基于網絡藥理學和分子對接探討香砂六君子湯治療幽門螺桿菌相關性胃炎的作用機制

摘要：利用網絡藥理學和分子對接方法分析香砂六君子湯的有效活性成分及其治療幽門螺桿菌相關性胃炎的分子機制。通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺、GeneCards數據庫和OMIM數據庫篩選香砂六君子湯的藥物活性化合物、藥物作用靶點基因及幽門螺桿菌相關性胃炎疾病相關靶點，并對藥物作用靶點和疾病相關靶點進行維恩分析；應用Cytoscape軟件以及STRING數據庫分別構建藥物-化合物-潛在靶點相互作用網絡及蛋白質-蛋白質相互作用網絡圖。使用DAVID數據庫對交集靶點進行基因本體功能和京都基因與基因組百科全書通路富集分析。通過AutoDock PyMOL等軟件對關鍵成分和作用靶點進行分子對接。通過吉姆薩染色法和CCK-8法測定細胞凋亡率，WesternBlot檢測相關靶蛋白表達。最終篩選出香砂六君子湯方中槲皮素、木犀草素和山柰酚等122種藥物活性化合物，可能通過作用于STAT3、TP53、AKT1等101個潛在靶點以及Toll樣受體信號通路、TNF信號通路、T細胞受體信號通路等109條通路參與螺桿菌相關性胃炎的治療。分子對接顯示藥物活性成分槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素與靶點蛋白STAT3、TP53、AKT1有較好的親和力。與模型組比較，用香砂六君子湯處理后，GES-1細胞的細胞核深染加深，細胞凋亡率顯著下降，p-STAT3蛋白表達也顯著降低。研究認為香砂六君子湯治療幽門螺桿菌相關性胃炎以多成分、多靶點、多途徑發揮其抑菌、抗炎的作用。

關鍵詞：香砂六君子湯；幽門螺桿菌相關性胃炎；網絡藥理學；分子對接；作用機制

中圖分類號：R285 文獻標志碼：A 文章編號：1002-4026（2023）04-0052-09

開放科學（資源服務）標志碼（OSID）：

Exploring the mechanism of Xiangsha Liujunzi Decoction in treating Helicobacter pylori-associated gastritis based on network pharmacology and molecular docking technology

YIN Zhipeng， GAO Yunyun， LIU Wenwen， GUO Pengbo， ZHAO Yinghui^*

（School of Basic Medicine， Shandong First Medical University amp;Shandong Academy of Medical Sciences， Jinan 250117， China）

Abstract∶This study aimed to analyze the active ingredients of Xiangsha Liujunzi Decoction and its molecular mechanism in treating Helicobacter pylori-associated gastritis using network pharmacology and molecular docking. The drug active compounds， drug target genes， and disease-related targets of H. pylori-associated gastritis in Xiangsha Liujunzi Decoction were screened using Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform， GeneCards database， and OMIM database， and the drug targets and disease-related targets were analyzed using Venn analysis. Cytoscape software and STRING database were used to construct drug-compound potential target interaction network and protein-protein interaction network， respectively. Gene Ontology function and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway enrichment analysis were performed for intersection targets using the DAVID database. The key components and targets were docked using AutoDock PyMOL and other software. The apoptosis rate was determined with Jimsa staining and CCK-8 assay， and the expressions of the related target proteins were detected with western blot. Finally， 122 active compounds， such as quercetin， luteolin， and kaempferol， in Xiangsha Liujunzi Decoction were screened out. These genes may be involved in the treatment of H. pylori-associated gastritis by acting on 101 potential targets， such as STAT3， TP53， and AKT1， as well as 109 pathways， such as toll-like receptor， TNF， and T-cell receptor signaling pathways. Molecular docking showed that quercetin， β-sitosterol， and luteolin had good affinity for the target proteins STAT3， TP53， and AKT1. Compared with the model group， after treatment with Xiangsha Liujunzi Decoction， the nuclear hyperchromism of GES-1 cells was enhanced， the apoptosis rate was significantly decreased， and the expression of p-STAT3 was also significantly decreased. Based on these findings， it can be concluded that Xiangsha Liujunzi Decoction exerts antibacterial and anti-inflammatory effects in the treatment of H. pylori-associated gastritis in multiple ways via multiple components and targets.

Key words∶Xiangsha Liujunzi Decoction; Helicobacter pylori-associated gastritis; network pharmacology; molecular docking; mechanism of action

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori， H. pylori）是胃黏膜感染最常見的革蘭氏陰性桿菌^［1］，其主要的致病機制是產生多種毒力因子，使宿主細胞內信號通路失調，從而引起胃炎^［2］。H. pylori陽性的胃炎稱為幽門螺桿菌相關性胃炎（H. pylori相關性胃炎），《京都全球共識報告》首次明確提出H. pylori相關性胃炎是一種傳染病，無論患者是否有癥狀都需要治療^［3］。目前經典的H. pylori相關性胃炎治療多采用三聯或四聯的綜合西醫療法，但是隨著抗生素耐藥性的提升、重復感染和胃腸道副作用等問題，三聯療法和四聯療法的療效也不理想^［4］。而中醫藥在抑制與滅殺H. pylori方面具有耐藥性低、副作用小等優勢^［5］，因此中醫治療H. pylori相關性胃炎成為該領域關注的熱點。

香砂六君子湯由黨參、白術、茯苓、甘草、陳皮、半夏、砂仁、木香八味藥組成^［6］。黨參可健脾補氣、白術可健脾去濕、茯苓可健脾養心、甘草可清熱解毒、陳皮可健脾順氣、半夏可燥濕化痰、砂仁可化濕醒脾、木香可健脾消食^［7］。研究表明，香沙六君子湯通過影響H. pylori相關性胃炎大鼠胃黏膜組織中TTLR2、TLR4、MAPK、p-P38和NF-κB的蛋白表達量和血清中TNF-α和IL-6的水平，從而對大鼠臨床癥狀及胃黏膜病理改變有所改善^［8］。然而，對于香砂六君子湯在H. pylori相關性胃炎治療中的藥物成分和作用機制尚不明確。

網絡藥理學是一門基于人工智能和大數據時代藥物系統性的新學科^［9］，從系統角度和分子水平發現中藥的網絡靶點、多成分療法^［10-11］，從而進一步闡述中藥的作用機制^［12］。因此，本研究借助網絡藥理學和分子對接技術，分析香砂六君子湯治療H. pylori相關性胃炎的有效活性成分及作用機制，為臨床治療H. pylori相關性胃炎提供理論依據。

1 儀器與材料

1.1 細胞株與菌株

人胃黏膜上皮細胞（GES-1）購于中國北納創聯生物公司，H. pylori國際標準菌株Hp26695由山東大學基礎醫學院病原生物學系孫允東教授惠贈。

1.2 藥物及主要試劑

香砂六君子湯（丸）（仲景宛西制藥股份有限公司，批號Z41021828）;DMEM培養基（美國Hyclone公司，批號AH29882654）；胎牛血清（武漢普賽諾公司，批號SA220119）；吉姆薩染液（北京索萊寶科技公司，批號20160316）；4%多聚甲醛（武漢賽維爾生物科技公司，批號CR2103050）；CCK-8試劑盒（北京索萊寶科技公司，批號316R012）；DMSO（美國Sigma公司，批號710NO313）；一抗GADPH（武漢三鷹技術有限公司，批號00109152）；二抗HRP標記羊抗兔抗體（武漢三鷹技術有限公司，批號00109152）；一抗STAT3單克隆抗體（美國Abcam公司，批號GR3220487-3）；p-STAT3單克隆抗體（美國Abcam公司，批號GR3378496-1）；ECL超敏發光液（上海雅酶生物科技有限公司，批號01631200）。

1.3 主要儀器

電泳儀、電泳槽、電轉槽、化學發光成像系統（美國Bio-Rad公司）；熒光倒置顯微鏡（尼康株式全社）；V-500H可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；二氧化碳孵育箱（益世科（江蘇）生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 獲取香砂六君子湯活性成分及其靶點

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform， TCMSP），檢索香砂六君子湯各成分（黨參、白術、茯苓、甘草、陳皮、半夏、木香、砂仁）的活性化合物。以藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，化合物類藥性（drug likeness，DL）≥0.18為標準，篩選檢索到的活性成分。在TCMSP數據庫查詢藥物活性化合物所對應的蛋白靶點。再利用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數據庫查找藥物作用蛋白靶點對應的基因靶點。

2.2 篩選香砂六君子湯治療H. pylori相關性胃炎潛在靶點

以“Helicobacter pylori associated gastritis”為關鍵詞在GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）查找H. pylori相關性胃炎疾病相關靶點。并與香砂六君子湯的活性成分靶點進行匹配，獲取交集靶點，即香砂六君子湯治療H. pylori相關性胃炎的潛在作用靶點。利用Venny 2.1 （https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）軟件繪制藥物與疾病的交叉基因維恩圖。

2.3 構建藥物-活性成分-潛在靶點網絡

通過Cytoscape 3.8.0軟件構建藥物-活性成分-潛在靶點網絡，并進行網絡拓撲分析獲得香砂六君子湯治療H. pylori相關性胃炎的關鍵藥物活性成分。

2.4 構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡

將交集靶點導入STRING（https：//string-db.org/）數據庫中，進行蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction， PPI）分析并將文件以“tsv”格式保存。運用Cytoscap3.8.0軟件進行PPI網絡構建。

2.5 基因富集分析

將交集靶點導入DAVID數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行基因本體（gene ontology， GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，并運用微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）對富集程度前10的GO富集條目以及前20的KEGG富集通路進行數據可視化處理。

2.6 構建潛在靶點-BP-CC-MF-KEGG網絡

通過Cytoscape 3.8.0軟件對藥物潛在靶點、GO功能分析中的生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細胞組成（cellular component，CC）進行富集分析以及KEGG富集分析，構建潛在靶點-BP-CC-MF-KEGG網絡。

2.7 分子對接驗證

將PPI圖中排名前3的靶基因和藥物成分進行分子對接，從Protein Data Bank數據庫（http：//www.rcsb.org/）中下載蛋白結構，應用AutoDockTools軟件對靶點蛋白進行加氫、去水處理后進行分子對接，將對接結果導入到

PMOL軟件中進行可視化分析。

2.8 細胞培養、造模及分組給藥

將GES-1胃黏膜細胞按30萬個接種于6孔板中，用DMEM完全培養基（10%胎牛血清（FBS））進行培養，并分為對照組、模型組和香砂六君子湯低、中和高質量濃度（10、20、100 μg/mL）給藥組，香砂六君子湯給藥組使用相應的藥物濃度預先處理細胞，置于37 ℃、5% CO₂培養箱中過夜至細胞融合率達70%～80%。收集H. pylori，用完全培養基DMEM重懸后按感染復數100∶1加入細胞中，香砂六君子湯繼續給藥處理，繼續培養48 h，中間換液。對照組不與H. pylori共培養，對照組和模型組不加藥。

2.9 CCK-8檢測細胞活性

在96孔板中細胞接種，37 ℃、5% CO₂培養箱中過夜，然后向每孔加入10 μL CCK-8試劑，放置CO₂培養箱中孵育2 h后，用酶標儀測定450 nm處的吸光值。

2.10 吉姆薩染色

將6孔板中各組細胞處理48 h之后，棄原培養基，無菌PBS（phosphate buffer saline，磷酸緩沖鹽溶液）緩沖液洗滌細胞3次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，室溫固定細胞15 min。然后棄去4%多聚甲醛，室溫靜置使其充分揮發。用無菌PBS緩沖液按適當比例稀釋吉姆薩原液，將稀釋好的吉姆薩染液加到6孔板中，室溫靜置30 min后，用緩慢的流水將染液洗掉，顯微鏡下觀察細胞形態。

2.11 蛋白印跡檢測靶蛋白表達

首先制備蛋白裂解液，提取細胞蛋白。通過BCA法（bicinchoninic acid assay）將每組蛋白定量，然后將蛋白用4×SDS-PAGE Loading buffer、RNase-Free Water混勻，在100 ℃的水浴鍋中煮10 min。將等量的蛋白質在8%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳并電轉到PVDF膜（polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯膜）上。用10%的奶粉封閉液封閉2 h，之后加入相應的一抗4 ℃孵育過夜，次日TBST洗膜3次，加入二抗孵育2 h，TBST洗膜3次。PVDF膜加ECL化學發光顯影后，保存照片并用Image J進行灰度值分析。

2.12 統計學分析

數據采用SPSS 26.0統計軟件進行分析，實驗結果用平均值±標準偏離（x±s）顯示；通過t檢驗可以進行二組之間的對比，在多組組之間進行單因方差分析；Plt;0.05認為差異存在統計價值。

3 結果

3.1 香砂六君子湯活性化合物及藥物作用靶點的篩選

通過TCMSP數據庫對黨參、白術、茯苓、甘草、陳皮、半夏、砂仁、木香的藥物活性化合物按照OB≥30%和DL≥0.18的檢索條件進行檢索，共得到169種藥物活性化合物。刪除無效值和重復值后，最終獲得135種藥物活性化合物，黨參、白術、茯苓、甘草、陳皮、半夏、木香、砂仁的主要有效活性成分見OSID科學數據與內容附表1，其中有7種為多藥物共有成分（表1）。運用TCMSP數據庫查詢135種藥物活性化合物所對應的藥物作用靶點蛋白，共獲得2 397個，合并重復后共保留262個藥物作用靶點蛋白。

3.2 香砂六君子湯治療H. pylori相關性胃炎潛在靶點的篩選

從GeneCards數據庫中檢索共獲得H. pylori相關性胃炎相關靶點800個。將H. pylori相關性胃炎相關疾病靶點與香砂六君子湯的活性成分作用靶點應用Venny軟件進行分析，最終獲得101個交集靶點，作為香砂六君子湯治療H. pylori相關性胃炎的潛在靶點（OSID科學數據與內容附圖1）。

3.3 活性成分-潛在靶點網絡圖

將3.1中135種藥物活性化合物所對應的藥物作用靶點與101個交集靶點進行比對篩選，刪除無對應靶點的藥物活性化合物13個，將最終剩余的122個藥物活性化合物與101個潛在靶點的數據集導入Cytoscape 3.8.0軟件，建立藥物-化合物-潛在靶點網絡圖（OSID科學數據與內容附圖2）。

3.4 蛋白質互作網絡圖

將交集靶點導入STRING數據庫進行PPI分析，得到96個節點、449條邊的PPI網絡（OSID科學數據與內容附圖3）。PPI網絡圖中degree值≥20的節點共有10個，由大到小分別為轉錄激活因子3（STAT3）、腫瘤抑制因子p53（TP53）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、二聚化蛋白2（JUN）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、白細胞介素6（IL-6）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）。

3.5 GO和KEGG通路富集分析

使用DAVID數據庫進行GO和KEGG通路富集分析，GO功能富集分析后得到BP 534個、CC 56個、MF 91個。根據Plt;0.01，選取BP、CC和MF排名前10的富集條目（OSID科學數據與內容附圖4）。KEGG通路富集分析獲取109條通路，結果顯示，香砂六君子湯治療H. pylori相關性胃炎的關鍵通路主要涉及癌癥相關通路、Toll樣受體信號通路、TNF信號通路、T細胞受體信號通路、Nod樣受體信號通路、P53信號通路等（OSID科學數據與內容附圖5）。

3.6 潛在靶點-BP-CC-MF-KEGG網絡圖的構建

通過Cytoscape 3.8.0軟件對藥物潛在靶點、GO功能分析中的BP、MF、CC富集分析以及KEGG富集分析構建潛在靶點-BP-CC-MF-KEGG網絡（OSID附科學數據與內容圖6）。結果顯示，香砂六君子湯藥效靶點主要位于細胞外隙物質和胞質，并通過蛋白質融合等多重結合方法參與了藥物反應、細胞凋亡過程負調節、缺乏配體的細胞外源性凋亡信息通路等在內的生物學過程。

3.7 分子對接分析

PPI網絡中排名前3的靶點STAT3、TP53、AKT1與香砂六君子湯有效活性成分槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素進行分子對接（表2）。結合自由能越低，表示活性化合物與靶蛋白的結合能力越好。圖1以3D圖的形式展示了靶點STAT3、TP53和AKT1分別與有效活性成分槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素的結合。

3.8 吉姆薩染色驗證香砂六君子湯對H. pylori的體外抑制作用

如圖2所示，吉姆薩染色結果顯示，與對照組相比，模型組的細胞數量明顯減少；而與模型組（H. pylori）相比，香砂六君子湯給藥組中的細胞數量有所增加，細胞形態趨于正常。

fected cells

3.9 香砂六君子湯對H. pylori感染GES-1細胞凋亡的影響

如圖3所示，與對照組相比，24 h和48 h后模型組GES-1細胞細胞活力明顯下降；與模型組（H. pylori）相比，香砂六君子湯（100 μg/mL）+H. pylori組細胞活力在給藥24 h和48 h后沒有差異；與模型組相比，香砂六君子湯（20 μg/mL）+H. pylori組在給藥24 h后細胞活力沒有差異，在給藥48 h后細胞活力有明顯差異；而與模型組相比，香砂六君子湯（10 μg/mL）+H. pylori組在給藥24 h和48 h后細胞活力都有明顯差異。

3.10 香砂六君子湯處理對H. pylori感染GES-1細胞中靶點蛋白表達的影響

如圖4所示，與對照組相比，模型組p-STAT3蛋白表達明顯升高；與模型組比較，香砂六君子湯低、中和高質量濃度（10、20、100 μg/mL）給藥組的p-STAT3蛋白表達都有明顯的降低。

4 討論

本研究運用網絡藥理學的方法分析了香砂六君子湯治療H. pylori相關性胃炎的有效成分135種及262個藥物靶點，其中，山柰酚和氨芐西林聯用時，能夠顯著降低氨芐西林的最小抑菌濃度，增強氨芐西林的抗菌活性，有較好的體外抗H. pylori的作用^［13］。槲皮素可以通過影響p38、MAPK、BCL-2和BAX水平來改善H. pylori感染引起的胃炎癥和凋亡^［14］。木犀草素具有抗氧化、抗炎、抗過敏、抗癌和降尿酸的作用^［15］。楊曉曄等^［16］研究發現木犀草素可以通過JAK/STAT信號通路來抑制胃癌細胞的增殖和凋亡。川陳皮素除了有抗癌、抗真菌、抗炎、抗癲癇作用，還具有抗血細胞凝集、抗血栓形成的作用^［17］。已有研究證明，川陳皮素通過降低H. pylori感染GES-1細胞中ROS的水平，從而增加細胞活力^［18］。

對香砂六君子湯作用靶點和H. pylori相關性胃炎疾病相關靶點取交集，得到潛在靶點109個，PPI網絡核心靶點分析顯示香砂六君子湯可能通過STAT3、TP53、AKT1、TNF、JUN、MAPK1、MAPK3、IL-6等靶點蛋白起作用。分子對接的結果顯示，該藥的有效活性成分與H. pylori相關性胃炎的疾病靶點有很好的結合，其中STAT3、TP53、AKT1與香砂六君子湯有效活性成分槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素均有結合。信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）是一種高度通用的信號蛋白和轉錄因子，在胃黏膜上皮轉化中發揮重要的作用，激活的STAT3與H. pylori相關性胃炎和人類癌癥進展有關^［19］。H. pylori感染通過ROS積累誘導了STAT3的激活^［20］。TP53是一種抑癌蛋白，在H. pylori感染誘發胃癌發病機制中具有重要功能^［21］。AKT1即為蛋白激酶B（AKT）的同源異構體，PI3K/AKT信號通路主要由PI3K、AKT及下游相關分子組成，PI3K/AKT信號通路在調控細胞增殖與細胞生長代謝方面發揮重要作用^［22］，H. pylori通過PI3K/AKT信號通路介導FoxO1/3a的活性來調控細胞凋亡^［23］。腫瘤壞死因子（TNF）家族指一組可以引起細胞死亡（凋亡）的細胞因子。TNF-α水平的升高可能在H. pylori感染的消化性潰瘍的發病機制中發揮關鍵作用^［24］，研究發現，感染H. pylori的個體中TNF-α等促炎細胞因子的表達或血清水平明顯高于未感染的個體^［25］。Jun是一種原癌基因，有研究發現H. pylori感染后可能誘導Jun基因的激活，從而誘導相關炎癥的發生^［26］。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯激活是多種信號通路的中心，MAPK信號級聯會導致基因表達的改變。細胞因子如白細胞介素1（IL-1）、白細胞介素8（IL-8）和TNF-α被認為在H. pylori感染相關的炎癥和增殖反應中發揮激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）作用^［27］。已有研究證實，H. pylori感染的胃組織中MAPK活化的水平高于正常胃組織。大量的研究已經證實STAT3、AKT1、IL-6、TNF等靶點蛋白與H. pylori感染密切相關，表明本研究對香砂六君子湯對治療H. pylori相關性胃炎分子網絡調控機制的預測具有一定準確性。

為了進一步驗證香砂六君子湯對治療H. pylori相關性胃炎的有效性，本研究還進行了體外細胞實驗。首先通過吉姆薩染色和CCK-8活性檢測驗證了在香砂六君子湯處理后，GES-1細胞受H. pylori感染的凋亡情況明顯改善。接著使用Western Blot對STAT3靶點蛋白進行檢測，結果顯示，H. pylori感染可以激活GES-1細胞中STAT3蛋白的表達。之后，觀察不同質量濃度的香砂六君子湯處理H. pylori感染的GES-1細胞中STAT3蛋白的表達。結果表明，與H. pylori模型組相比，香砂六君子湯給藥組明顯降低H. pylori感染GES-1細胞中p-STAT3蛋白的表達水平。研究結果表明香砂六君子湯能有效改善胃黏膜上皮細胞受H. pylori誘導的凋亡影響，其作用機制可能與降低STAT3蛋白的磷酸化有關。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法和部分體外細胞實驗，對中藥香砂六君子湯治療H. pylori相關性胃炎進行了系統分析與驗證，為香砂六君子湯治療H. pylori相關性胃炎的臨床應用提供參考依據。

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