外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD-L1 用于沙利度胺聯合達那唑治療骨髓增生異常綜合征療效評估價值分析

劉 焰，李國妍，陳 超

（山東省菏澤市中醫醫院藥學部，山東 菏澤 274000）

骨髓增生異常綜合征（MDS）是一種以髓系細胞發育異常為特點的異質性髓系克隆性疾病，若未及時有效干預，可能會轉化為急性髓系白血病，危及生命［1-3］。沙利度胺、達那唑是治療MDS 的常用藥物，前者具有抗細胞因子及免疫調節作用，可抑制腫瘤壞死因子生成及T 淋巴細胞增殖，還可抑制新生血管生成；達那唑為睪酮衍生物，既可直接刺激造血干細胞，又可通過刺激腎臟產生紅細胞生成素促進造血，二者聯用可發揮協同增效作用。MDS 病因較復雜，相關研究顯示，造血干細胞基因突變、細胞免疫缺陷可能與其發病過程密切相關，主要表現為免疫逃逸、造血干細胞惡性克隆等［4-5］。而T 淋巴細胞免疫球蛋白黏液素3（Tim3）可介導腫瘤微環境的免疫抑制，參與多種腫瘤發生、浸潤與轉移［6］。有研究表明，程序性死亡因子-1/程序性死亡因子- 1 配體（PD - 1/ PD - L1）高表達所致腫瘤免疫逃逸機制是腫瘤發生、發展的重要原因［7-8］。白細胞介素32（IL-32）可介導一系列免疫反應［9］。目前，臨床針對MDS 主要采用免疫抑制劑聯合雄激素藥物治療，但既往研究多集中于探討二者聯合治療的效果，鮮有研究聯合用藥前后MDS患者外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD - L1 的表達水平。鑒于此，本研究中分析了上述外周血指標在沙利度胺聯合達那唑治療MDS 前后的表達變化趨勢，并結合血常規及骨髓細胞學檢查指標判斷評估療效的價值。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標準：符合MDS 診斷標準［10］，并經骨髓細胞學、免疫分型及病理活檢確診；初次發病；預計生存期> 6 個月。本研究經醫院醫學倫理委員會批準［批件號：（2017）倫審第（1753）號］，患者簽署知情同意書。

排除標準：合并肝腎等重要臟器器質性病變；對本研究擬用藥物過敏；妊娠期、產褥期或哺乳期；存在自身免疫功能缺陷性疾病或全身感染性疾病；合并其他部位惡性腫瘤；接受細胞毒性藥物或接觸有血液毒性的化學制品或生物制劑等；重金屬中毒或過度飲酒；再生障礙性貧血、原發性骨髓纖維化、大顆粒淋巴細胞白血病或其他累及造血干細胞疾病；嚴重意識障礙或精神行為異常。

病例選擇：選取醫院2018 年1 月至2020 年5 月收治的MDS 患者112 例，其中男70 例，女42 例；年齡32～58 歲，平均（46.89 ± 5.10）歲；體質量指數（BMI）20～28 kg/m2，平均（24.09±1.83）kg/m2；病程1～15個月，平均（9.82±2.15）個月。

1.2 方法

1.2.1 資料收集

參考相關文獻、咨詢專家意見、臨床實踐，自擬《MDS 患者一般資料調查問卷》，調查患者的年齡、性別、BMI、病程、世界衛生組織（WHO）分型［11］、MDS的國際預后積分系統修訂版（IPSS-R）危險度分層［12］，其中WHO 分型包括難治性貧血伴原始細胞增多Ⅰ型（RAEB-Ⅰ）、RAEB-Ⅱ、難治性貧血伴環狀鐵粒幼細胞（RARS）、難治性血細胞減少伴多系發育異常（RCMD）；IPSS-R危險度分層，≥2.5分、1.5～2.0分、0.5～1.0分、0分分別為高危、中危Ⅱ、中危Ⅰ、低危。

1.2.2 治療方法與分組

患者均接受營養支持、心理疏導等對癥治療，口服沙利度胺片（常州制藥廠有限公司，國藥準字H32026130，規格為每片50 mg），每次50 mg，每日1 次，持續1 周后，劑量增至每日100 mg，再持續1 周后，劑量增至每日200 mg，用藥第4 周根據患者病情在每日100～200 mg 范圍內調整劑量。服用達那唑膠囊（江蘇聯環藥業股份有限公司，國藥準字H32022729，規格為每粒0.1 g），每日0.3 g，每日3 次，連續治療3 個月。按治療是否有效分為有效組和無效組。

1.3 觀察指標與療效判定標準

觀察指標：1）血常規。治療前后取患者空腹外周靜脈血3 mL，采用全自動血細胞分析儀檢測白細胞計數（WBC）、血紅蛋白（Hb）、血小板計數（PLT）水平，嚴格按儀器說明書操作。2）骨髓原始細胞。患者髂后上棘行骨髓穿刺，抽取骨髓液0.2 mL涂片，采用瑞氏-吉姆薩染色，計數200個有核細胞，計算骨髓原始細胞百分比。3）外周血Tim3，IL - 32，PD - 1/ PD - L1 水平。取患者外周血4 mL，分裝2管，以乙二胺四乙酸抗凝，每管均添加2 mL 紅細胞裂解液，避光反應5 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌1 次，離心，棄上清液，PBS 重懸；取100μL，加入Tim3，PD-1，PD-L1抗體，室溫避光孵育15 min，PBS 洗滌1 次，離心，棄上清液；加入200 μL PBS 重懸，采用流式細胞儀測定Tim3，PD-1，PD-L1 表達水平；取患者空腹外周靜脈血3 mL，2 500 r/ min 離心8 min（離心半徑6 cm），分離，取血清，以酶聯免疫吸附試驗法檢測IL-32水平，嚴格按試劑盒說明書操作。

療效判定［13］：完全緩解，出血、貧血等癥狀消失，Hb ≥100 g/ L，WBC ≥4 × 109/ L，PLT 為（80～100）×109/L，分類未見幼稚細胞，且骨髓中原始粒細胞和早幼粒細胞之和占比< 5%，維持時間≥6 個月；部分緩解，上述癥狀部分消失，骨髓中原始粒細胞和早幼粒細胞之和占比較治療前下降50%，維持時間≥3 個月；進步，上述癥狀有所減輕，骨髓中原始粒細胞和早幼粒細胞之和占比下降30%；無效，未達上述標準。將完全緩解、部分緩解、進步納入有效組，無效納入無效組。

1.4 統計學處理

采用SPSS 22.0 統計學軟件分析。計量資料行Kolmogorov - Smirnov 檢驗與Bartlett 檢驗，均服從正態分布且方差齊性時以表示，行獨立樣本t檢驗；計數資料以率（%）表示，行χ2檢驗。外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD - L1 間及其與血常規骨髓細胞學指標的相關性采用Pearson 相關系數模型分析，與療效間的相關性采用Logistic 多因素回歸分析；評估價值分析采用受試者工作特征（ROC）曲線，獲取曲線下面積、95%置信區間（CI）、敏感度、特異度及cut - off 值，聯合評估實施Logistic 二元回歸擬合，返回預測概率logit（p），將其作為獨立檢驗變量。采用雙側檢驗，α=0.05，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 單因素比較

有效組患者91 例，無效組患者21 例。兩組患者基本資料見表1，血常規、骨髓細胞學及外周血指標比較見表2。

表2 兩組患者血常規、骨髓細胞學及外周血指標比較（）Tab.2 Comparison of blood routine，bone marrow cytology and peripheral blood indicators between the two groups（）

注：與本組治療前比較，aP < 0.05。Note：Compared with those before treatment，aP < 0.05.

組別Tim3（%）治療前2.76±0.25 3.03±0.36 4.081<0.001 WBC（×109/L）治療前3.03±0.40 2.61±0.37 4.359<0.001治療后4.78±1.02a 2.70±0.81 8.721<0.001 Hb（g/L）治療前54.27±6.36 48.10±5.17 4.137<0.001治療后80.59±10.93a 50.73±8.72 11.677<0.001 PLT（×109/L）治療前57.12±6.04 51.93±5.05 3.651<0.001治療后68.53±11.24a 53.14±9.10 5.842<0.001骨髓原始細胞比例（%）治療前10.25±1.02 11.31±1.13 4.207<0.001治療后8.16±1.15a 10.94±1.86 8.779<0.001有效組（n=91）無效組（n=21）t值P值治療后2.02±0.21a 2.95±0.44 14.389<0.001 IL-32（ng/L）治療前72.18±8.03 80.24±9.11 4.042<0.001治療后53.67±7.64a 78.15±10.29 12.353<0.001 PD-1/PD-L1治療前1.79±0.24 2.21±0.36 6.525<0.001治療后1.65±0.13a 2.17±0.45 9.545<0.001

2.2 相關性分析及價值評估

治療前后，外周血Tim3 分別與治療前后IL - 32和PD - 1/ PD - L1（r= 0.662，0.404，0.675，0.666，P<0.05）呈正相關，IL-32 分別與治療前后的PD-1/PD - L1（r= 0.446，0.672，P< 0.05）呈顯著正相關。詳見圖1。治療前后外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD-L1均與WBC，Hb，PLT 呈顯著負相關，與骨髓原始細胞比例呈顯著正相關（P<0.05）。詳見表3。

圖1 治療前后外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD-L1間的關聯性Fig.1 Correlation among peripheral blood Tim3，IL - 32 and PD - 1 / PD - L1 before and after treatment

表3 外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD-L1與血常規及骨髓細胞學指標的相關性Tab.3 Correlation of peripheral blood Tim 3，IL - 32 and PD - 1 /PD - L1 with blood routine and bone marrow cytology indicators

以療效為因變量（有效= 0，無效= 1），以病程、WHO 分型、IPSS - R 危險度分層，治療前及治療后的WBC，Hb，PLT及骨髓原始細胞比例，外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD-L1為自變量，進行Logistic多元回歸分析，結果顯示，治療前后外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD-L1仍與療效顯著相關（P<0.05）。詳見表4。

表4 外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD-L1與療效的相關性Tab.4 Correlation of peripheral blood Tim3，IL - 32 and PD - 1 / PD - L1 with the efficacy

ROC曲線顯示，外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD-L1聯合評估沙利度胺聯合達那唑治療MDS 可能無效的AUC最大（0.885），敏感度、特異度分別為76.19%，92.31%。詳見表5、圖2。

圖2 外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD-L1對療效的評估價值Fig.2 Evaluation value of peripheral blood Tim3，IL - 32 and PD - 1 / PD - L1 in the efficacy

表5 外周血Tim3，IL-32，PD-1/PD-L1對療效的評估價值Tab.5 Evaluation value of peripheral blood Tim3，IL - 32 and PD - 1 / PD - L1 in the efficacy

3 討論

近年來，沙利度胺聯合達那唑在臨床MDS 治療中受到廣泛重視，其中沙利度胺為常見免疫抑制劑，參與免疫調節、抑制細胞增殖、分化及形成造血因子等過程；達那唑是人工合成的甾體類雄激素，有助于抑制骨髓細胞凋亡，但二者聯用可能存在耐藥及復發現象［14-15］。因此，及時、準確地評價沙利度胺聯合達那唑的療效，有助于客觀判斷MDS患者的預后。

Tim3 通過結合其配體S 型凝集素半乳糖凝集素9，可產生免疫負調控作用，誘導Th1 細胞凋亡，抑制γ干擾素表達，導致骨髓來源的抑制性細胞異常增殖，從而產生免疫抑制［15-16］。PD-1/PD-L1 是一對負性免疫共刺激分子，其中PD-1主要在T淋巴細胞、胸腺細胞、B 淋巴細胞、自然殺傷（NK）細胞等細胞膜表面表達，PD - L1 是其介導的免疫抑制主要配體［17-18］。ZOU等［19］的研究表明，在腫瘤中，PD - 1 和PD - L1 相互作用能抑制腫瘤微環境中T淋巴細胞活化所致免疫抑制，減弱抗腫瘤效應。IL-32 為細胞炎性因子，其表達在免疫組織中過度上調，楊穎瑩等［20］指出，其具有誘導機體免疫細胞凋亡的作用。本研究結果顯示，治療有效的MDS 患者治療3 個月后外周血3 個指標明顯低于治療前，可能與聯合用藥糾正了異常免疫有關，推測該聯合用藥的主要療效可能與調節3 個指標水平表達存在關聯。治療前有效組與無效組患者外周血3個指標水平存在差異，可能與WHO 分型、IPSS - R 危險度分層等有關。進一步研究可知，治療前后有效組患者外周血3 個指標水平明顯低于無效組患者，結合文獻［21 - 23］研究結果，考慮機制可能在于3 個指標表達過度升高，可抑制細胞內磷酸酶增殖，刺激T 細胞受體信號，激發效應T 細胞功能活性，促進大量細胞因子分泌，強化裂解靶細胞效應，降低免疫突觸穩定性，從而加快MDS 病情進展，加重患者耐藥性，影響療效。

同時，汪德珍等［24］經Cox 回歸分析顯示，WBC 和PLT 是地西他濱治療MDS 預后的獨立危險因素。曾俊權［25］指出，MDS患者骨髓中伴有不同程度血管新生，且骨髓原始細胞百分比與血管新生數量呈正相關，有助于指導臨床實施對癥治療。對比研究表明，有效組患者治療前WBC，Hb，PLT 水平在治療3 個月后有所提高，骨髓原始細胞比例有所下降，這可能歸因于聯合用藥能改善骨髓細胞凋亡程度，增強對髓細胞異常增殖的抑制效果，刺激機體產生正常造血功能，進而促進機體血象、骨髓象改善。Pearson 線性相關性分析結果提示，治療前、治療3 個月后外周血3 個指標與WBC，Hb，PLT及骨髓原始細胞比例均存在一定相關性，有望成為評估沙利度胺聯合達那唑治療MDS 效果的有效輔助觀察指標。

此外，本研究結果顯示，外周血Tim3 與IL - 32 和PD - 1/PD - L1 線性關系良好，表明三者可在MDS 患者機體免疫應答反應中發揮協同作用。為進一步明確3 個指標水平對沙利度胺聯合達那唑療效的評估價值，本研究中繪制了ROC 曲線，結果發現，聯合檢測3 個指標水平有助于指導臨床評估沙利度胺聯合達那唑療效，客觀評價MDS 患者預后。另外，在評估聯合治療效果的同時還應將病程、WHO 分型、IPSS-R 危險度分層等因素納入考慮范圍內，以獲取更可靠的研究結果。

綜上可知，沙利度胺聯合達那唑治療MDS，可有效下調外周血Tim3，IL - 32，PD - 1/ PD - L1 水平，明確上述外周血指標治療前后的變化情況，可為臨床評估MDS療效提供新思路。