miRNA-574-5p和HMGB1在急性呼吸窘迫綜合征中的臨床意義*

段松堂,盧 威,喻 巍,左姍姍

1.長江航運總醫院重癥監護室,湖北武漢 430040;2.河北醫科大學第一醫院重癥二科,河北石家莊 050000

急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)以急性炎癥肺損傷和低氧性呼吸衰竭為特征,隨著肺部對局部炎癥或全身炎癥刺激產生的過度免疫反應而發展,影響全球大約10%的重癥監護室成人患者,其住院病死率達到40%[1-2]。當前需要尋找新的生物標志物為預防和治療ARDS提供潛在的治療靶點。微小RNA(miRNA)是長度為18～24個核苷酸的小型非編碼RNA,通過抑制目標mRNA翻譯或通過靶向互補mRNA進行早期降解來調節基因表達[3]。miRNA被證明參與各種炎癥疾病狀態,可能在ARDS的病理生理過程中發揮作用,可能是有吸引力的靶向治療候選物[4]。miR-574-5p被報道在多種疾病中發揮作用,如冠心病、肝細胞癌等[5-6]。高遷移率蛋白1(HMGB1)是典型的DNA結合核蛋白,介導感染和組織損傷中的炎癥,在ARDS中大量釋放[7]。據研究報道,HMGB1水平與重癥肺炎并發ARDS、膿毒癥合并ARDS等炎癥疾病密切相關[8-9]。上述研究提示miR-574-5p、HMGB1可能在ARDS的病理過程中具有重要的作用。本研究檢測了ARDS患者血清miR-574-5p、HMGB1水平,旨在探討其在ARDS中的意義,為制訂新的ARDS治療策略提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年6月至2018年6月長江航運總醫院收治的94例ARDS患者作為觀察組,其中男53例、女41例,平均年齡(44.65±11.76)歲,平均體重指數(22.87±2.19)kg/m2,吸煙32例,急性生理學與慢性健康狀況評分Ⅱ(APACHEⅡ)評分(21.62±7.15)分,依據相關標準將ARDS患者分為:輕癥組38例,血氧分壓(PaO2)/吸入氣中的氧濃度分數(FiO2)在201～300 mmHg;中癥組29例,PaO2/FiO2在101～<201 mmHg;重癥組27例,PaO2/FPiO2<101 mmHg[10]。納入標準:所有患者符合ARDS診斷標準[10]且均為第一次確診,住院時間≥1周,年齡在18周歲以上,心肺功能正常,臨床資料齊全,簽署知情同意書。排除標準:合并嚴重感染性疾病、腫瘤或其他疾病的患者。另納入同期于長江航運總醫院體檢的65例體檢健康者作為對照組,其中男38例、女27例,平均年齡(43.24±12.60)歲,平均體重指數(23.06±2.05)kg/m2,吸煙14例。兩組性別、年齡等比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。所有受試者均簽署了知情同意書。本研究獲得醫院倫理委員機構的批準(批準號:20170425)。

1.2方法 收集觀察組入院24 h內及對照組體檢當天的空腹肘靜脈血5 mL,在4℃條件下進行離心10 min,轉速為3 000 r/min。收集上層血清,分裝到離心管并轉移至-80 ℃冰箱保存待測。

1.3觀察指標 采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測血清miR-574-5p。根據試劑盒的說明書,使用Trizol試劑(貨號:10296028,購于賽默飛世爾科技有限公司)提取血清總RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度計(購于北京凱樂博科技發展有限公司)檢測總RNA濃度和純度。檢測合格的RNA樣品,使用promega逆轉錄試劑盒(貨號:A3500,購于上海聯碩生物科技有限公司)將其逆轉錄為cDNA。將獲得的cDNA按照TB Green?Premix Ex Taq Ⅱ Kit(貨號:RR820A,購于日本TaKaRa公司)試劑盒說明書,在ABI7500熒光定量系統上通過qRT-PCR進行表達分析,反應條件為95 ℃預變性30 s,95 ℃變性5 s 40個循環,60 ℃退火34 s。引物序列見表1,干粉由上海生工公司合成。以U6為內參基因,使用2-ΔΔCt方法計算miR-574-5p的相對表達水平。采用HMGB1 酶聯免疫吸附試驗試劑盒(貨號:YM-QP11257,購于上海遠慕生物科技有限公司)檢測血清HMGB1水平,具體操作參照試劑盒說明書。

表1 引物序列

1.4隨訪 從患者入院第二天開始進行追蹤隨訪,記入院28 d的生存狀況。

2 結 果

2.1觀察組和對照組血清miR-574-5p、HMGB1水平比較 與對照組比較,觀察組血清miR-574-5p和HMGB1水平升高,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 觀察組和對照組血清miR-574-5p、HMGB1水平比較

2.2不同病情嚴重程度患者血清miR-574-5p、HMGB1水平比較 不同病情嚴重程度患者血清miR-574-5p、HMGB1水平比較,差異有統計學意義(P<0.05);中癥組患者血清miR-574-5p、HMGB1水平高于輕癥組,且重癥組高于中癥組(P<0.05)。見表3。

表3 不同病情嚴重程度患者血清miR-574-5p、HMGB1水平比較

2.3觀察組血清miR-574-5p、HMGB1水平與APACHEⅡ評分的相關性分析 觀察組血清miR-574-5p、HMGB1水平與APACHEⅡ評分呈正相關(r=0.529,P<0.001;r=0.583,<0.001),見圖1。

注:A為miR-574-5p與APACHEⅡ評分的相關性;B為HMGB1水平與APACHEⅡ評分的相關性。

2.4觀察組血清miR-574-5p水平與HMGB1的相關性分析 觀察組血清miR-574-5p水平與HMGB1呈正相關(r=0.422,P<0.001),見圖2。

圖2 血清miR-574-5p水平與HMGB1相關性的散點圖

2.5不同預后患者血清miR-574-5p、HMGB1水平及APACHEⅡ評分比較 根據28 d隨訪結果,可將ARDS患者劃分為生存組(59例)和死亡組(35例),生存組患者血清miR-574-5p、HMGB1水平及APACHEⅡ評分均低于死亡組(P<0.05),見表4。

表4 不同預后患者血清miR-574-5p、HMGB1水平及APACHEⅡ評分比較

2.6多因素Cox回歸分析ARDS患者生存的影響因素 多因素Cox回歸分析結果顯示,APACHEⅡ評分及血清miR-574-5p、HMGB1水平均為影響ARDS患者生存的獨立危險因素(P<0.05),見表5。

表5 多因素Cox回歸分析ARDS患者生存的影響因素

3 討 論

在過去的50年里,臨床工作者對ARDS的流行病學、病理生理學和發病機制有了更多的了解,從而制訂了新的治療策略,明顯提高了ARDS患者的生存率。然而,重癥ARDS的病死率仍居高不下,因此早期評估ARDS的危險分層和優化管理對于改善預后至關重要。

據報道,miRNA的表達失調嚴重影響了ARDS患者的病情發展和預后[11]。miR-574-5p位于人類4號染色體上,在多種疾病中發生變化。研究發現,miR-574-5p在宮頸癌患者的血清中高表達,作為促癌基因參與了腫瘤的發生發展[12]。楊曉偉等[5]報道,miR-574-5p在冠心病患者的血清和平滑肌細胞中表達上調,可能是潛在的診斷生物標志物。本研究結果顯示,ARDS患者血清中miR-574-5p水平升高,與楊曉偉等[5]研究報道的結果類似,提示miR-574-5p的表達可能與ARDS的發生相關。進一步研究發現,miR-574-5p水平隨著病情嚴重程度加重逐漸升高,并且與APACHEⅡ評分呈正相關,APACHEⅡ評分越高,則患者病情越重,是評估ARDS危重癥患者預后的重要參照依據,說明miR-574-5p的表達可能與ARDS的嚴重程度有關。死亡組miR-574-5p水平明顯高于生存組,結果表明,miR-574-5p可能與ARDS患者的預后有關。以上結果表明miR-574-5p有作為ARDS患者病情評估和預后預測的潛力。

血清HMGB1作為一種炎癥介質,可加重炎癥損傷從而誘發ARDS或致死性炎癥反應[13]。既往報道表明,HMGB1水平升高與多種疾病相關,能反映炎癥和組織損傷的嚴重程度,可作為生物標志物來預測疾病進展。郭小芙等[14]發現,膿毒癥合并ARDS患者血清中HMGB1水平升高,是膿毒癥患者并發ARDS的危險因素之一,能作為早期預測ARDS的參考指標。另一項研究也報道了血漿HMGB1水平升高與ARDS患者的病情嚴重程度和預后有關[15]。本研究與上述研究結果類似,HMGB1水平在ARDS患者血清中升高,且隨著水平的升高,病情嚴重程度逐漸加重,死亡組患者HMGB1水平高于生存組,相關性分析結果表明,HMGB1水平與APACHEⅡ評分呈正相關,提示血清HMGB1水平有助于評估ARDS的病情發展和預后。

動物模型研究證實,miR-574-5p可以通過靶向HMGB1緩解ARDS,然而HMGB1的過表達能夠逆轉miR-574-5p的抗炎作用[16]。ARDS患者血清miR-574-5p水平與HMGB1呈正相關,分析其原因,miR-574-5p水平升高可能為機體的代償性適應,但miR-574-5p對HMGB1的靶向抑制作用不及疾病誘發HMGB1表達的作用,進而導致二者水平均升高,但二者也可能存在靶向關系。miR-574-5p和HMGB1被認為是評估膿毒癥患者預后的獨立因素[17-18]。多因素Cox回歸分析表明,APACHEⅡ評分及miR-574-5p、HMGB1水平均為影響ARDS患者生存的獨立危險因素,提示血清miR-574-5p和HMGB1可能作為評估ARDS患者預后的分子標志物,且二者呈正相關,該結果可能為ARDS的治療提供新的見解。

綜上所述,ARDS患者血清miR-574-5p、HMGB1與ARDS的病情嚴重程度和預后密切相關,具有作為新的治療靶點的潛力,對于臨床優化治療和改善預后具有重要的意義。但本研究仍有缺陷,如miR-574-5p是否可通過靶向HMGB1影響ARDS的病情進展仍不明確,需要在未來的研究中補充基礎實驗進行說明。