補腎通絡方治療膝骨性關節炎機制網絡藥理學研究*

宋玉成，歐國誼，楊永強，姚慶藍，區 澤，紀科偉

（廣東省人民醫院南海醫院，廣東 佛山 528200）

目前臨床對膝骨性關節炎的西醫治療手段包括手術、康復理療、口服非甾體抗炎藥、關節腔內藥物注射、口服止痛藥等，但手術創傷較大，而長期服藥易引發出血、潰瘍、消化道穿孔等不良反應，進而影響療效［1］。故可考慮中醫（中藥）治療。補腎通絡方由多種中藥組方，可較好地改善膝骨性關節炎患者關節功能受限、疼痛的情況。網絡藥理學可清晰顯示“藥物-靶點-疾病-基因”的內在聯系，廣泛用于中藥復方配伍規律方面的研究。鑒于此，本研究中基于網絡藥理學方法并結合中醫對膝骨性關節炎的認識［2-3］，分析了補腎通絡方治療該病可能的作用機制［4-5］，以期為該病的治療進一步提供理論依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 方劑組成與來源

補腎通絡方（組方：熟地、杜仲、當歸各12 g，防風10 g，山萸肉、懷牛膝、寄生、獨活、秦艽各9 g，地龍、甘草各6 g，細辛3 g）。所有組方中藥（飲片）及方劑均由我院中醫科提供。

1.2 補腎通絡方活性成分與潛在靶點篩選

檢索BATMAN-TCM數據庫（http：//bionet.ncpsb.org/ batman - tcm）；參數設置為P< 0.05，Score cutoff =20），分別以熟地、杜仲、當歸、山萸肉、懷牛膝、寄生、獨活、秦艽、防風、細辛、地龍、甘草為關鍵詞，并參照ADME原理，以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為標準，檢索并篩選該方的活性成分及潛在靶點，建立補腎通絡方活性成分-靶點基因數據庫。

1.3 補腎通絡方治療膝骨性關節炎潛在作用靶點預測

通過CTD 數據庫（http：//ctdbase.org/）、人類孟德爾遺傳數據庫（https：//omim.org/）、GeneCards 數據庫（http：// www. genecards. org，Version 4.11.0）檢索膝骨性關節炎相關基因并匯總，去除重復基因，并通過CooLGeN 數據庫（http：// ci. smu. edu. cn/ CooLGeN/Home.php）篩選。將補腎通絡方活性成分靶點與膝骨性關節炎基因靶點相互映射，獲得補腎通絡方治療膝骨性關節炎的潛在作用靶點。

1.4 蛋白相互作用（PPI）網絡構建與分析

將補腎通絡方作用于膝骨性關節炎的靶點基因導入String數據庫（https：//string-db.org，Version 11.0），限定物種為“Homo Sapiens”，獲取PPI關系并以.TSV 格式保存，導入Cytoscape 3.7.2 軟件，利用其“Network analyzer”工具行網絡拓撲屬性分析，篩選重要靶點蛋白。

1.5 富集分析

將補腎通絡方作用于膝骨性關節炎的靶點基因導入DAVID 數據庫（https：// david. ncifcrf. gov/ home. jsp），限定物種為“Homo Sapiens”，P<0.05，所有靶基因名稱矯正為官方名稱，并利用Omicshare 云平臺（https：//omicshare. com/）進行基因本體論（GO）功能富集分析（包括生物過程、細胞組分、細胞功能3 個方面）及京都基因與基因組百科全書（KEGG）信號通路富集分析。

2 結果

2.1 補腎通絡方活性成分篩選

初步檢索得補腎通絡方中活性成分738個，按要求進一步篩選后得到80 個，其中熟地2 個、杜仲11 個、當歸16 個、山萸肉2 個、懷牛膝3 個、寄生5 個、獨活9 個、秦艽3個、防風4個、細辛6個、地龍3個、甘草16個，10個化學成分為多種中藥共有。

2.2 補腎通絡方作用靶點預測

初步檢索共得到5 961 個膝骨性關節炎的潛在靶點，刪除重復后得到5 524 個，與2.1 項下70 個靶點映射取交集，得共有靶點46個，即為補腎通絡方治療膝骨性關節炎的潛在靶點。維恩圖見圖1。補腎通絡方治療膝骨性關節炎“藥物- 活性成分- 基因靶點”網絡見圖2。

圖1 藥物-疾病靶點維恩圖Fig.1 Venn diagram of drug - disease targets

圖2 藥物-活性成分-基因靶點網絡Fig.2 Network of drug - active ingredient - gene targets

2.3 PPI 網絡構建與分析

所得PPI 網絡中共包括79 個節點、956 條邊，靶點蛋白平均節點度（degree）值為24.2（其中有24 個靶蛋白degree 值≥24），依據臨床重要性篩選出的10 個重要潛在靶點蛋白及其PPI網絡見圖3。

圖3 10個關鍵蛋白靶點的PPI網絡Fig.3 PPI network of 10 key protein targets

2.4 富集分析

共富集到GO 條目133 個，其中生物過程96 個、細胞組分14 個、分子功能23 個。選取富集數目排前10 的功能進行可視化（見圖4）。結果顯示，生物過程主要富集在凋亡過程、細胞增殖與代謝、信號傳導、炎性反應等方面，細胞組分主要富集在胞質溶膠、細胞外泌體基因等方面，細胞功能主要富集在乙酰膽堿結合、氧化還原酶、過氧化物酶活性、細胞周期蛋白結合等方面。共富集到KEGG 信號通路76 條，主要涉及腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、類風濕關節炎、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、破骨細胞分化、低氧誘導因子- 1（HIF-1）信號通路等。選擇富集數目排名前10 的信號通路繪制氣泡圖進行可視化（見圖5）。

圖4 GO功能富集分析Fig.4 Results of GO functional enrichment analysis

圖5 KEGG信號通路富集分析Fig.5 Results of KEGG signaling pathway enrichment analysis

3 討論

膝骨性關節炎可造成關節腔積液、滑膜炎癥、骨贅形成、半月板損傷等一系列影響患者日常生活的情況［6-7］。老年人群隨著年齡的增加，肝腎衰氣血少，風寒外邪更易侵襲機體，因此易發生該病。該病屬中醫“膝痹”“骨痹”“痹癥”等范疇，治療應以活血化瘀、補腎益氣為主要原則［8］。

補腎通絡方組方中藥中，杜仲、懷牛膝可通利關節、破血逐淤、舒筋活絡，有效緩解關節疼痛、跌打損傷、活動不便等病癥，熟地、當歸、山萸肉、寄生、獨活、秦艽、防風、細辛、地龍、甘草等中藥均具有補益肝腎、活血止痛、祛濕除風、溫腎壯陽、補肝補腎等作用，可有效改善患者風濕痹痛、肝腎不足等癥狀，諸藥合用，共同發揮活血養血、強筋健骨、溫補肝腎、化瘀止痛的作用［9-10］。現代藥理學研究表明，補腎通絡方中多種中藥均具有免疫調節、鎮痛、抗炎的作用，顯示出補腎通絡方在治療膝骨性關節中獨特的優勢［11］。本研究中共篩選出活性（化合物）成分70 個，以及其治療膝骨性關節炎的潛在靶點46個，表明補腎通絡方具有多成分、多靶點的特點。

PPI 網絡中共有24 個靶點蛋白，10 個關鍵蛋白中，TNF、IL-6 及IL-10 均為膝骨性關節發病過程中重要的炎性介質，可參與炎性反應的調節［12］；TLR4 對細胞因子分泌、核因子- κB 活化、炎性反應具有介導作用［13］；PTGS2 可參與細胞表型改變、細胞黏附增加、腫瘤血管形成、抗凋亡等過程，且可分泌炎性前列腺素；CCL2 為與多種疾病發生存在密切聯系的分泌蛋白，可參與炎性反應、免疫調節［14］；INS為對脂質代謝、碳水化合物代謝具有調節作用的肽激素；ALB 為激素、外源性藥物、代謝物、脂肪酸等內源性分子的載體蛋白，對血漿膠體滲透壓具有調節作用；JUN 可調節基因表達，AKT1 可通過轉錄的方式抑制凋亡，且可參與神經元成活。可見，補腎通絡方作用的靶點蛋白涉及免疫、炎癥、代謝、細胞成活等多種功能。

GO 功能富集分析發現，補腎通絡方可調控體內多種信號通路，其生物過程均涉及凋亡過程、細胞增殖與代謝、信號傳導、炎性反應等。KEGC 信號通路富集分析發現，TNF 信號通路、MAPK 信號通路、破骨細胞分化、HIF-1信號通路為補腎通絡方治療膝骨性關節的潛在作用靶點。其中TNF 信號通路可介導炎性反應，加重膝骨性關節炎炎性反應［15］；MAPK 信號通路可促進破骨細胞成熟，且可抑制軟骨細胞的凋亡［16-17］；HIF- 1 信號通路可促進軟骨細胞形成，且維持其生存能力，可使其適應缺氧環境［18］。

綜上所述，本研究中采用網絡藥理學方法探討了補腎通絡方治療膝骨性關節炎的作用機制，從分子水平方面對補腎通絡方的多通路、多成分、多靶點調控機制進行了闡述。補腎通絡方可能通過調控炎性反應、細胞增殖凋亡發揮療效，這為該方治療膝骨性關節炎提供了理論依據。但本研究也有一定的局限性，如數據庫數據不全，忽略了藥物成分相互作用、中藥成分含量、體內其他藥物代謝動力學影響等，因此還需進一步研究證實。