鐮刀菌YL2 產纖維素酶液體發酵工藝優化

郭建軍，王 通，吳慶華，曾 靜，袁 林

（1.江西省科學院微生物研究所，江西 南昌 330096；2.臨川區連城鄉便民服務中心，江西撫州 344117）

纖維素是由D-葡萄糖基通過 -1,4-苷鍵聯結而成的線狀高分子量碳水化合物[1]，廣泛分布于自然界，如林木[2]、種植業廢棄物[3]和食草動物糞便[4]等都含有大量纖維素，是一種易獲取且廉價的可再生資源。將天然的纖維素物質降解為葡萄糖，進而轉化為生物燃料以及其他高附加值產品[5-6]，對于人類的可持續發展具有重要意義。目前，自然界含纖維素材料的利用大多通過物理或化學手段進行預處理使其結構和性能發生改變[7-9]，如酸或堿浸泡、蒸汽爆破等，但這些處理方式效率較低、能耗較大、污染較嚴重[10]；而若能使用纖維素酶進行降解[11]，既環保又高效，但是成本較高，耗時較長[12]。

纖維素酶是能將纖維素水解為葡萄糖的復合酶的總稱[13]，包括多種內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和 -葡萄糖苷酶[14]，現已廣泛應用于動物飼料、釀造[15]、果汁與蔬菜汁加工[16]、糧食加工、中草藥有效成分提取[17]、紡織[18]、洗滌劑和造紙等生產領域。由于天然纖維素分子鏈內或鏈間存在大量氫鍵，導致其形成了髙結晶度的結構[19]，從而具有較高的機械強度和化學穩定性[20]，難以被分解利用。天然的纖維素酶產生菌產酶活性低[21]、酶系組分不完全是纖維素酶不能被廣泛利用的主要原因[22]。因此，發酵生產高活性的纖維素酶具有重要的現實意義。目前研究較多的產纖維素酶微生物多是真菌，真菌產生的纖維素酶具有產酶量大、酶活性高和酶系組成豐富合理等優點[23]，同時分泌的胞外酶易于分離提純和工業生產放大[24]。筆者以課題組實驗室篩選保存的鐮刀菌（Fusariumsp.）YL2[25]為研究對象，設計Plackett-Burman 試驗，擬篩選出影響纖維素酶發酵的主要影響因子，結合響應面法試驗設計進一步優化響應因子，從而確定最佳的纖維素酶液態發酵工藝參數。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌 種 鐮刀菌（Fusariumsp.）YL2，保藏號為CCTCCM 2014551，由中國典型培養物保藏中心提供。

1.1.2 培養基 （1）基礎種子培養基：葡萄糖 10.0 g/L、蛋白胨5.0 g/L、磷酸二氫鉀1.5 g/L、硫酸鎂0.05 g/L、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）8.0 g/L，自然pH 值，121℃滅菌30 min。（2）初始發酵產酶培養基：微晶纖維素10.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、酵母膏5.0 g/L、硫酸銨 5.0 g/L、磷酸二氫鉀2.0 g/L、硫酸鎂200 mg/L、硫酸錳50 mg/L、硫酸鋅100 mg/L、硫酸銅50 mg/L，自然pH 值，121℃滅菌30 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養方法 在無菌操作條件下將實驗室保藏的鐮刀菌菌株YL2 小心接至PDA 培養基斜面上，30℃培養48 h 進行活化；挑取約1 cm2大小的活化后菌種塊于裝有100 mL 液體種子培養基的250 mL三角瓶內，搖床轉速170 r/min，30℃培養30 h，作為種子液；按照試驗設計，將種子培養液接入發酵培養基進行發酵培養，每組做3 個平行樣。

1.2.2 粗酶液的制備與纖維素酶活力測定 （1）粗酶液的制備。將發酵液在6 000 r/min 條件下離心8 min，取上清液作為粗酶液。（2）羧甲基纖維素酶（CMC）活力測定。取1 支空白管加入一定稀釋比例的粗酶液0.50 mL，沸水浴滅活10 min 作為空白對照；另取3 支樣品管分別加入粗酶液0.50 mL，再加入2.00 mL 經50℃預熱10 min 的10 g/L 的CMC-Na溶液（用pH 值 4.8 的0.05 mol/L 的檸檬酸緩沖液配制），混勻后置于50℃水浴中反應15 min，迅速向各管加入DNS 試劑3.0 mL，沸水浴10 min，冷卻后定容至15 mL 搖勻，以空白管（對照液）調零，測OD540值。（3）微晶纖維素酶（AVI）活力測定。取1 支空白管加入一定稀釋比例的粗酶液0.50 mL，沸水浴滅活10 min 作為空白對照；另取3 支樣品管分別加入粗酶液0.50 mL，加入2.00 mL 經50℃預熱10 min 的 10 g/L 的微晶纖維素懸液（160 r/min 濕磨48 h），混勻后置于50℃水浴中反應15 min，迅速向各管加入DNS 試劑3.0 mL，沸水浴10 min，冷卻后定容至15 mL 搖勻，以空白管（對照液）調零，測OD540值。以上酶活均減去發酵液中的還原糖后計算酶活力。酶活力單位定義為：在50℃，pH 值4.8 的條件下，以1 mL 酶液在1 min 內分解底物生成1 μg葡萄糖的酶量定義為1 個酶活力單位（1 IU/mL）。

纖維素酶活力=[葡萄糖含量（mg）×稀釋倍數]/[反應液中酶液用量（mL）×反應時間（min）]

1.2.3 響應面分析法優化發酵培養工藝 （1）單因素試驗。培養基組分的優化：分別選取碳源、氮源、緩沖鹽、金屬鹽、表面活性劑進行單因素試驗，研究各因素對發酵產纖維素酶的影響；培養條件的優化，在已確定培養組分下培養36 h 后測定酶活力，依次考察培養基起始pH 值、培養溫度、裝液量、搖床轉速、接種量和培養時間對菌株生長狀況及產酶的影響。（2）Plackett-Burman 試驗。在單因素試驗的基礎上，用Design-Expert 8.0 軟件進行Plackett-Burman 試驗設計，以微晶纖維素酶（AVI）作為響應值，篩選出主效應因子。每個因素選2 個水平，中心點試驗3 次，共16 組試驗。（3）最陡爬坡試驗。根據Plackett-Burman 試驗分析篩選出影響微晶纖維素酶活的顯著因子，根據各因素效應值的大小確定變化的步長和上升路徑，以酶活力為響應值設計最陡爬坡試驗，找出顯著因素最大響應區域，確定響應面分析的中心點。（4）響應面法試驗設計。根據最陡爬坡試驗的結果，采用Box-Behnken 法對鐮刀菌YL2 發酵產纖維素酶條件進行響應面分析試驗，包括設計3 因素5 水平共17 個析因試驗和3 個中心試驗，共20 組試驗，每個試驗點進行3 次重復。獲得菌株產纖維素酶的最佳培養組分與條件，經發酵培養的時間曲線驗證優化效果，并確定產酶發酵周期。

1.3 數據處理與統計分析

采用SPSS 軟件進行單因素試驗數據分析和繪圖；PB 試驗、最陡爬坡試驗、中心組合試驗均運用Design Expert 8.0.6 軟件進行設計與分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 碳源對菌株產纖維素酶的影響 采用稻草粉、麩皮、微晶纖維素、糊精、葡萄糖、糖蜜和蔗糖等為碳源進行培養，由圖1A 可知，不同碳源對鐮刀菌YL2 產酶影響的差異較大，微晶纖維素、麩皮和稻草粉對產酶有明顯的促進作用，采用稻草粉作為碳源時效果最好，CMC 活力為35.27 IU/mL，AVI 活力為2.46 IU/mL。由圖1B 可知，隨著稻草粉添加量的不斷增大，酶活力呈現先增大后減小的趨勢。當稻草粉添加量為25 g/L 時，CMC 和AVI 活力達到峰值，分別為36.87 和2.83 IU/mL。因此，初步確定稻草粉的添加量為25 g/L。

圖1 不同碳源對鐮刀菌YL2 產纖維素酶的影響

2.1.2 氮源對菌株產纖維素酶的影響 不同微生物對氮源的需求也有較大的差異。由圖2A 可知，有機氮源比無機氮源更有利于菌體的生長。其中，有機氮源對產酶有明顯的促進作用，采用豆餅粉作為氮源時效果最好，CMC 活力為37.03 IU/mL，AVI活力為2.58 IU/mL。由圖2B 可知，當豆餅粉添加量為25 g/L 時，CMC 和AVI 活力均達到峰值，分別為38.71 和2.87 IU/mL。因此，選擇豆餅粉添加量為25 g/L 比較適合。

圖2 不同氮源對鐮刀菌YL2 產纖維素酶的影響

2.1.3 不同鹽對菌株產纖維素酶的影響 以初始發酵產酶培養基中的緩沖鹽（磷酸二氫鉀2.0 g/L）為基礎，做不同的替代。由圖3A 可知，檸檬酸氫二銨和乙酸銨對產酶有明顯的促進作用，采用檸檬酸氫二銨作為緩沖鹽時產酶效果最好，CMC 活力為39.26 IU/mL，AVI 活力為2.74 IU/mL。從圖3B 可知，添加不同金屬鹽（1.0 g/L）對菌株產酶有正影響：Mg2+＞Zn2+＞Mn2+＞Cu2+＞Fe2+，而Ca2+和Al3+對菌株產酶存在負效應。最佳產酶金屬鹽為MgSO4，發酵液CMC 活力為40.51 IU/mL，AVI 活力為3.02 IU/mL。

圖3 不同鹽對鐮刀菌YL2 產纖維素酶的影響

2.1.4 表面活性劑對菌株產纖維素酶的影響 由圖4A 可知，當表面活性劑為蔗糖酯時，菌體發酵產酶效果最顯著。表面活性劑添加量控制在合適范圍內，將有利于提高產酶能力；當添加量為1.2 g/L 時酶活力達到峰值，CMC 活力為42.46 IU/mL，AVI 活力為3.26 IU/mL。因此，后續試驗采用1.2 g/L 的蔗糖酯作表面活性劑。

圖4 表面活性劑對鐮刀菌YL2 產纖維素酶的影響

2.1.5 發酵條件對菌株產纖維素酶的影響 根據前面優化后的培養基組分，研究初始pH 值對菌株產纖維素酶的影響，結果如圖5A 所示，起始pH 值為6.0 時產酶效果最好，CMC 和AVI 活力最高，分別為43.55 和3.34 IU/mL；當初始pH 值超過6.0 時酶活降低。研究培養溫度對菌株產纖維素酶的影響時發現（圖5B），當培養溫度為30℃時，酶活力最高，CMC 和AVI 活力分別為44.78 和3.44 IU/mL，因此初步確定目的菌產纖維素酶培養溫度為30℃。如圖5C 所示，在500 mL 三角瓶裝100 mL 培養基時能獲得較佳的產酶效果，CMC 活力為45.31 IU/mL，AVI活力為3.48 IU/mL。當搖床轉速為225 r/min 時，酶活力均達到峰值，CMC 和AVI 活力分別為46.75 和3.59 IU/mL（圖5D）。考察接種量對菌株產纖維素酶的影響發現（圖5E），當接種量為3%（V/V）時，酶活力均達到峰值，CMC 和AVI 活力分別為46.97和3.61 IU/mL。由圖5F 可知，培養時間為6 d 時，酶活力達到頂峰，CMC 和AVI 活力分別為47.65 和3.66 IU/mL，當培養時間超過7 d 時，酶活力呈現緩慢下降趨勢。

圖5 不同培養條件對鐮刀菌YL2 產纖維素酶的影響

2.2 Plackett-Burman 試驗結果與分析

根據前期單因素試驗結果，選取10 個對菌株發酵培養產纖維素酶影響較大的因素，通過Design Expert 8.0 軟件進行N=12 的Plackett-Burman 試驗設計，每個因素選高（1）、低（-1）2 個水平，每組試驗設置3 個平行，考察它們對產纖維素酶的影響，篩選出顯著性影響因子。Plackett-Burman 試驗設計的因素和結果如表1 所示。

表1 Plackett-Burman 設計及結果分析

利用Design Expert 8.0 軟件對表1 中的試驗數據進行方差分析，結果如表2 所示，主效應“Prob ＞F”等于0.003 2 ＜0.05，表明該模型與試驗值擬合良好。碳源（稻草粉）、表面活性劑（蔗糖酯）和初始pH 值 3 個因子滿足“Prob ＞F”小于0.05，說明它們對產纖維素酶酶活有顯著影響，可考慮作為主要因素進一步做響應面試驗；其他因素的取值則根據各因素效應的正負，檸檬酸氫二銨、裝液量和培養溫度對產纖維素酶酶活的影響呈現負效應均取較低值，分別為2.0 g/L、80 mL/500mL、30℃；而豆餅粉、硫酸鎂、搖床轉速和接種量的影響呈現正效應均取較高值，分別為25 g/L、1.0 g/L、225 r/min、3%。

表2 Plackett-Burman 試驗結果的方差分析

2.3 最陡爬坡試驗結果與分析

根據這3 個因素效應大小的比例設定它們的變化方向和步長，其他各因素分別取各自的水平進行試驗，確定中心點。最陡爬坡的試驗設計及結果見表3。隨著碳源（稻草粉）質量濃度、表面活性劑（蔗糖酯）質量濃度和培養時間3 個主要影響因素的不同變化，酶活力的變化趨勢呈現先上升后下降的趨勢，其中第5 組發酵培養條件對應的微晶纖維素酶（AVI）活力達到了最大值，達到5.15 IU/mL，相應變量接近最大響應區域，所以選取第5 組條件即稻草粉30.0 g/L、蔗糖酯1.4 g/L 和初始pH 值6.3 為中心點進行響應面的分析。

表3 最陡爬坡試驗設計與結果

2.4 中心組合試驗結果與分析

以最陡爬坡試驗得到的中心點為基點，進行產纖維素酶活優化的中心組合設計，試驗設計和結果見表4。利用Design-Expert 8.0 軟件對中心組合試驗數據回歸過程進行數據分析，建立二次響應面回歸模型，進而尋求最優響應因子水平。擬合得二次多項式方程：Y=6.21 ＋0.465X1＋0.479X2＋0.379X3＋

表4 中心組合試驗設計及結果

由表5 可知，回歸模型F值為53.71，P＜0.001，說明該試驗模型可以擬合試驗數據；模型的決定系數R2為0.943，校正系數R2adj為0.894，說明該模型能夠解釋89.4%的試驗數據變化，模型擬合度好；失擬項的F值為0.084，P=0.985 5 ＞0.05，說明失擬項不顯著，即回歸模型顯著，該試驗模型可信度高，可用來分析及預測最大值。

表5 回歸模型的方差分析

由圖6 可知，在一定范圍內隨著稻草粉濃度、蔗糖酯濃度和初始pH 值的增加，纖維素酶活力隨之增加，當達到最大值后，隨著各因素濃度的繼續增加，纖維素酶活力逐漸降低；各因素之間不是簡單的線性關系，這三者之間相互有交互作用，共同影響著纖維素酶的生物合成。這說明只有在各因素濃度適宜的條件下，纖維素酶活力才會達到最大值。

圖6 稻草粉、蔗糖酯和初始pH 值對鐮刀菌YL2 產纖維素酶的影響的響應曲面

基于上述模型，通過Design Expert 13.0 軟件對回歸方程求極值，得到此模型的最大值，X1=0.634，X2=0.531，X3=0.558，對應稻草粉、蔗糖酯的添加量分別為31.585、1.453 g/L，初始pH 值為6.412，此條件下AVI 酶活為6.75 IU/mL。

經過修正，選擇稻草粉添加量31.6 g/L、蔗糖酯添加量1.45 g/L、初始pH 值6.4，進行3 次平行試驗，獲得AVI 平均活力為6.72 IU/mL、CMC 平均活力84.36 IU/mL，與模型預測值接近，說明該模型能較好地反映鐮刀菌YL2 發酵合成纖維素酶的實際情況。

3 結論與討論

試驗優化了鐮刀菌YL2 液體發酵生產纖維素酶的培養基，對比分析了稻草粉、麩皮、微晶纖維素及糊精等碳源，尿素、硫酸銨、豆餅粉及蛋白胨等氮源，檸檬酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽及不同金屬鹽等鹽溶液對產酶的影響，并探討了添加表面活性劑對鐮刀菌YL2 液體發酵生產纖維素酶的影響，結果顯示，碳源以稻草粉、氮源以豆餅粉、緩沖鹽為以檸檬酸氫二銨、金屬鹽以硫酸鎂為最適宜，表面活性劑以1.2 g/L 蔗糖酯最有利于菌株產酶。

在單因素試驗的基礎上，采用Plackett-Burman試驗設計及響應面分析，利用Design-Expert 軟件，對纖維素酶高產菌鐮刀菌YL2 進行發酵工藝條件的優化。通過Plackett-Burman 試驗篩選出影響產酶的3 個主要因素，即稻草粉（碳源）添加量、蔗糖酯（表面活性劑）添加量和初始pH 值。在此基礎上通過最陡爬坡試驗和響應面分析法進行回歸分析，結果表明，當稻草粉添加量為31.585 g/L、蔗糖酯添加量為1.453 g/L、初始pH 值為6.412 時，酶活力最高，此條件下AVI 活力預測值為6.75 IU/mL。經過修正，最佳培養基配方為稻草粉31.6 g/L、豆餅粉25 g/L、檸檬酸氫二銨2.0 g/L、硫酸鎂1.0 g/L、蔗糖酯1.45 g/L，在發酵培養基初始pH 值6.4、500 mL 的三角瓶中裝液量為80 mL、搖床轉速225 r/min、接種量3%、培養溫度30℃的最優產酶條件下培養6 d，微晶纖維素酶（AVI）和羧甲基纖維素酶（CMC）酶活為分別6.72 和84.36 IU/mL。