黃芪總皂苷抑制膽管反應抗膽汁性肝纖維化的作用機制研究＊

方 靜，胡永紅，梁 悅，慕永平，劉 偉，劉 平，3，呂 瑩，陳佳美＊＊

（1. 上海中醫藥大學附屬曙光醫院 上海 201203；2. 上海市中醫藥研究院肝病研究所，肝腎疾病病證教育部重點實驗室，上海市中醫臨床重點實驗室 上海 201203；3. 上海中醫藥大學交叉科學研究院 上海 201203）

膽汁性肝纖維化是慢性肝病尤其是膽汁淤積性肝病累及膽管的特征性病理變化，可進一步發展為膽汁性肝硬化，甚至引起肝衰竭[1]。控制病因、藥物治療緩解或阻斷膽汁淤積以及抗肝纖維化治療是其主要治療手段。熊去氧膽酸或奧貝膽酸等藥物治療面臨著應答不完全、劑量依賴性瘙癢、以及經濟負擔重等問題[2]。因此，探索膽汁性肝纖維化發生發展的病理機制及其治療手段具有重要的臨床應用價值。

膽管反應（Ductular reaction，DR）的病理特點包括膽管增生、基質變化和炎性細胞的浸潤，是膽汁性肝纖維化發生發展的重要病理環節[3]。DR 可通過分泌促炎介質和促纖維化細胞因子促進炎癥反應和肝纖維化進展[4-5]，而抑制DR可治療膽汁性肝纖維化[6]。

黃芪總皂苷（Astragalosides，ASTs）是中藥黃芪的主要有效組分。課題組前期研究發現ASTs 可顯著抑制膽管結扎（Bile duct ligation，BDL）誘導的大鼠膽汁性肝纖維化的進展，且主要與抑制膽管反應有關[7]。然而ASTs如何抑制膽汁性肝纖維化中的膽管反應，其主要作用機制尚未十分明確，深度解析ASTs抗膽汁性肝纖維化的作用機制可為臨床研發新藥奠定良好的科學基礎。因此，本研究旨在探索ASTs 抑制DR 改善膽汁性肝纖維化的部分作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠24只，SPF 級，體質量160-180 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005。所有大鼠飼養于上海中醫藥大學實驗動物中心，環境溫度25±2℃，相對濕度40%-60%，自由飲水飲食。本研究動物實驗由上海中醫藥大學實驗動物倫理委員會審批，倫理審查號：PZSHUTCM190531003，符合實驗室動物管理與使用準則。

1.2 實驗細胞

大鼠肝祖細胞株WB-F344 購于復祥生物技術有限公司。

1.3 實驗藥物及主要試劑

黃芪總皂苷（ASTs）：購自西安鴻生生物技術有限公司，純度>90%。蛋白酶磷酸酶抑制劑混合液（貨號：P1050），RIPA 裂解液（貨號：P0013B），APS（貨號：ST005），封閉液（貨號：P0220），BSA（貨號：ST023），30% Acr-Bis（貨號：ST003），SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5×）（貨號：P0015L），均購自碧云天生物技術研究所。丁酸鈉（Sodium butyrate，SB）（貨號：B5887），購自Sigma公司。PVDF 膜（貨號：162-0177），購自Bio-Rad公司。羥脯氨酸試劑盒（貨號：A030-2），購自南京建成生物工程研究所。RNA 提取試劑盒（貨號：742100），逆轉錄試劑盒（貨號：831300），均購自日本TOYOBO 公司。α-平滑肌肌動蛋白抗體（alphasmooth muscle actin，α-SMA，貨號：ab124964）、上皮細胞粘附分子抗體（Epithelial cell adhesion molecule，Epcam，貨號：ab71916）、結蛋白抗體（Desmin，貨號：ab152500），均購自美國Abcom 公司。細胞角蛋白19抗體（Cytokeratin 19，CK19，貨號：10712-1-AP）和CK7抗體（貨號：15539-1-AP）購自美國Proteintech 公司。卵圓細胞標記物6 抗體（Oval Cell Marker 6，OV6，貨號：sc-101863）和LOXL1 抗體（貨號：sc-166632）購自美國Santa Cruz公司。

2 方法

2.1 膽管結扎模型制備及分組

將大鼠隨機分為假手術組和模型組，模型組大鼠根據課題組常用的膽管結扎方法制備膽汁性肝纖維化模型[8]。膽管結扎造模后第2周首日，BDL模型組大鼠隨機分為2 組：模型組（8 只），ASTs 組（8 只）。ASTs溶于雙蒸水中，給予大鼠160 mg·kg-1·d-1體質量灌胃，每天1 次，連續給藥3 周。假手術組和模型組大鼠予以同體積的雙蒸水灌胃。第4周末處死取材。

2.2 細胞培養和處理

WB-F344在含有10% FBS的高糖DMEM 中培養，培養箱37℃，5% CO2。采用丁酸鈉（Sodium butyrate，SB）（終濃度為3.75 μmol·L-1）誘導WB-F344 細胞向膽管上皮細胞表型轉分化模型。同時給予ASTs（100 μg·mL-1）干預，4天后收集細胞檢測。

2.3 血清生化學檢測

血清天門冬氨酸氨基轉移酶（Aspartate aminotransferase，AST）和丙氨酸氨基轉移酶（Alanine aminotransferase，ALT）活性由上海中醫藥大學附屬曙光醫院檢驗科采用全自動生化分析儀東芝TBA-40FR檢測。

2.4 肝組織羥脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）含量測定

使用試劑盒堿水解法測定大鼠肝組織Hyp 含量。取50-80 mg 肝組織，加入1 mL 堿水解液，調整pH=6.0-6.8，定容至10 mL，取4 mL 稀釋水解液加活性炭30 mg 混勻，用3500 r·min-1轉速離心后取1 mL 上清檢測。按照說明書步驟將樣品與試劑混勻，放置60℃水浴15 min，自然冷卻后，用3500 r·min-1轉速離心后取200 μL 上清測吸光度。測吸光度條件：550 nm，1 cm光徑，雙蒸水調零。

2.5 肝組織蘇木精-伊紅染色、天狼猩紅染色

肝組織福爾馬林浸泡后，常規脫水，石蠟包埋。切4 μm 厚度切片，做蘇木精-伊紅染色（Hematoxylin and eosin staining，HE）、天狼猩紅染色（Sirius red，SR），光鏡下觀察大鼠肝組織炎癥與膠原沉積情況。并使用Leica LAS Image Analysis 圖像分析軟件對SR染色的全片膠原陽性面積進行定量分析。

2.6 免疫組織化學染色

石蠟切片后，梯度酒精脫水，PBS清洗，檸檬酸溶液抗原修復，3% H2O2滅活內源性酶，封閉后一抗（α-SMA 1∶1000、Desmin 1∶200、CK19 1∶400、CK7 1∶400、Epcam 1∶800、OV6 1∶400）孵育過夜，第2 天孵育二抗，37℃孵育30 min，DAB顯色，染核，脫水，封片，光鏡下觀察。

2.7 蛋白免疫印跡法

肝組織勻漿后提取蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，蛋白制樣后使蛋白充分變性。根據蛋白分子量大小制備分離膠和堆積膠，蛋白上樣后恒壓80V 電泳至結束；根據濕轉轉膜法進行轉膜，用快速封閉液室溫封閉15 min 后加一抗（Epcam 1∶1000、LOXL1 1∶250）孵育過夜；第2 天二抗孵育后，使用Odyssey 儀器進行顯影，保存圖像。

2.8 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）

從肝組織中提取總RNA，測樣品RNA 濃度，按500 ng，10 μL體系進行逆轉錄。按照說明書步驟和實驗條件，逐步加入樣品含量，4×DN Master Mix 和5×RT Master Mix II，結束取出逆轉錄后的cDNA 樣本。然后用試劑盒SYBR Green PCR Master Mix，10 μL 體系進行PCR 擴增，采用ΔΔCT 法定量。引物序列見表1。引物由BioTNT公司設計及合成。

表1 引物序列

2.9 統計學分析

應用SPSS 22.0 for Windows 統計軟件，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間比較，采用單因素方差分析（One-way ANOVA），符合方差齊性檢驗（P>0.05），兩兩比較采用LSD-t法；方差不齊（P<0.05），采用Dunnett T3法，P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 BDL 大鼠肝組織和體外細胞中賴氨酰氧化酶家族蛋白的變化情況

HE和SR染色顯示，BDL組大鼠肝組織已形成明顯的肝纖維化（見圖1A）。qRT-PCR結果顯示，與假手術組比較，BDL 組大鼠肝組織LOX、LOXL1、LOXL2 和LOXL3 的mRNA 表達顯著上調（P<0.01），而LOXL4 的mRNA表達顯著下降（P<0.01）（見圖1B）。體外用丁酸鈉誘導WB-F344細胞后，細胞CK19的蛋白表達顯著增加（見圖1C），提示丁酸鈉可成功誘導WB-F344細胞向膽管上皮細胞表型轉分化。進一步研究發現，與對照組比較，丁酸鈉組細胞LOXL1、LOXL2和LOXL4的mRNA表達顯著升高（P<0.01），而LOX 和LOXL4 的mRNA 表達顯著降低（P<0.01）（見圖1D）。提示在BDL誘導的膽汁性肝纖維化肝組織和體外肝祖細胞向膽管上皮細胞表型分化中LOXL1和LOXL2的表達變化一致。

圖1 BDL大鼠肝組織和體外細胞中賴氨酰氧化酶家族蛋白的變化情況

3.2 黃芪總皂苷對BDL 大鼠肝損傷和肝纖維化程度的影響

HE 染色顯示，假手術組肝組織肝小葉結構完整，肝索排列整齊；與假手術組比較，BDL 組大鼠肝細胞形態結構破壞，匯管區周圍可見大量不規則膽管增生和炎性細胞浸潤。與BDL組比較，ASTs組肝組織膽管增生和炎性細胞浸潤明顯減輕（見圖2A）。與假手術組比較，BDL 組大鼠血清ALT 和AST 活性顯著升高（P<0.01）。與BDL 組比較，ASTs 組大鼠血清ALT 和AST活性顯著降低（P<0.01）（見圖2B和2C）。提示ASTs可顯著改善BDL大鼠肝損傷。

圖2 黃芪總皂苷對BDL大鼠肝損傷和肝纖維化程度的影響

SR 染色顯示，與假手術組比較，BDL 組大鼠肝組織可見大量膠原纖維沉積，呈團簇狀分布于匯管區周圍，并向肝實質區域延伸。與BDL 組比較，ASTs 組大鼠肝組織膠原沉積顯著減少（見圖2A）。與假手術組比較，BDL組大鼠肝組織Hyp含量和SR陽性染色面積百分比均顯著增加（P<0.01）。與BDL 組比較，ASTs組大鼠肝組織Hyp 含量和SR 陽性染色面積百分比均顯著降低（P<0.01）（見圖2D 和2E）。結果表明，ASTs 可顯著降低BDL大鼠肝組織膠原沉積，減輕肝纖維化。

3.3 黃芪總皂苷對BDL 大鼠肝組織肝星狀細胞活化的影響

免疫組化染色結果顯示，假手術組肝組織僅血管壁表達α-SMA和Desmin；與假手術組比較，BDL組肝組織α-SMA 和Desmin 陽性表達增多，α-SMA 和Desmin陽性表達主要圍繞著異常增生的膽管細胞（見圖3A）。Western blot 和qPCR 結果顯示，與假手術組比較，BDL組肝組織α-SMA 蛋白表達顯著增加（P<0.01），而ASTs 可顯著減少肝組織α-SMA 蛋白表達（P<0.05）（見圖3B 和3C）。結果提示，ASTs 可顯著抑制BDL 大鼠肝組織肝星狀細胞活化。

圖3 黃芪總皂苷對BDL大鼠肝組織肝星狀細胞活化的影響

3.4 黃芪總皂苷對BDL 大鼠肝組織膽管反應的影響

免疫組化染色結果顯示，假手術組大鼠肝組織中僅固有膽管上可見CK19、CK7、Epcam 和OV6 陽性表達。與假手術組比較，BDL 組大鼠肝組織CK19、CK7、Epcam 和OV6 陽性表達增多，呈團簇狀不規則分布，并向門靜脈和肝實質區域延伸；與BDL 組比較，ASTs組大鼠肝組織CK19、CK7、Epcam 和OV6 陽性表達減少（見圖4A）。qRT-PCR 結果顯示，與假手術組比較，BDL 組大鼠肝組織CK7 的mRNA 表達明顯升高（P<0.01），ASTs 組肝組織CK7 的mRNA 表達較BDL 組顯著降低（P<0.05）（見圖4B）。Western blot結果顯示，與假手術組比較，BDL 組肝組織Epcam 蛋白表達顯著增加，ASTs干預后顯著降低了肝組織Epcam 的蛋白表達（見圖4C）。結果顯示，ASTs 可顯著抑制BDL 大鼠肝組織膽管反應。

圖4 黃芪總皂苷對BDL大鼠肝組織膽管反應的影響

3.5 黃芪總皂苷對BDL 大鼠肝組織賴氨酰氧化酶樣蛋白家族表達的影響

qPT-PCR 結果顯示，與BDL 組比較，ASTs 組肝組織LOX 和LOXL1 的mRNA 表達顯著下降（P<0.05，P<0.01），LOXL4 的mRNA 表達顯著升高（P<0.01）（見圖5A-5E）。LOXL1 的Western blot 結果與qPCR 結果一致（見圖5F）。

圖5 黃芪總皂苷對BDL大鼠肝組織賴氨酰氧化酶樣蛋白家族表達的影響

圖6 黃芪總皂苷對肝祖細胞向膽管上皮細胞表型轉分化的影響

3.6 黃芪總皂苷對肝祖細胞向膽管上皮細胞表型轉分化的影響

qRT-PCR 結果顯示，與對照組相比，丁酸鈉模型組細胞CK19、LOXL1 和LOXL2 的mRNA 表達顯著升高（P<0.01），而ASTs 組細胞CK19、LOXL1 和LOXL2的mRNA 表達顯著降低（P<0.05），提示ASTs可抑制肝祖細胞向膽管上皮細胞表型轉分化，且與下調細胞LOXL1和LOXL2的表達有關。

4 討論

DR 被認為是膽汁性肝纖維化發生、發展的重要起始病理環節。膽汁淤積時，膽管細胞大量增殖，新生的膽管細胞可分泌促纖維化因子，刺激靜止的肝星狀細胞和成纖維細胞活化、遷移與增殖[4]，導致細胞外基質的過度沉積，促進肝纖維化的發生、發展。因此，抑制DR可部分甚至完全逆轉膽汁性肝纖維化[9]。

ASTs 是黃芪的主要有效組分，對心肌、肝、肺、腎間質及腹膜纖維化等發揮一定的抗纖維化作用[10-12]。前期研究發現ASTs 可能是通過抑制DR 發揮改善BDL 誘導的大鼠肝纖維化作用[7]。本研究中證實ASTs可顯著改善BDL 誘導的大鼠肝損傷、減少肝組織膠原沉積，抑制肝星狀細胞活化。進一步研究發現ASTs干預后可顯著降低BDL 大鼠肝組織膽管反應標記物CK19、CK7、Epcam 和OV6 的表達；且對丁酸鈉誘導肝祖細胞向膽管上皮細胞表型轉分化過程中給予ASTs干預發現細胞CK19 表達顯著減少，提示ASTs 可顯著抑制DR，改善膽汁性肝纖維化。

賴氨酰氧化酶（Lysyl oxidase，LOX）家族蛋白又稱蛋白賴氨酸-6-磷酸酶家族蛋白，包括5種蛋白（LOX，LOX 樣蛋白（LOXL1-4）），是一種可催化包括肝臟在內的纖維化器官細胞外基質組成（如膠原和彈性蛋白）的銅依賴酶[13-14]。大量的實驗研究表明，LOX，LOXL1或LOXL2是治療肝纖維化的潛在靶點[15-17]。研究報道，膽道閉鎖嬰兒的肝內膽管大量表達LOXL2[18]。動物實驗研究也發現在Mdr2敲除的纖維化肝組織中，LOXL2 主要表達在膽管反應細胞（即肝祖細胞和新生膽管上皮細胞）和肌成纖維樣細胞上；且給予LOXL2抗體干預即抑制LOXL2的表達可抑制膽管反應、改善肝纖維化[17]。膽管癌患者血清及肝組織中LOXL1 均高表達，且LOXL1 可介導膽管癌細胞的增殖和轉移[19]。這些報道說明LOXL1 和LOXL2 均表達在膽管細胞，且可促進肝纖維化的進展。本研究也發現，BDL誘導的膽汁性肝纖維化肝組織和體外肝祖細胞向膽管上皮細胞表型轉分化中LOXL1 和LOXL2 的表達變化一致，提示LOXL1和LOXL2參與了膽管反應導致的膽汁性肝纖維化的發生發展。而進一步研究發現給予BDL 大鼠ASTs 干預后肝組織LOXL1 的表達顯著降低；體外結果也顯示對丁酸鈉誘導肝祖細胞向膽管上皮細胞表型轉分化模型給予ASTs 干預后細胞LOXL1和LOXL2 的表達顯著降低，提示ASTs 可能通過下調LOXL1的表達抑制膽管反應減輕膽汁性肝纖維化。

本研究表明，ASTs通過抑制膽管反應改善膽汁性肝纖維化，其作用機制可能與下調LOXL1的表達有關。