基于指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的干姜質(zhì)量標(biāo)志物預(yù)測分析

摘要：基于指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析預(yù)測干姜中潛在的質(zhì)量標(biāo)志物，為干姜的質(zhì)量控制與評價提供參考。采用超高效液相色譜法建立干姜指紋圖譜，確認(rèn)共有峰并進(jìn)行指認(rèn)，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建活性成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖預(yù)測干姜質(zhì)量標(biāo)志物，再利用分子對接方法驗(yàn)證干姜質(zhì)量標(biāo)志物的生物活性。建立了10批干姜指紋圖譜，確定共有峰17個，并指認(rèn)其5個共有成分，分別為6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚及8-姜烯酚；通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對關(guān)鍵成分靶點(diǎn)的分析結(jié)果表明，此5種成分可作用于35個核心靶點(diǎn)，20條關(guān)鍵通路發(fā)揮抗癌、抗炎、抗氧化作用；分子對接結(jié)果表明，此5種成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合能力均較強(qiáng)，具有較好的生物活性，初步預(yù)測6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚和8-姜烯酚可作為干姜的質(zhì)量標(biāo)志物。通過指紋圖譜結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析預(yù)測干姜的質(zhì)量標(biāo)志物，為干姜的質(zhì)量控制和藥效作用機(jī)制研究提供了參考。

關(guān)鍵詞：干姜；質(zhì)量標(biāo)志物；指紋圖譜；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-4026（2023）04-0035-07

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)志碼（OSID）：

Forecast analysis of the quality markers of Zingiberis Rhizoma based on fingerprints and network pharmacology

FU Mengya^1，2，AO Huihao^1，2，BU Chao^1，2，PENG Tangyi¹，WU Deling²，HAN Yanquan^1*，HONG Yan^2*

（1. Grade Three-Level Laboratory of Traditional Chinese Medicine Preparation/Anhui Engineering Technology Research Center of Modernized Pharmaceutics， The First Affiliated Hospital of Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Hefei 230031， China；2. Anhui Key Laboratory of Compound Chinese Medicine of Anhui Province，Anhui University of Traditional Chinese Medicine， Hefei 230012， China）

Abstract∶To analyze and predict the potential quality markers （Q-Marker） in Zingiberis Rhizoma based on fingerprints and network pharmacological methods. The fingerprints of 10 batches of Zingiberis Rhizoma slices were established by ultra performance liquid chromatography and the common peaks were identified; then the network diagram of active ingredient target pathway was constructed by network pharmacological method to predict the quality markers of Zingiberis Rhizoma; and the bioactivity of Q-Marker was verified by molecular docking method. Fingerprints of 10 batches of dried ginger were established， and 17 peaks were identified. Five chromatographic peaks were identified by the reference substances of Zingiberis Rhizoma， which were 6-gingerol， 8-gingerol， 10-gingerol， 6-shogaol， and 8-shogaol. The results of network pharmacology showed that these 5 components can act on 35 core targets， and 20 key pathways which play an anti-cancer， anti-inflammatory， and antioxidant role. Molecular docking showed that these 5 components had strong binding capacity with core targets and had good biological activity. It was preliminarily predicted that these five substances could be used as quality markers of dried ginger. Predicting the quality markers of Zingiberis Rhizoma by fingerprint and network pharmacology analysis will provide a reference for the quality control of Zingiberis Rhizoma and for further study on its pharmacodynamic mechanism.

Key words∶Zingiberis Rhizoma; quality markers; fingerprint; network pharmacology; molecular docking

干姜為姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖，歸心、胃、肺、脾經(jīng)，主要有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲等功效。化學(xué)成分主要包括姜辣素類、揮發(fā)油類和二苯基庚烷類等化合物，具有抗氧化、保護(hù)肝臟、抗炎和保護(hù)脾胃等藥理作用，臨床多用于消炎、鎮(zhèn)痛和止嘔等癥^［1］。

劉昌孝院士^［2］首次提出中藥質(zhì)量標(biāo)志物（quality marker，Q-Marker）的概念，其主要內(nèi)容是以特有性、可測性、溯源與傳遞性、有效性為原則，以中藥安全性和有效性的標(biāo)志性物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制研究^［3］，現(xiàn)已應(yīng)用于黃芩、白術(shù)^［4-5］等中藥質(zhì)量研究中，為中藥質(zhì)量控制研究提供了新思路。本研究采用超高效液相色譜法（ultra performance liquid chromatography，UPLC）建立干姜化學(xué)成分的指紋圖譜，對5個姜辣素成分進(jìn)行指認(rèn)，進(jìn)一步運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行有效性分析，發(fā)現(xiàn)潛在的Q-Marker，并利用分子對接進(jìn)行生物活性驗(yàn)證，為建立干姜質(zhì)量控制及作用機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

Waters Acquity H-Class型超高效液相色譜儀（美國Waters公司），KQ-300DE超聲儀（江蘇昆山超聲儀器有限公司），DZF-6050真空干燥箱（上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠），HFB-200高速中藥粉碎機(jī)（吉首市中州中藥機(jī)械廠），炒藥設(shè)備（自制）。

1.2 試藥

6-姜酚（純度≥98.0%，23513-146）、8-姜酚（純度≥98.0%，23513-088）、10-姜酚（純度≥98.0%，23513-157）、6-姜烯酚（純度≥98.0%，12121803）和8-姜烯酚（純度≥98.0%，191204-031）對照品（成都德思特生物技術(shù)有限公司），0.22 μm微孔濾膜（上海陸納生物科技有限公司），色譜級乙腈（美國TEDIA公司）；蒸餾水（北京屈臣氏蒸餾水有限公司）；乙醇、磷酸等試劑為分析純。

1.3 藥材

10批干姜飲片產(chǎn)地分別為四川、遼寧、浙江、云南、浙江、黑龍江和安徽等地，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院韓燕全主任中藥師鑒定為姜科植物姜 Zingiber officinale Rosc.的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件

Waters Acquity UPLC BEH C₁₈色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；乙腈（A）-水溶液（B）作為流動相，梯度洗脫（0～3 min，97%～80% B；3～4 min，80%～65% B；4～5 min，65%～60% B；5～6 min，60%～54% B；6～7 min，54%～45% B；7～14 min，45%～45% B；14～18 min，45%～10% B；18～23 min，10%～10% B；23～26 min，10%～0 B；26～28 min，0～97% B；28～30 min，97%～97% B）；檢測波長為280 nm；流速為0.25 mL/min；進(jìn)樣量為2 μL，柱溫：30 ℃。

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱取10批不同產(chǎn)地干姜粉末0.25 g，分別標(biāo)記放置于10 mL容量瓶中，滴入甲醇至容量瓶刻度，利用超聲（功率150 W，40 kHz）促使混合均勻，靜置放冷，再次加入甲醇補(bǔ)足，搖勻，0.22 μm濾膜過濾，待用。

2.1.3 對照品溶液的制備

精密稱定6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚和8-姜烯酚對照品，加甲醇定容，得質(zhì)量濃度為6-姜酚0.039 30 mg/mL、8-姜酚0.017 60 mg/mL、10-姜酚0.013 95 mg/mL、6-姜烯酚0.005 44 mg/mL、8-姜烯酚0.003 20 mg/mL的混合對照品溶液。

2.1.4 方法學(xué)考察

（1）精密度實(shí)驗(yàn)

將2.1.2項(xiàng)下制備的干姜供試品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004版A）軟件進(jìn)行評價，結(jié)果表明連續(xù)6次供試品進(jìn)樣，其相似度均高于0.99，表示此方法精密度較好。

（2）重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

同2.1.2項(xiàng)下方法取干姜供試品溶液，分別制備6份待用，依照2.1.1項(xiàng)色譜條件依次進(jìn)樣6次，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004版A）軟件評價，結(jié)果顯示相似度均高于0.98，說明干姜樣品重復(fù)性良好。

（3）穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

將2.1.2項(xiàng)下制備的干姜供試品溶液，依次于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，分別檢測、記錄并保存色譜圖，以中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004版A）評價，相似度結(jié)果均高于0.98，表明樣品的穩(wěn)定性良好。

（4）指紋圖譜的建立及相似度評價

取10批干姜，依照2.1.2項(xiàng)下方法準(zhǔn)備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)色譜條件方法進(jìn)行測定，結(jié)果依次導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004版A）進(jìn)行處理，通過比較10批干姜飲片UPLC色譜圖檢測結(jié)果，確定17個共有峰，指紋圖譜結(jié)果見圖1。以UPLC圖譜共有模式為對照，對10批樣品進(jìn)行相似度評價，10批次干姜與對照指紋圖譜相似度均大于0.98，結(jié)果見表1。

（5）共有峰指認(rèn)及相對保留時間和相對峰面積

取干姜供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下條件依次進(jìn)樣，將指紋圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004版A），進(jìn)行色譜峰保留時間以及色譜行為的比較，確認(rèn)17個共有峰，采用對照品對比方式指認(rèn)了其中5個色譜峰，分別為6號色譜峰（6-姜酚）、7號色譜峰（8-姜酚）、8號色譜峰（6-姜烯酚）、11號色譜峰（10-姜酚）、12號色譜峰（8-姜烯酚），結(jié)果見圖2。結(jié)果表明各相對保留時間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于1.5，符合指紋圖譜規(guī)定。

2.2 干姜網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)Q-Marker預(yù)測分析

2.2.1 活性成分確定

通過2.1.1項(xiàng)下方法對干姜進(jìn)行定性鑒別，選擇6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚及8-姜烯酚5個特征成分作為候選化合物。利用PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索化合物，并下載其2D結(jié)構(gòu)式用于靶點(diǎn)預(yù)測。

2.2.2 數(shù)據(jù)庫與軟件

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php），PubChem數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），SwissTargetPrediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/ ），Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/），STRING數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/），DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf. gov/ tools.jsp），Cytoscape 3.9.1軟件。

2.2.3 中藥靶點(diǎn)預(yù)測

由TCMSP數(shù)據(jù)庫、PubChem數(shù)據(jù)庫、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫查找5個成分作用靶點(diǎn)，且使用TCMSP藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫時以藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18作為臨床篩選藥物標(biāo)準(zhǔn)^［6］；通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/）將預(yù)測出靶點(diǎn)名轉(zhuǎn)換為基因名，將各數(shù)據(jù)庫篩選靶點(diǎn)合并刪除重復(fù)值，結(jié)果顯示得到相關(guān)成分靶點(diǎn)261種。

2.2.4 蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析

將261種相關(guān)成分靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫，“Homo spanies”作為物種篩選條件，置信度蛋白交互參數(shù)評分值gt;0.9，保存為tsv格式文件；將得到的tsv文件導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件進(jìn)行拓?fù)涮卣鞣治觯奜SID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1。將連接度（degree）大于2倍中位數(shù)值作為篩選條件，結(jié)果顯示共得到35個核心靶點(diǎn)，排名前10靶點(diǎn)基因分別為SRC、STAT3、PIK3CA、HSP90AA1、TP53、PTK2、MAPK3、JAK2、LYN、PLCG1，可能是干姜關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.2.5 核心靶點(diǎn)GO功能富集與KEGG信號通路分析

（1）基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析：將35個核心靶點(diǎn)通過使用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，篩選條件設(shè)置為Plt;0.05、R_FDRlt;0.05，統(tǒng)計顯示共獲得174個條目。123個生物過程（biological process，BP）主要富集在信號傳導(dǎo)、肽基酪氨酸磷酸化、凋亡過程的負(fù)調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化等；20個細(xì)胞組成（cellular component，CC）富集于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核、核質(zhì)等區(qū)域；31個分子功能（molecular function，MF）主要富集在蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、蛋白質(zhì)結(jié)合等，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2。

（2）京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析：將35個核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析。結(jié)果顯示共得到137條信號通路，通路主要包含癌癥通路、前列腺癌、ErbB信號通路、PI3K-Akt信號通路等，其中前20條通路見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖3。

2.2.6 成分-靶點(diǎn)-通路分析

將上述得到的5個活性成分、35個關(guān)鍵靶點(diǎn)、20條通路導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1軟件進(jìn)行分析，見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖4。以成分、靶點(diǎn)和信號通路的degree為參考，結(jié)果顯示6-姜酚（degree值=14）相較于其他4個化合物有較高degree，表明6-姜酚可能是干姜的重要活性成分，PIK3CA、MAPK3、AKT3、SRC和HSP90AA1可能是干姜活性成分作用于腫瘤、神經(jīng)活性配體等信號通路潛在的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)。

2.3 分子對接分析

以6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚及8-姜烯酚為配體，核心靶點(diǎn)蛋白SRC、HSP90AA1和PIK3CA為受體，將獲得5個關(guān)鍵成分分別與核心靶點(diǎn)蛋白SRC、HSP90AA1和PIK3CA進(jìn)行分子對接，見表2。成分與靶點(diǎn)結(jié)合力較好是以對接結(jié)合能小于－20.9 kJ/mol為依據(jù)^［7］。結(jié)果表明，HSP90AA1與6-姜酚的1個氨基酸殘基（GLN-23）相互作用（圖3（a）） 、與8-姜酚的4個氨基酸殘基（ASN-51、PHE-138、GLY-135、50Q-1225）有相互作用（圖3（b））；PIK3CA與10-姜酚的2個氨基酸殘基（TYR-63、TYR-26）相互作用（圖3（c））。

3 討論與結(jié)論

中藥成分復(fù)雜，具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，因此要從多方面研究其作用機(jī)制^［8］。利用現(xiàn)代分析測試技術(shù)的指紋圖譜，可以較好體現(xiàn)中藥有效成分的復(fù)雜性與相關(guān)性；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過對成分靶點(diǎn)進(jìn)行分析并篩選其關(guān)鍵靶點(diǎn)及通路，能夠?yàn)楦嗅槍π缘闹兴幯芯刻峁┮罁?jù)；Q-Marker的提出，明確了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和控制方法，可以解決在中藥有效性基礎(chǔ)上中藥質(zhì)量評估問題^［9-11］。

本研究通過對干姜化學(xué)成分進(jìn)行表征，利用超高效液相色譜法建立干姜飲片指紋圖譜，選擇干姜主要成分6-姜酚作為參照峰。對10批干姜飲片進(jìn)行相似度分析結(jié)果顯示，共檢出17個共有峰，并對其中5個色譜峰（6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚和8-姜烯酚）進(jìn)行指認(rèn)，且10批干姜飲片指紋圖譜相似度均大于0.98（中位數(shù)），表明不同批次干姜飲片化學(xué)成分具有一致性，可作為干姜飲片質(zhì)量控制鑒別依據(jù)。

利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對指認(rèn)出的5個干姜成分進(jìn)行有效成分篩選與靶點(diǎn)預(yù)測，通過Cytoscape 3.9.1軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)中靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)涮卣鞣治觯詃egree值為參考，發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)非受體型酪氨酸激酶SRC（degree值=98）、磷脂酰肌醇4，5-二磷酸3-激酶催化亞單位δ異構(gòu)體PIK3CA（degree值=72）、熱休克蛋白90α-HSP90AA1（degree值=68）、腫瘤蛋白p53-TP53（degree值=22）、磷酸化蛋白激酶3-AKT3（degree值=68）的連接度較高，可能是干姜發(fā)揮藥效作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)。通過成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖分析顯示除腫瘤信號通路（degree值=24）的連接度較大，PI3K-Akt信號通路（degree值=20）可能是干姜發(fā)揮作用的關(guān)鍵信號通路。

現(xiàn)代藥理研究表明干姜具有抗腫瘤、抗炎、保護(hù)胃黏膜和抗?jié)兊茸饔茫琒RC、PIK3CA、HSP90AA1、TP53和MAPK3等關(guān)鍵靶點(diǎn)在腫瘤發(fā)生中起著重要作用^［12］，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)SRC在腫瘤細(xì)胞的增值、遷移和血管生成等多種信號傳導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用^［13］；PIK3CA是EGFR信號通路下游的一個重要癌基因，對細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等影響具有重要作用^［14-15］；HSP90AA1是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡關(guān)鍵因子^［16］；TP53基因作為重要腫瘤抑制因子具有DNA損傷后阻止或消除細(xì)胞的能力及對異常癌基因阻止增殖的作用^［17］；MAPK3基因具有調(diào)節(jié)細(xì)胞多種功能，既可以抑制腫瘤也能促進(jìn)腫瘤發(fā)展的作用^［18］。SRC、PIK3CA和HSP90AA1等關(guān)鍵靶點(diǎn)作用于PI3K-Akt信號通路、癌癥通路等關(guān)鍵信號通路發(fā)揮治療作用。6-姜酚、8-姜酚和10-姜酚通過PI3K-Akt信號通路以達(dá)到抗肝癌的特點(diǎn)^［19］，抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡和抑制遷移等為主要表現(xiàn)；8-姜酚通過激活PI3K/AKT和mTOR信號通路，減少自噬小體形成，以抑制過度自噬，最終抑制心肌細(xì)胞凋亡^［20］；PI3K-Akt信號通路和EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路被認(rèn)為是姜治療結(jié)腸癌的重要途徑^［21］；6-姜烯酚可致使SW480細(xì)胞增殖周期阻斷在G2/M期，并呈濃度依賴性地促進(jìn)SW480凋亡，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖，而且增強(qiáng)APC表達(dá)^［22］；馮悅等^［23］研究發(fā)現(xiàn)8-姜烯酚可以通過ROS-Vegf信號通路發(fā)揮抑制血管生成的作用。表明干姜Q-Marker的選取符合其藥理藥效特點(diǎn)。利用分子對接技術(shù)研究受體與配體之間的結(jié)合模式，將SRC、HSP90AA1和PIK3CA3個關(guān)鍵靶點(diǎn)與6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚及8-姜烯酚5個有效活性成分進(jìn)行對接，結(jié)果顯示結(jié)合能均小于-20.9 kJ/mol，表明干姜核心活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合較穩(wěn)定，潛在Q-Marker有較好的生物活性，5種成分適合作為干姜Q-Marker成分。

綜上所述，本研究結(jié)合指紋圖譜和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從化學(xué)可測性方面對干姜主要成分進(jìn)行分析，通過篩選得出靶點(diǎn)、通路與干姜抗腫瘤、抗炎等藥理作用相契合，初步預(yù)測6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、6-姜烯酚和8-姜烯酚為干姜潛在的Q-Marker。進(jìn)一步完善干姜質(zhì)量控制體系，提高質(zhì)量控制水平，可以為后期進(jìn)一步研究干姜藥效及作用機(jī)制提供參考依據(jù)。

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