肝豆靈片通過調節TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路減輕肝豆狀核變性神經炎癥的機制

摘要：基于TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路，探討肝豆靈片對TX小鼠肝豆狀核變性神經炎癥的影響以及對CuCl₂誘導的小膠質細胞炎性反應的作用機制。將TX小鼠分為對照組，模型組，肝豆靈片低、中、高劑量組，青霉胺組;BV2細胞分為對照組、模型組、肝豆靈片組、TAK-242組、肝豆靈片+TAK-242組，采用HE染色檢測各組小鼠海馬組織病理學改變，蛋白質免疫印跡檢測各組小鼠海馬組織及BV2細胞中TLR4、p65、NLRP3、IL-1β蛋白的表達，酶聯免疫吸附測定法檢測各組小鼠海馬組織及BV2細胞中TNF-ɑ 、IL-1β、IL-6的含量，實時熒光定量聚合鏈式反應檢測各組BV2細胞中TLR4、p65、NLRP3、TNF-ɑ 、IL-1β mRNA的表達。結果表明：與對照組相比，模型組海馬組織出現明顯炎性損傷，TLR4、p65、NLRP3、IL-1β蛋白表達均明顯增高，TNF-ɑ、IL-1β、IL-6的含量明顯升高（Plt;0.05）；與模型組相比，肝豆靈片組和青霉胺組海馬組織的病理損傷均得到改善，且肝豆靈片高劑量組效果更明顯；肝豆靈片組和TAK-242組能抑制BV2細胞活化，TLR4、p65、NLRP3、IL-1β蛋白與mRNA表達較模型組均明顯減少，TNF-ɑ、IL-1β、IL-6的含量明顯降低（Plt;0.05）。肝豆靈片能減輕TX小鼠海馬組織炎性損傷，抑制CuCl₂誘導的BV2細胞過度活化，其機制可能與下調 TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路有關。

關鍵詞：肝豆靈片；肝豆狀核變性；TLR4/NF-κB/NLRP3；神經炎癥；作用機制

中圖分類號：R285 文獻標志碼：A 文章編號：1002-4026（2023）04-0042-10

開放科學（資源服務）標志碼（OSID）：

The mechanism of Gandouling tablet in alleviating hepatolenticular degeneration neuroinflammation via the regulation of the TLR4/NF-κB/NLRP3 signaling pathway

WEN Yuya¹， DONG Ting^2*， JIANG Zhangsheng¹， CHEN Jie¹， TIAN Liwei¹， ZHAO Chenling¹， TANG Lulu²

（1. Graduate School of Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230038， China; 2. The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230031， China）

Abstract∶This study aimed to investigate the effect of Gandouling tablet on neuroinflammation in hepatolenticular degeneration in TX mice and mechanism of generating CuCl₂-induced microglia inflammatory response based on TLR4/NF-κB/NLRP3 signaling pathway. TX mice were divided into control， model， Gandouling tablet low-dose， Gandouling tablet medium-dose， Gandouling tablet high-dose， and penicilamine groups. BV2 cells were divided into control， model， Gandouling tablet， TAK-242， and Gandouling tablet + TAK-242 groups. Hematoxylin and eosin staining was performed to detect histopathological changes in the hippocampus of mice in each group. Western blot was used to detect the expressions of TLR4， p65， NLRP3， and IL-1β in hippocampal tissue and BV2 cells of mice in each group. Enzyme-linked immunosorbent assay was performed to quantify TNF-α， IL-1β， and IL-6 levels in hippocampal tissue and BV2 cells of mice in each group. Real-time polymerase chain reaction was used to determine the expression of TLR4， p65， NLRP3， TNF-α， and IL-1β mRNA in all groups of BV2 cells. Compared with the control group， hippocampal tissue in the model group showed considerable inflammatory damage; increased protein expressions of TLR4， p65， NLRP3， and IL-1β; and significantly increased levels of TNF-α， IL-1β， and IL-6 （Plt;0.05）. Compared with the model group， the pathological damage of hippocampal tissue improved in both Gandouling tablet and penicillamine groups， and the effect of Gandouling tablet in the Gandouling tablet high-dose group was more prominent than that in the other groups. The Gandouling tablet and TAK-242 groups inhibited the activation of BV2 cells. Additionally， the expression of TLR4， p65， NLRP3， and IL-1β protein and mRNA were significantly reduced in these two groups as compared with the model group， and TNF-α， IL-1β and IL-6 levels were significantly decreased （P lt; 0.05）. Gandouling tablet can alleviate hippocampal inflammation and inhibit CuCl₂-induced hyperactivation of BV2 cells in TX mice probably by downregulating TLR4/NF-κB/NLRP3 signaling pathway.

Key words∶Gandouling tablet; hepatolenticular degeneration; TLR4/NF-κB/NLRP3; neuroinflammation; action mechanism

肝豆狀核變性（hepatolenticular degeneration， HLD）是一種以銅代謝異常為特點的常染色體隱性遺傳病，神經炎性損傷是引起HLD患者神經癥狀的主要因素^［1-2］。NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3 （NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3， NLRP3）炎性小體在多個神經退行性病中發揮重要作用。前期研究證明，NLRP3在HLD小鼠中處于高表達水平^［3］，NLRP3炎癥小體的激活可導致小膠質細胞產生白介素（Interleukin，IL），誘導神經炎性損傷，加重疾病進程^［4］。研究表明，高銅能觸發NF-κB依賴性小膠質細胞活化，引起炎癥級聯反應導致神經損傷 ^［5］。Toll 樣受體（Toll like receptor，TLR）在小膠質細胞中廣泛表達，其中TLR4是激活NF-κB信號通路以響應內源性分子所必需的^［6］，NF-κB信號激活后誘發NLRP3炎癥小體活化，募集促炎細胞因子，促進炎癥反應，因此調控TLR4/NF-κB/ NLRP3信號通路是保證神經系統穩定的重要手段^［7］。

中醫認為痰與瘀貫穿HLD始終，“痰瘀伏邪”是該病一大重要學說^［8］。安徽中醫藥大學第一附屬醫院腦病中心根據HLD患者痰瘀互結的病證特點創制的肝豆靈片，由丹參、姜黃、莪術、雞血藤、黃連、生大黃六味中藥組成，具有化濁、解毒、祛瘀之效。現代藥理研究顯示，丹參、莪術、姜黃的提取物隱丹參酮、莪術醇、姜黃素對小膠質細胞炎性反應和表型轉換具有干預作用^［9-10］。臨床用于治療HLD的青霉胺等金屬螯合劑因出現了較多副作用而應用受限，如今，中醫藥治療HLD已得到廣泛認識，肝豆靈片用于治療HLD能通過多個途徑延緩患者神經癥狀的發展進程，臨床應用近20年，療效確切，且無金屬螯合劑的毒副作用^［11-12］。

課題組前期已確證，肝豆靈片可抑制小膠質細胞活化，抑制 NLPR3炎癥小體表達，NLRP3為肝豆靈片治療HLD神經炎癥損傷的關鍵靶點^［13］，但其具體的分子機制仍不清楚。因此，本研究以TX小鼠為體內實驗模型，以CuCl₂誘導的BV2細胞為體外實驗模型，TLR4/NF-κB通路調控NLRP3炎癥小體活化為主線，探討肝豆靈片對HLD神經炎性損傷的保護機制，為肝豆靈片治療HLD神經炎癥提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

選取6月齡左右無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級的50只TX雄鼠（toximmilk mouse）（品系號C3He-Atp7Btx-J/J）和10只野生同背景型DL雄鼠，體重30～40 g，在安徽中醫藥大學教育部重點實驗室動物中心飼養。所有小鼠置于通風良好，相對濕度45%～55%，溫度為18～22 °C的清潔動物房內，自由飲食取水，并及時更換飼料。所有動物方案均經安徽中醫藥大學動物倫理委員會批準（批準文號AHUCM-mouse-2021011）。

1.2 細胞株

BV2細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）。

1.3 藥物與試劑

肝豆靈片（生產批號20220130，準字，規格0.3 g/片，安徽中醫藥大學第一附屬醫院）；青霉胺片（生產批號0521800703，規格0.125 g/片，上海上藥信誼藥廠有限公司）；胎牛血清（上海煊翎生物科技有限公司，批號FBS-S500，規格100 mL）；總RNA小量抽提試劑盒（廣州美基生物科技有限公司，批號RJH09-01）；逆轉錄試劑盒（新貝（上海）生物科技有限公司，批號R202-02）；增強型CCK8試劑盒（山東思科捷生物技術有限公司，批號CT0001-A）；IL-1β，IL-6，TNF-α酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號MAN0017504、MAN0017508、 MAN0017523）； 兔抗α-Tubulin（上海碧云天生物技術有限公司，AF0001，規格100 μL）；兔抗NLRP3（Affinity公司，批號DF7438，規格50 μL）；IL-1β（Abcam公司，批號ab254360，規格40 μL）；兔抗TLR4、p65（武漢三鷹生物技術有限公司，19811-1-AP、80979-1-RR，規格50 μL）。

1.4 主要儀器

CX53型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；5430R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）； BioTekEpoch2型全波段酶標儀（美國BioTek公司）；VE180型免疫印跡系統（瑞士Tanon公司）；LightCycler 480Ⅱ型實時熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）。

2 實驗內容

2.1 體內實驗

2.1.1 動物分組及給藥

10只DL小鼠作為對照組，50只TX小鼠隨機平分為5組：模型組，肝豆靈片低、中、高劑量和青霉胺組。給藥組劑量按照給藥組按體重70 kg成人日用量的9.01倍進行等效劑量換算，肝豆靈片低、中、高劑量組分別為0.29、0.58、1.16 g/kg灌胃；青霉胺組劑量為0.1 g/kg灌胃；對照組及模型組給予等體積生理鹽水等量灌胃，連續6周。灌胃結束后禁食12 h，1%的戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，取各組小鼠海馬組織，分別進行液氮冷凍，-80 ℃保存，10%中性福爾馬林固定處理。

2.1.2 觀察肝豆靈片對TX小鼠海馬組織炎性損傷的影響

（1）采用HE染色觀察TX小鼠海馬組織病理學改變

取各組小鼠海馬組織，固定于10%中性甲醛溶液中，經脫水、包埋、切片、常規HE染色后，置于光學顯微鏡下觀察，評價海馬組織病理學狀態。

（2）ELISA檢測各組小鼠海馬組織炎癥因子TNF-ɑ 、IL-1β、IL-6的表達。

取出凍存的海馬組織稱重后加入9倍質量的生理鹽水，分別在冰上研磨成勻漿后3 000 r/min下15 min，離心取上清液，其余按照ELISA試劑盒說明書步驟進行。

2.1.3 觀察肝豆靈片基于TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路對TX小鼠神經炎癥的影響

采用蛋白質免疫印跡（Western blot）檢測信號通路相關蛋白TLR4、p65、NLRP3、IL-1β的表達情況：分別取各組小鼠海馬組織在冰上進行研磨，抽提組織蛋白，通過SDS-PAGE電泳以及電轉移裝置將蛋白質轉移至PVDF膜上。用5%的BSA浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2 h，加入一抗，4 ℃水平搖床孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，洗去多余的二抗，以α-Tubulin為內參，用ImageJ軟件分析、計算目標條帶的灰度值。

2.2 體外實驗

2.2.1 細胞培養

復蘇BV2細胞，復蘇后加入含1%雙抗、10%胎牛血清的DMEM培養基接種于培養瓶中，置于培養箱中培養（37 ℃、5%CO₂）。待細胞生長達亞融合狀態，用0.25%胰蛋白酶消化，傳代，每周傳代2～3次，取對數期的細胞進行實驗。

2.2.2 肝豆靈片含藥血清的制備與保存

將20只SD大鼠隨機分為對照組和肝豆靈片組，每組10只。肝豆靈片組中藥含藥血清組按70 kg正常人劑量等量換算，采用人的6.25倍劑量0.4 g/（kg·d）的肝豆靈片進行灌胃，對照組灌等量生理鹽水，每天2次，連續灌胃5 d，末次灌胃后禁食12 h，1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，在無菌條件下進行腹主動脈取血，離心取上清液，于56 ℃水浴30 min，用0.22 μm濾器過濾除菌，將濾液置于-20 ℃保存備用。

2.2.3 CCK8比色法觀察細胞活性

取對數生長期細胞以5.0×10³個/mL密度接種于96孔培養板中，每孔100 μL，37 ℃、5%CO₂孵箱中培養，細胞在含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養液中培養過夜，換液后繼續培養24 h，每孔分別加入100 μmol/L銅離子刺激BV2細胞，在加銅離子的孔內，分別加入100 μL不同濃度的肝豆靈片含藥血清（2%、4%、6%、8%），同時設對照組、銅離子負荷組，每組設6個復孔，孵育12、24、36、48 h后每孔加入CCK8 10 μL繼續孵育2 h，置酶標儀450 nm處測吸光度。觀察不同濃度肝豆靈片含藥血清作用不同時間后對BV2細胞的影響，為后續實驗篩選出肝豆靈片最佳濃度含藥血清和最佳作用時間，細胞活性=［（A_OD給藥組-A_OD對照組）/（A_OD空白組-A_OD對照組）］×100%。

2.2.4 BV2細胞分組與干預

BV2細胞隨機分為對照組、模型組、肝豆靈片組、TAK-242組、肝豆靈片+TAK-242組。對照組用空白血清培養基培養，不作其他處理；模型組給與100 μmol/L的CuCl₂誘導處理；肝豆靈片組給與CuCl₂和肝豆靈片含藥血清同時處理；TAK-242組給CuCl₂和TLR4抑制劑TAK-242同時處理，肝豆靈片+ TAK-242組給與肝豆靈片和TLR4抑制劑TAK-242同時處理。

2.2.5 觀察肝豆靈片基于TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路對BV2細胞的影響

（1）Western blot測各組細胞中TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路相關蛋白TLR4、p65、NLRP3、IL-1β的表達情況。

取對數生長的BV2細胞，按照2.4項分組與干預方法，于37 ℃、5%CO₂培養箱中孵育24 h，提取細胞總蛋白，通過SDS-PAGE電泳以及電轉移裝置將蛋白質轉移至PVDF膜上。用5%的BSA浸泡PVDF膜，室溫搖床封閉2 h，加入一抗，4 ℃水平搖床孵育過夜，加入二抗室溫孵育2 h，洗去多余的二抗，以α-Tubulin為內參，用ImageJ軟件分析、計算目標條帶的灰度值。

（2）RT-qPCR檢測各組細胞中信號通路及下游炎癥因子 mRNA的表達情況。

取對數生長的BV2細胞，按照2.2.4項分組與干預方法，于37 ℃、5%CO₂培養箱中孵育24 h，采用試劑盒提取細胞總RNA，進行逆轉錄，總反應體系20 μL，42 ℃水浴1 h，合成第一鏈cDNA。取上述反應液作為熒光定量的模板，進行擴增，引物由上海新貝生物科技有限公司進行設計，詳見表1，反應程序首先95 ℃ 600 s熱啟動，然后按以下條件進行：預變性95 ℃，30 s；設定45個循環（變性95 ℃，10 s；退火60 ℃，30 s），反應體系10 μL 2×S6 Universal SYBR qPCR mix，0.4 μL Prime-F，0.4 μL Prime-R，5 μL cDNA樣本，4.2 μL ddH₂O，總體積為20 μL，以GAPDH為內參，進行擴增。利用2^-ΔΔCt計算相對表達量。

（3）ELISA檢測各組細胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

取對數生長的BV2細胞，按照2.2.4項分組與干預方法，于37 ℃、5%CO₂培養箱中孵育24 h，取上清，參照ELISA試劑盒說明書檢測細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。

2.2.6 統計學分析

使用SPSS 25.0軟件對數據進行統計學分析，計量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 HE染色觀察肝豆靈片對TX小鼠海馬組織病理學改變的影響

對照組海馬組織未見明顯異常；與對照組相比，模型組海馬組織細胞固化萎縮，細胞壞死明顯增多；肝豆靈片低、中劑量組與青霉胺組細胞間結構松散，較模型組細胞壞死減少，肝豆靈片高劑量組細胞壞死明顯減少。見圖1。

3.2 Western blot檢測各組小鼠TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路相關蛋白的表達情況

與對照組比較，模型組TLR4、p65、NLRP3、IL-1β表達水平上調（Plt;0.05）；與模型組比較，肝豆靈片低、中、高劑量組與青霉胺組TLR4、p65、NLRP3、IL-1β表達水平均下調（Plt;0.05）。見圖2。

3.3 ELISA檢測各組小鼠海馬組織炎癥因子的表達

采用ELISA檢測海馬組織上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的質量分數結果：與對照組比較，模型組TNF-α 、IL-1β、IL-6表達均明顯升高（Plt;0.05）；與模型組比較，肝豆靈片低、中、高劑量組，青霉胺組TNF-α、IL-1β、IL-6質量分數均下降（Plt;0.05）。見圖3。

3.4 CCK8法觀察肝豆靈片含藥血清最佳作用濃度和作用時間

與對照組比較 ，2%肝豆靈片組在12、24、36、48 h 作用時間內細胞活性無明顯改變；6%肝豆靈片組在36、48 h后細胞活性值明顯升高；4%肝豆靈片組在12、24、36 h后細胞活性值無明顯變化；8% 肝豆靈片組在36、48 h 細胞活性值均升高。因此，本實驗選擇6%，48 h作為肝豆靈片含藥血清最佳作用濃度和時間。見圖4。

3.5 肝豆靈片對BV2細胞TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路相關蛋白表達的影響

WesternBlot檢測BV2細胞TLR4、p65、NLRP3 、IL-1β蛋白表達情況：與對照組比較，模型組TLR4、p65、NLRP3 、IL-1β表達水平上調（Plt;0.05）；與模型組比較，肝豆靈片組、TAK-242組TLR4、p65、NLRP3 、IL-1β表達水平顯著下調（Plt;0.05）。見圖5。

3.6 肝豆靈片對BV2細胞TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路相關mRNA表達的影響

RT-qPCR檢測BV2細胞TLR4、p65、NLRP3、TNF-α、IL-1β mRNA表達結果：與對照組比較，模型組表達顯著升高（Plt;0.05）；與模型組比較，肝豆靈片組和TAK-242組表達均下降（Plt;0.05）。 見圖6。

3.7 肝豆靈片對BV2細胞炎癥因子表達的影響

ELISA檢測炎癥因子TNF-α 、IL-1β、IL-6的含量結果：與對照組比較，模型組炎癥因子表達顯著升高（Plt;0.05）；與模型組比較，肝豆靈片組炎癥因子表達均下降（Plt;0.05）。見圖7。

4 討論

HLD腦內銅過量沉積引起氧化應激和炎癥反應，對神經網絡造成破壞，最終導致認知障礙等神經癥狀^［14］。大量的動物實驗和臨床研究證實，神經炎癥貫穿于HLD神經癥狀發生的始終，神經炎癥不僅僅是HLD神經病理學的關鍵組成成分，同時可能也是其他病理特征形成和發展的誘發因素^［3，15］。神經炎癥與HLD神經癥狀的發生發展關系密切，并有可能成為新的藥物作用靶點。本研究通過對海馬組織炎性因子水平、炎癥相關TLR4/NF-κB/NLRP3通路、海馬病理學指標等進行檢測，研究HLD神經癥狀與慢性炎癥反應之間的聯系，以及肝豆靈片對其干預作用。

小膠質細胞是中樞神經系統中最常見的免疫細胞，在維持其正常功能中發揮重要作用，活化狀態的小膠質細胞可誘導NF-κB途徑并產生多種促炎因子^［16］。如今，小膠質細胞廣泛應用于神經退行性變、炎癥反應和免疫等動物和生物實驗研究，永生化的小鼠小膠質細胞系BV2是許多實驗環境中原代小膠質細胞的有效替代品^［17］，小膠質細胞介導的神經炎癥是HLD發病機制的重要部分，因此，本實驗采用CuCl₂誘導的BV2細胞模型探討HLD神經炎癥損傷機制。本研究結果表明，在小鼠海馬組織和體外培養的BV2細胞中，與模型組相比，肝豆靈片組IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子含量均明顯下調，TLR4、p65、NLRP3蛋白表達明顯下調，提示肝豆靈片具有抗炎作用，并可能通過TLR4/ NF-κB/NLRP3通路改善炎癥反應。此外，體內實驗結果顯示TX小鼠海馬組織存在炎性損傷，肝豆靈片組可以明顯減輕海馬組織的病理損傷以及信號通路相關蛋白和下游炎癥因子的表達，并且與青霉胺組相比，肝豆靈片高劑量組具有更明顯的效果。

TLR4在小膠質細胞中大量表達并誘導小膠質細胞活化^［18］，在啟動神經炎癥反應和介導神經免疫中發揮關鍵作用^［19］。研究表明，TLR4 可以被許多外源性和內源性危險信號分子激活^［20］，繼而激活NF-κB等轉錄因子，隨后上調炎性小體組分NLRP3的表達，形成NLRP3炎癥小體的組裝，最終促進炎癥因子的產生^［21］。本實驗中模型組TLR4、p65、NLRP3、IL-1β蛋白和mRNA表達水平較對照組均明顯增加，提示TLR4/ NF-κB/NLRP3通路參與HDL神經炎癥反應。TAK-242是TLR4的特異性抑制劑，可充當小膠質細胞調節劑，將小膠質細胞極化從促炎狀態轉移到抗炎狀態，從而發揮保護和修復神經的作用，并通過下調NF-κB和NLRP3 信號傳導來保護神經元細胞免受活化的BV2細胞的毒性^［22］。本實驗結果表明，TAK-242組較模型組TLR4、p65、NLRP3、IL-1β蛋白表達均下調，進一步說明了通過抑制TLR4下調NF-κB/NLRP3信號通路，可以抑制HDL的神經炎癥損傷。

綜上所述，本研究體內實驗以TX小鼠為模型，證明了肝豆靈片對TX小鼠海馬區炎性損傷的積極作用可能與TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路的下調有關。以CuCl₂誘導的BV2細胞為模型進行體外實驗，初步證明了肝豆靈片能抑制小膠質細胞過度活化，減輕炎癥反應，并發現其機制可能與抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路有關。該研究為肝豆靈片治療HLD神經炎癥提供了一定的實驗依據，對中醫藥治療HLD具有現實意義，但其具體作用機制仍需進一步探討。

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