調整臨床用藥。

2.2ctDNA在胰腺癌中的應用 在體液環境中,可檢測到一類游離的DNA片段,被稱為cfDNA,cfDNA起源于腫瘤微環境的腫瘤和非腫瘤細胞[25],ctDNA是特異性來源于原發性或轉移性腫瘤cfDNA的一部分,雖然ctDNA在cfDNA中具有較大的波動比例[26],但由于健康人群中大部分cfDNA的長度在70～200 bp,而腫瘤患者的ctDNA長度可能為200 bp甚至超過1 000 bp[27],這就可以對其進行定量定性分析,從而用于腫瘤監測。腫瘤DNA從原發腫瘤、CTC、微轉移或明顯轉移到癌癥患者的血液中釋放,與腫瘤相關的基因缺陷模式(如點突變、重排、擴增、微衛星改變、表觀遺傳修飾等)就可以在血清和血漿中檢測到,從而應用于臨床腫瘤診治過程。

相較CTC而言,ctDNA具有較高的特異性,ctDNA的特異性遠高于CTC。原因可能是:(1)ctDNA通常在大量腫瘤細胞壞死后檢測,此時腫瘤負荷已經很高;(2)PADC中的基因突變通常是特異性的[28]。

2.2.1ctDNA在胰腺癌早期篩查中的應用 作為液體活檢的一種手段,ctDNA技術一般分為兩種:基因突變檢測和甲基化檢測。

有研究記錄了已知胰腺癌驅動基因的高突變頻率,如鼠類肉瘤病毒癌基因(KRAS)、腫瘤抑制蛋白基因(TP53)、信號通路通用調節因子4 (SMAD4)和細胞周期蛋白依賴性激酶抑制基因(CDKN2A),其中KRAS突變被用于診斷監測中[29]。在一項研究中,與腫瘤組織序列相比,在26例胰腺癌癥患者的ctDNA標本中評估了54個基因的突變,此項研究結果是KRAS、TP53、腺瘤性息肉病基因(APC)、F框/WD-40域蛋白7(FBXW7)和SMAD4這5個基因的ctDNA突變應該能夠準確診斷PDAC[30]。KRAS是一種相對分子質量為21×103的小GTP酶,可激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細胞外信號調節激酶(ERK)信號傳導通路,從而控制與增殖、分化、遷移和存活相關的細胞過程[31]。1994年首次報道了用等位基因特異性引物的PCR在胰腺癌患者的血漿cfDNA中檢測到突變的KRAS序列,對于每個胰腺癌患者,在血漿中發現的KRAS突變與在患者腫瘤中發現的一致,從而可以確認血漿中的突變DNA片段來自腫瘤,研究表明,cfDNA的突變是癌癥的高度特異性標志物[15]。有數據顯示在14.8%的體檢健康者中也檢測到了突變KRAS[32],該結果表明單獨檢測血漿KRAS突變并不能作為診斷胰腺癌的可靠標志物。有研究報道聯合檢測KRAS突變和CA199對胰腺癌的診斷靈敏度達91%,故與其他血清標志物聯合檢測,診斷靈敏度可明顯提高[33]。

腫瘤在早期階段其壞死和凋亡率較低,并且沒有足夠的ctDNA釋放到循環中,所以靈敏度比較低[28]。近年來研究顯示,cfDNA在癌變早期檢測甲基化等表觀遺傳學改變方面具有很大的潛能。腫瘤發生早期DNA已經出現了甲基化的趨勢或局部甲基化的改變,因此可以通過液體活檢檢測ctDNA的水平和甲基化特征來實現腫瘤的早期診斷及分期[34]。有研究通過評估cfDNA中兩個基因[血小板反應蛋白基序1(ADAMTS1)、鋅指蛋白basonuclin-1(BNC1)]的甲基化狀態,結果發現其靈敏度為0.95,特異度為0.92,這種基于血液的微創生物標志物組合可以用作在選定的高危人群中進行診斷和篩查的有前途的工具[35]。除此之外,在另外一項初步研究中,結合cfDNA中5-甲基胞嘧啶(5mC)和5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)變化的模型實現了0.94的靈敏度和0.95的特異度,診斷PDAC的曲線下面積(AUC)為0.99,結果顯示結合5mC和5hmC標記的特征模型優于兩個單獨的模型,特別是對PDAC的預測靈敏度有所提高,并且利用5hmC模型計算的加權診斷評分還可以區分Ⅰ期患者和Ⅱ～Ⅳ期患者[36]。一項針對靶向cfDNA甲基化的分析中,納入了不同階段的PDAC患者,發現Ⅰ期的靈敏度為0.63,Ⅱ期為0.83,Ⅲ期為0.75,Ⅳ期為1.00,cfDNA甲基化可能對監測風險群體非常有用[7]。使用新開發的稱為珠子甲基化(MOB)的高度可靠的技術,EISSA等[35]發現A崩解素和金屬蛋白酶與ADAMTS1、BNC1的甲基化及二者聯合對胰腺癌診斷的靈敏度分別為87.2%、64.1%和97.4%。對于Ⅰ/Ⅱ期胰腺癌,二者聯合檢測表現出94.8%的靈敏度和91.6%的特異度。

2019年美國翰斯`·霍普金斯大學醫學院開發了一種稱為DELFI(早期攔截片段DNA)的方法,通過片段模式的全基因組分析來檢測cfDNA中的異常[37]。該研究專注于cfDNA的片段大小,發現與非癌癥cfDNA相比,癌癥衍生的cfDNA片段長度的變化更大。利用機器學習模型,結合全基因組片段特征,可以將早期癌癥檢測靈敏度提高到99%,特異度達到98%。DELFI方法與基于突變的cfDNA分析結合使用時,其靈敏度可以達到91%,特異度為98%。這為利用cfDNA分析人類早期癌癥篩查和監測提供了新的策略。液體活檢ctDNA主要代表死亡腫瘤細胞的基因組,但癌癥的進展和治療過程中的耐藥性卻是由活的腫瘤細胞驅動,因此,選擇合適的ctDNA篩選時間點至關重要。目前的研究指出,如果在腫瘤活檢之前進行液體活檢,ctDNA檢測可能會消除組織活檢的需要,但如果ctDNA分析為陰性,組織活檢仍可能提供有價值的基因組信息[27]。

2.2.2ctDNA在胰腺癌其他方面的應用 (1)ctDNA與腫瘤預后。有研究表明,血漿中ctDNA水平與腫瘤大小和分期相關,較高水平的ctDNA可能是胰腺癌患者生存率較差的獨立危險因素[15]。ctDNA可監測腫瘤復發,在進行手術或治療后,即使在沒有任何其他臨床疾病證據的情況下,檢測到ctDNA也可能表明存在最小殘留病灶,故ctDNA的存在還可以識別可能具有較高復發風險的患者[27]。(2)ctDNA用于療效評估。ctDNA可監測轉移性胰腺癌的化療應答,當治療失敗時,血漿中可檢測到耐藥胰腺癌細胞的DNA片段[38],且在一項關于總cfDNA水平的動態變化與化療后的腫瘤負荷關系的研究中,提供了治療前ctDNA水平與PDAC腫瘤負荷相關的證據,并且顯示連續cfDNA分析是監測癌癥對化療反應的可靠工具[39]。

2.3細胞外囊泡 PDAC中細胞外囊泡水平的診斷和預后評估價值已在研究中得到證實。即使在早期PDAC患者血清中,PDAC衍生細胞外囊泡中富集的磷脂肌醇蛋白聚糖-1也有較高的靈敏度和特異度[18]。同樣,細胞外囊泡中特征微小RNA的表達水平可用于PDAC的早期診斷[40]。

3 展 望

多維度評估基因組狀態或將成為腫瘤早篩技術趨勢。從上述研究不難看出,基于液體活檢技術所衍生出來的早篩對象不只局限于循環DNA層面甲基化標志物,已有發展為多維度指標聯合評估的趨勢。雖然國內外已有部分研究腫瘤早篩的數據,但多為處于單一檢測維度或體細胞突變聯合甲基化分析的方法,且大多處于起步階段,正在進行檢測技術的優化、標本的累積或前瞻性臨床試驗的驗證。胰腺癌早篩空間廣闊,對于液體活檢技術而言,其樣本前處理、提取方法和檢測靈敏度上還存在一些問題,當前最重要的是找到合適的目標分析物,提高早篩的靈敏度和特異度。為了進一步提升早期胰腺癌的檢測能力,更好地篩選中國胰腺癌高危人群,目前部分研究正在納入基因組拷貝數變異、cfDNA片段組學等分析,并且基于多維度生物標志物的大型胰腺癌早篩研究也陸續在開展中。隨著眾多學者對胰腺癌液體活檢更深入的研究,液體活檢正在得到越來越多的認可。此外,隨著創新性檢測技術的發展和檢測成本的降低,今后液體活檢有望普及,為胰腺癌的篩查和早期診斷提供更多的臨床幫助。