不同消毒措施克服設施蔬菜連作障礙的效果

肖 亮，鄒湘香，劉 敏，成志軍，陳 武，劉文祥

（1.湖南農業大學，湖南 長沙 410128；2.湖南中煙工業有限責任公司原料保障中心，湖南長沙 410000；3.湖南省農業信息與工程研究所，湖南 長沙 410125）

湖南是我國重要的商品蔬菜生產基地之一，2019 年蔬菜種植面積超過131.32 萬hm2，其中包括15.0 萬hm2設施蔬菜，總產值達1 322.65 億元[1]。在蔬菜生產中，因復種指數高、輪作困難、肥料和農藥使用量大而導致的土壤理化性質惡化、土傳病害高發、作物嚴重減產和品質下降等土壤連作障礙問題非常突出，嚴重影響了蔬菜的產量、品質和安全性[2-3]。采用客土換土、土壤化學熏蒸消毒、灌溉洗鹽等措施雖然可以修復連作障礙，但存在成本高昂、不環保和操作流程復雜等問題[4-6]。

國家“化肥農藥雙減”行動，以及《“十三五”生物產業發展規劃》、《農業綠色發展技術導則（2018—2030 年）》和《湖南省“十三五”科技創新規劃》等系列文件明確了對突破土壤連作障礙及病蟲害綠色防控關鍵技術的要求。為了開發適宜湖南設施蔬菜大棚的土壤綠色消毒技術，筆者以辣椒品種茄門為試材，在益陽市欣博農業有限公司連作障礙嚴重的設施大棚進行了多種消毒處理的比較試驗，研究了不同消毒措施對土壤微生物生態、土壤微生物功能及主要土傳病害（辣椒白絹病、疫霉、根結線蟲和青枯病）病原菌豐度以及病害發生情況的影響，以期為解決設施蔬菜連作障礙提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試辣椒品種：茄門，由湖南省蔬菜研究所提供。于2021 年7 月18 日采用常規方法播種育苗后備用。

供試大棚：益陽市欣博農業有限公司連作障礙嚴重的設施大棚。該大棚已經連續種植辣椒6 a，2021 年辣椒青枯病、辣椒疫病、辣椒白絹病和根結線蟲等典型根莖病害的綜合發病率達85%以上，幾乎絕收。

供試藥劑與有機物料及其使用方法：棉隆、威百畝、用于RSD 處理的牛糞與稻殼、氰胺化鈣均從當地農資市場購買。棉隆的施用與土壤處理參考行業標準NY3127—2017[7]，威百畝的土壤消毒參考團體標準T/CCPIA 055—2020[8]，RSD 處理參考王光飛等[9]的方法，氰胺化鈣土壤處理參考陳利達等[10]的方法。

1.2 試驗方法

土壤消毒措施共設5 個處理，分別為：T1，棉隆處理，撒施棉隆40 g/m2后翻耕，同時每小區施商品有機肥60 kg 后覆膜；T2，威百畝處理，每小區噴施威百畝30 倍稀釋液5 L，施商品有機肥60 kg后覆膜；T3，氰氨化鈣處理，每小區施牛糞80 kg、谷殼80 kg 和氰氨化鈣12 kg，灌水至飽和后覆膜；T4，RSD 處理，每小區施牛糞100 kg、谷殼100 kg，灌水到飽和后覆膜；T5（CK）：每小區施商品有機肥60 kg，灌水至飽和，不覆膜。每個處理3 次重復，一共15 個小區，各小區面積均為80 m2，隨機區組排列。土壤消毒處理始于2021 年7 月24 日，于8 月15 日完成土壤消毒后用旋耕機松土透氣，然后整地。于9 月1 日按常規方法定植辣椒并進行常規管理。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 辣椒發病情況 于2021 年10 月15 日和10月29 日采用常規方法調查統計各處理的辣椒青枯病、疫病、白絹病和根結線蟲等病害發病情況，并計算病情指數、發病率和防治效果。

1.3.2 辣椒農藝性狀 采用常規方法調查統計各處理辣椒的株高、莖粗和產量。

1.3.3 土壤樣品采集和酶活性測定 消毒處理結束后按五點式取樣法采集0～10 cm 土層土壤，剔除石塊和作物殘體后混勻，置于自封袋帶回實驗室。一部分采用試劑盒法測定土壤脲酶、 -葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶的活性。另一部分經冷凍干燥后于-80℃冰箱保存備用。

1.3.4 土壤微生物群落結構和多樣性分析 微生物群落結構和多樣性分析時稱取0.5 g 冷凍干燥后的土壤樣品，用DNA 提取試劑盒（FastDNA SPIN Kit for Soil，MP）提取土壤總DNA。土壤總DNA 經Miseq高通量測序，分別對細菌（16S rRNA）和真菌（ITS保守區域）進行微生物群落結構和多樣性分析。利用QIIME（V 1.9.1）軟件過濾低質量序列并去除嵌合體。利用Uparse（V7.0）軟件對樣品中的有效序列以97%的一致性聚類成為OTUs，采用Mothur方法與SSUrRNA 數據庫進行物種注釋分析。使用QIIME（V 1.9.1）軟件計算good-coverage、Chao1、Shannon、Simpson 指數等指標，并進行network 分析，以挖掘樣品之間的差異。樣品總DNA 提取、PCR 擴增/建庫和測序等均由廣東美格基因科技有限公司完成。真菌ITS2 區PCR 擴增引物為ITS2-F（5′-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3′）、ITS4-R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。細菌16S rRNA V4～V5 區PCR 擴 增 引 物 為515 F（5′-GTGCCAGCMGCCG CGGTAA-3′）、907F（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）。

2 結果與分析

2.1 不同消毒處理對辣椒病害防效的影響

于10 月15 日進行第1 次病害調查，發現有輕微辣椒疫病；于10 月29 日進行第2 次病害調查，CK 處理的辣椒疫病發病嚴重，可能由于氣溫不高，各處理均只有辣椒疫病發生，未觀察到辣椒青枯病、白絹病和根結線蟲病株。由表1 可知，辣椒疫病病情指數以CK 處理最高且顯著高于其他處理，其次是T4 處理，其病情指數顯著高于T1、T2 處理；各消毒處理可顯著降低辣椒疫病的發生，防治效果由高到低依次為T2 ＞T1 ＞T3 ＞T4，防治效果分別為84.68%、82.89%、78.19%和67.68%。

表1 各消毒處理的辣椒疫霉病發病情況比較

2.2 不同消毒處理對辣椒農藝性狀的影響

從表2 可知，各消毒處理的株高和莖粗均無明顯差異，但產量差異較大，4 個消毒處理的辣椒產量均超過了1 200 kg/667m2，以T1 處理的產量最高，達1 364 kg/667m2，而CK 處理因辣椒疫病發生嚴重，產量僅為890 kg/667m2。由此可見，土壤消毒處理可顯著降低辣椒疫病的發生，從而明顯緩解因病害嚴重發生而導致的減產。

表2 不同消毒處理對辣椒農藝性狀的影響

2.3 不同消毒處理對連作土壤酶活性的影響

土壤脲酶、 -葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶是衡量土壤物質轉化能力的重要酶。從表3 可知，各處理的 -葡萄糖苷酶、蔗糖酶和脲酶活性無顯著差異，酸性磷酸酶活性差異顯著，以CK 處理的最高，且顯著高于T1 和T2 處理，但與T3 和T4 處理差異不顯著。這說明不同消毒處理對土壤酶活的影響不一致，各消毒處理對 -葡萄糖酶、蔗糖酶和脲酶活性的影響不明顯，但棉隆和威百畝處理（T1 和T2）可顯著降低土壤中酸性磷酸酶的活性。

表3 不同消毒處理對土壤酶活性的影響 (U/g)

2.4 威百畝消毒處理對連作土壤微生物多樣性的影響

前期病害調查結果表明，威百畝消毒處理后的辣椒疫霉發病率及病情指數最低，相對防效最高。因此選取該處理與對照的土壤進行高通量測序，以比較兩者之間細菌多樣性的異同。經序列拼接并過濾低質量數據，高通量測序總共獲得851 253 條有效的細菌reads。由圖1 所示，隨著測序數據量的增加，新OTU（新物種）出現的速率趨緩，說明測序量接近飽和。

圖1 各組樣品稀釋度曲線

由表4 可知，威百畝處理土壤樣品的reads 數在43 101～64 618 條之間，OTUs 數為925～2 734 個。SS1 和SS2 這2 組威百畝處理的土壤樣品reads 數均大于CK 處理土壤樣品，且威百畝消毒處理后土壤樣品的OTUs 數均少于2 組CK 樣品，說明威百畝處理降低了土壤細菌種群結構的多樣性，但由于大量土壤微生物被殺滅，土壤微生物之間的互作網絡被破壞，造成大量生態位點被存活的細菌所占據并大量繁殖，從而導致其豐度大幅增加（reads 數增加）。

表4 各處理土壤樣品的OTUs 和reads 數

由圖2 可知，威百畝消毒處理可降低土壤中細菌的多樣性，從而導致物種豐富度下降（圖2 左），且消毒處理和CK 處理之間的差異達極顯著水平（圖2 右）。

圖2 細菌Alpha 多樣性指數（左）及指數間差異檢驗結果（右）

對威百畝消毒處理后的細菌Beta 多樣性進行比較分析的結果發現，結果如圖3 所示，威百畝消毒處理土壤樣品之間的物種組成相似，它們在PCA 圖中聚集在一起，CK 處理各土壤樣品間的物種組成相似度也很高（圖3 左）；PCoA 分析也觀察到了類似的現象，威百畝土壤消毒處理與CK 處理的細菌群落相似性在組內相似性高，但組間相似性低（圖3右）。由此表明，威百畝處理重塑了土壤細菌種群結構及其多樣性。

圖3 細菌Beta 多樣性PCA（左）及PCoA 分析（右）結果

選取威百畝消毒處理土壤中在各分類水平上平均豐度排名前15 的物種進行三元相圖分析，結果見圖4，威百畝消毒處理土壤中的優勢細菌種群分別是硬壁菌門（Firmicutes）的芽孢桿菌目（Bacillales）（OTU910、OTU92、OTU7、OTU5、OTU4）、放 線菌門（Actinobacteria）的鏈霉菌屬（Streptomyces）（OTU3）、變形菌門（Proteobacteria）的不動桿菌屬（Acinetobacter）（OTU2）和酸桿菌門（Acidobacteria）的嗜酸桿菌綱（acidobacteriia）（OTU1）等。其中芽孢桿菌目和鏈霉菌屬都可分泌種類豐富的抑菌活性物質及促生長物質，是公認的有益微生物；而CK 土壤中優勢細菌種群主要是綠彎菌門（Chloroflexi）的纖線桿菌目（Ktedonobacterales）（OTU19）、擬桿菌綱（Bacteroidia）的Uncultured（OTU28）和奇古菌門（Thaumarchaeota） 的亞硝基菌綱（Nitrososphaeria）（OTU8）等。上述分析結果表明，芽孢桿菌和鏈霉菌等類群是消毒后土壤中的優勢與核心細菌種群，原因可能是土壤中的芽孢桿菌和鏈霉菌可分別產生芽孢和孢子等休眠體，其對土壤消毒劑的耐受能力強，不易被殺滅。

圖4 土壤消毒處理與CK 土壤中核心細菌物種的三元相圖分析

Beta 多樣性的聚類分析結果（圖5）表明，以鏈霉菌屬（OTU3）和芽孢桿菌屬（OTU4、OTU5、OTU7）為代表的有益微生物的種群豐度在消毒處理前極低，但消毒處理后其相對豐度大幅提高，在SS1 組4 個樣品中，鏈霉菌屬的相對豐度比CK1組增加了43.18 倍，芽孢桿菌屬的相對豐度增加了22.63 倍；在SS2 組4 個樣品中，鏈霉菌屬的相對豐度比CK2 組增加了1.23 倍，芽孢桿菌屬的相對豐度增加了5.92 倍；也有大量微生物在威百畝消毒處理后相對豐度大幅下降，如酸桿菌門（OTU1）、Unassigned 和uncultured 等細菌類群的豐度分別比CK 下降了215.1%、16.2%和71.31%。

圖5 2 組樣品中細菌OTUS 的Beta 多樣性聚類分析

選擇各處理中豐度排名靠前的30 個OTUs 進行物種豐度聚類分析，結果見圖6，相同處理的不同樣品間細菌群落組成相似度高，但處理間的相似度低，尤其是威百畝消毒處理和CK 之間差異顯著，這與三元相圖和聚類分析的結果一致。

圖6 不同消毒處理連作土壤的物種豐度分析

土壤細菌種群結構在4 組處理間存在較大差異，他們共有的OTU 數有1 081 個；CK1、CK2、SS1和SS2 獨有的OTU 數分別有1 044、2 168、224 和380 個；另外，每2 組樣品或3 組樣品間還有數量不等的共有OTU（見圖7）。以上分析結果同樣說明了威百畝處理（T2）重塑了土壤細菌的種群結構。

圖7 不同消毒處理連作土壤的細菌種群結構venn 圖

土壤細菌種群結構和豐度的巨大差異必然導致微生物種群的功能屬性發生相應的變化。基于16S rRNA 高通量測序的COG 功能預測分析結果（圖8）表明，威百畝消毒處理和CK 的細菌群落分布特征差異明顯，處理間樣品高度聚集，而不同處理的離散度高；組間通路差異分析結果（圖9）表明，威百畝消毒處理在新陳代謝（metabolism）和poorly characterized 這2 大類通路上明顯優于CK，但在細胞過程和信號傳導（cellular processes and signaling）通路上弱于CK，2 組處理在信息處理和存儲（information storage and processing）通路上基本相當。

圖8 基于16S rRNA 功能預測的PCA 分析

圖9 基于16S rRNA 功能預測的組間通路差異分析

3 討 論

近年來，設施蔬菜生產過程中根莖病害發生嚴重、土壤質量惡化和土壤鹽漬化等連作障礙問題越來越嚴重，制約了蔬菜產業的進一步發展壯大[11-12]。雖然造成連作障礙的原因比較復雜，但在生產中最常用且有效的方法是進行土壤消毒。目前，土壤消毒方法主要有物理消毒（火焰、蒸汽、日光、高溫、低溫等）、化學消毒（使用各類熏蒸劑）和生物滅菌（強還原）[13-18]。通過土壤消毒可以減少土壤中的病原菌、害蟲，從而顯著提高設施蔬菜的產量和品質。筆者的試驗結果表明，各消毒處理均可顯著降低辣椒疫病的發生，防治效果由高到低依次為T2（威百畝處理）＞T1（棉隆處理）＞T3（氰氨化鈣處理）＞T4（RSD 處理），防治效果分別為84.68%、82.89%、78.19%和67.68%；各消毒處理的株高和莖粗均無明顯差異，但4 個消毒處理的辣椒產量均超過1 200 kg/667m2，以T1 的產量最高，達1 364 kg/667m2，而CK 因辣椒疫病發生嚴重，產量僅為890 kg/667m2；各消毒處理對 -葡萄糖酶、蔗糖酶和脲酶活性的影響不明顯，但棉隆和威百畝處理（T1和T2）可顯著降低酸性磷酸酶的活性；威百畝處理（T2）可重塑土壤微生物的種群結構，尤其是鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬等有益微生物種群的豐度明顯提高，有利于維持健康的土壤微生態環境。