基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討香砂六君子湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的作用機(jī)制

摘要：利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接方法分析香砂六君子湯的有效活性成分及其治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的分子機(jī)制。通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺、GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫篩選香砂六君子湯的藥物活性化合物、藥物作用靶點(diǎn)基因及幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)，并對藥物作用靶點(diǎn)和疾病相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行維恩分析；應(yīng)用Cytoscape軟件以及STRING數(shù)據(jù)庫分別構(gòu)建藥物-化合物-潛在靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。使用DAVID數(shù)據(jù)庫對交集靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體功能和京都基因與基因組百科全書通路富集分析。通過AutoDock PyMOL等軟件對關(guān)鍵成分和作用靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接。通過吉姆薩染色法和CCK-8法測定細(xì)胞凋亡率，WesternBlot檢測相關(guān)靶蛋白表達(dá)。最終篩選出香砂六君子湯方中槲皮素、木犀草素和山柰酚等122種藥物活性化合物，可能通過作用于STAT3、TP53、AKT1等101個(gè)潛在靶點(diǎn)以及Toll樣受體信號通路、TNF信號通路、T細(xì)胞受體信號通路等109條通路參與螺桿菌相關(guān)性胃炎的治療。分子對接顯示藥物活性成分槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素與靶點(diǎn)蛋白STAT3、TP53、AKT1有較好的親和力。與模型組比較，用香砂六君子湯處理后，GES-1細(xì)胞的細(xì)胞核深染加深，細(xì)胞凋亡率顯著下降，p-STAT3蛋白表達(dá)也顯著降低。研究認(rèn)為香砂六君子湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎以多成分、多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮其抑菌、抗炎的作用。

關(guān)鍵詞：香砂六君子湯；幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對接；作用機(jī)制

中圖分類號：R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1002-4026（2023）04-0052-09

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)志碼（OSID）：

Exploring the mechanism of Xiangsha Liujunzi Decoction in treating Helicobacter pylori-associated gastritis based on network pharmacology and molecular docking technology

YIN Zhipeng， GAO Yunyun， LIU Wenwen， GUO Pengbo， ZHAO Yinghui^*

（School of Basic Medicine， Shandong First Medical University amp;Shandong Academy of Medical Sciences， Jinan 250117， China）

Abstract∶This study aimed to analyze the active ingredients of Xiangsha Liujunzi Decoction and its molecular mechanism in treating Helicobacter pylori-associated gastritis using network pharmacology and molecular docking. The drug active compounds， drug target genes， and disease-related targets of H. pylori-associated gastritis in Xiangsha Liujunzi Decoction were screened using Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform， GeneCards database， and OMIM database， and the drug targets and disease-related targets were analyzed using Venn analysis. Cytoscape software and STRING database were used to construct drug-compound potential target interaction network and protein-protein interaction network， respectively. Gene Ontology function and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway enrichment analysis were performed for intersection targets using the DAVID database. The key components and targets were docked using AutoDock PyMOL and other software. The apoptosis rate was determined with Jimsa staining and CCK-8 assay， and the expressions of the related target proteins were detected with western blot. Finally， 122 active compounds， such as quercetin， luteolin， and kaempferol， in Xiangsha Liujunzi Decoction were screened out. These genes may be involved in the treatment of H. pylori-associated gastritis by acting on 101 potential targets， such as STAT3， TP53， and AKT1， as well as 109 pathways， such as toll-like receptor， TNF， and T-cell receptor signaling pathways. Molecular docking showed that quercetin， β-sitosterol， and luteolin had good affinity for the target proteins STAT3， TP53， and AKT1. Compared with the model group， after treatment with Xiangsha Liujunzi Decoction， the nuclear hyperchromism of GES-1 cells was enhanced， the apoptosis rate was significantly decreased， and the expression of p-STAT3 was also significantly decreased. Based on these findings， it can be concluded that Xiangsha Liujunzi Decoction exerts antibacterial and anti-inflammatory effects in the treatment of H. pylori-associated gastritis in multiple ways via multiple components and targets.

Key words∶Xiangsha Liujunzi Decoction; Helicobacter pylori-associated gastritis; network pharmacology; molecular docking; mechanism of action

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori， H. pylori）是胃黏膜感染最常見的革蘭氏陰性桿菌^［1］，其主要的致病機(jī)制是產(chǎn)生多種毒力因子，使宿主細(xì)胞內(nèi)信號通路失調(diào)，從而引起胃炎^［2］。H. pylori陽性的胃炎稱為幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎（H. pylori相關(guān)性胃炎），《京都全球共識報(bào)告》首次明確提出H. pylori相關(guān)性胃炎是一種傳染病，無論患者是否有癥狀都需要治療^［3］。目前經(jīng)典的H. pylori相關(guān)性胃炎治療多采用三聯(lián)或四聯(lián)的綜合西醫(yī)療法，但是隨著抗生素耐藥性的提升、重復(fù)感染和胃腸道副作用等問題，三聯(lián)療法和四聯(lián)療法的療效也不理想^［4］。而中醫(yī)藥在抑制與滅殺H. pylori方面具有耐藥性低、副作用小等優(yōu)勢^［5］，因此中醫(yī)治療H. pylori相關(guān)性胃炎成為該領(lǐng)域關(guān)注的熱點(diǎn)。

香砂六君子湯由黨參、白術(shù)、茯苓、甘草、陳皮、半夏、砂仁、木香八味藥組成^［6］。黨參可健脾補(bǔ)氣、白術(shù)可健脾去濕、茯苓可健脾養(yǎng)心、甘草可清熱解毒、陳皮可健脾順氣、半夏可燥濕化痰、砂仁可化濕醒脾、木香可健脾消食^［7］。研究表明，香沙六君子湯通過影響H. pylori相關(guān)性胃炎大鼠胃黏膜組織中TTLR2、TLR4、MAPK、p-P38和NF-κB的蛋白表達(dá)量和血清中TNF-α和IL-6的水平，從而對大鼠臨床癥狀及胃黏膜病理改變有所改善^［8］。然而，對于香砂六君子湯在H. pylori相關(guān)性胃炎治療中的藥物成分和作用機(jī)制尚不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一門基于人工智能和大數(shù)據(jù)時(shí)代藥物系統(tǒng)性的新學(xué)科^［9］，從系統(tǒng)角度和分子水平發(fā)現(xiàn)中藥的網(wǎng)絡(luò)靶點(diǎn)、多成分療法^［10-11］，從而進(jìn)一步闡述中藥的作用機(jī)制^［12］。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)，分析香砂六君子湯治療H. pylori相關(guān)性胃炎的有效活性成分及作用機(jī)制，為臨床治療H. pylori相關(guān)性胃炎提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 細(xì)胞株與菌株

人胃黏膜上皮細(xì)胞（GES-1）購于中國北納創(chuàng)聯(lián)生物公司，H. pylori國際標(biāo)準(zhǔn)菌株Hp26695由山東大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系孫允東教授惠贈(zèng)。

1.2 藥物及主要試劑

香砂六君子湯（丸）（仲景宛西制藥股份有限公司，批號Z41021828）;DMEM培養(yǎng)基（美國Hyclone公司，批號AH29882654）；胎牛血清（武漢普賽諾公司，批號SA220119）；吉姆薩染液（北京索萊寶科技公司，批號20160316）；4%多聚甲醛（武漢賽維爾生物科技公司，批號CR2103050）；CCK-8試劑盒（北京索萊寶科技公司，批號316R012）；DMSO（美國Sigma公司，批號710NO313）；一抗GADPH（武漢三鷹技術(shù)有限公司，批號00109152）；二抗HRP標(biāo)記羊抗兔抗體（武漢三鷹技術(shù)有限公司，批號00109152）；一抗STAT3單克隆抗體（美國Abcam公司，批號GR3220487-3）；p-STAT3單克隆抗體（美國Abcam公司，批號GR3378496-1）；ECL超敏發(fā)光液（上海雅酶生物科技有限公司，批號01631200）。

1.3 主要儀器

電泳儀、電泳槽、電轉(zhuǎn)槽、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；熒光倒置顯微鏡（尼康株式全社）；V-500H可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；二氧化碳孵育箱（益世科（江蘇）生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 獲取香砂六君子湯活性成分及其靶點(diǎn)

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform， TCMSP），檢索香砂六君子湯各成分（黨參、白術(shù)、茯苓、甘草、陳皮、半夏、木香、砂仁）的活性化合物。以藥物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，化合物類藥性（drug likeness，DL）≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，篩選檢索到的活性成分。在TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢藥物活性化合物所對應(yīng)的蛋白靶點(diǎn)。再利用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫查找藥物作用蛋白靶點(diǎn)對應(yīng)的基因靶點(diǎn)。

2.2 篩選香砂六君子湯治療H. pylori相關(guān)性胃炎潛在靶點(diǎn)

以“Helicobacter pylori associated gastritis”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https：//www.genecards.org/）查找H. pylori相關(guān)性胃炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)。并與香砂六君子湯的活性成分靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，獲取交集靶點(diǎn)，即香砂六君子湯治療H. pylori相關(guān)性胃炎的潛在作用靶點(diǎn)。利用Venny 2.1 （https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）軟件繪制藥物與疾病的交叉基因維恩圖。

2.3 構(gòu)建藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

通過Cytoscape 3.8.0軟件構(gòu)建藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霁@得香砂六君子湯治療H. pylori相關(guān)性胃炎的關(guān)鍵藥物活性成分。

2.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（https：//string-db.org/）數(shù)據(jù)庫中，進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction， PPI）分析并將文件以“tsv”格式保存。運(yùn)用Cytoscap3.8.0軟件進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

2.5 基因富集分析

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行基因本體（gene ontology， GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，并運(yùn)用微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）對富集程度前10的GO富集條目以及前20的KEGG富集通路進(jìn)行數(shù)據(jù)可視化處理。

2.6 構(gòu)建潛在靶點(diǎn)-BP-CC-MF-KEGG網(wǎng)絡(luò)

通過Cytoscape 3.8.0軟件對藥物潛在靶點(diǎn)、GO功能分析中的生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）、細(xì)胞組成（cellular component，CC）進(jìn)行富集分析以及KEGG富集分析，構(gòu)建潛在靶點(diǎn)-BP-CC-MF-KEGG網(wǎng)絡(luò)。

2.7 分子對接驗(yàn)證

將PPI圖中排名前3的靶基因和藥物成分進(jìn)行分子對接，從Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/）中下載蛋白結(jié)構(gòu)，應(yīng)用AutoDockTools軟件對靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行加氫、去水處理后進(jìn)行分子對接，將對接結(jié)果導(dǎo)入到

PMOL軟件中進(jìn)行可視化分析。

2.8 細(xì)胞培養(yǎng)、造模及分組給藥

將GES-1胃黏膜細(xì)胞按30萬個(gè)接種于6孔板中，用DMEM完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清（FBS））進(jìn)行培養(yǎng)，并分為對照組、模型組和香砂六君子湯低、中和高質(zhì)量濃度（10、20、100 μg/mL）給藥組，香砂六君子湯給藥組使用相應(yīng)的藥物濃度預(yù)先處理細(xì)胞，置于37 ℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中過夜至細(xì)胞融合率達(dá)70%～80%。收集H. pylori，用完全培養(yǎng)基DMEM重懸后按感染復(fù)數(shù)100∶1加入細(xì)胞中，香砂六君子湯繼續(xù)給藥處理，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，中間換液。對照組不與H. pylori共培養(yǎng)，對照組和模型組不加藥。

2.9 CCK-8檢測細(xì)胞活性

在96孔板中細(xì)胞接種，37 ℃、5% CO₂培養(yǎng)箱中過夜，然后向每孔加入10 μL CCK-8試劑，放置CO₂培養(yǎng)箱中孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光值。

2.10 吉姆薩染色

將6孔板中各組細(xì)胞處理48 h之后，棄原培養(yǎng)基，無菌PBS（phosphate buffer saline，磷酸緩沖鹽溶液）緩沖液洗滌細(xì)胞3次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，室溫固定細(xì)胞15 min。然后棄去4%多聚甲醛，室溫靜置使其充分揮發(fā)。用無菌PBS緩沖液按適當(dāng)比例稀釋吉姆薩原液，將稀釋好的吉姆薩染液加到6孔板中，室溫靜置30 min后，用緩慢的流水將染液洗掉，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.11 蛋白印跡檢測靶蛋白表達(dá)

首先制備蛋白裂解液，提取細(xì)胞蛋白。通過BCA法（bicinchoninic acid assay）將每組蛋白定量，然后將蛋白用4×SDS-PAGE Loading buffer、RNase-Free Water混勻，在100 ℃的水浴鍋中煮10 min。將等量的蛋白質(zhì)在8%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳并電轉(zhuǎn)到PVDF膜（polyvinylidene fluoride，聚偏二氟乙烯膜）上。用10%的奶粉封閉液封閉2 h，之后加入相應(yīng)的一抗4 ℃孵育過夜，次日TBST洗膜3次，加入二抗孵育2 h，TBST洗膜3次。PVDF膜加ECL化學(xué)發(fā)光顯影后，保存照片并用Image J進(jìn)行灰度值分析。

2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏離（x±s）顯示；通過t檢驗(yàn)可以進(jìn)行二組之間的對比，在多組組之間進(jìn)行單因方差分析；Plt;0.05認(rèn)為差異存在統(tǒng)計(jì)價(jià)值。

3 結(jié)果

3.1 香砂六君子湯活性化合物及藥物作用靶點(diǎn)的篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫對黨參、白術(shù)、茯苓、甘草、陳皮、半夏、砂仁、木香的藥物活性化合物按照OB≥30%和DL≥0.18的檢索條件進(jìn)行檢索，共得到169種藥物活性化合物。刪除無效值和重復(fù)值后，最終獲得135種藥物活性化合物，黨參、白術(shù)、茯苓、甘草、陳皮、半夏、木香、砂仁的主要有效活性成分見OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附表1，其中有7種為多藥物共有成分（表1）。運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫查詢135種藥物活性化合物所對應(yīng)的藥物作用靶點(diǎn)蛋白，共獲得2 397個(gè)，合并重復(fù)后共保留262個(gè)藥物作用靶點(diǎn)蛋白。

3.2 香砂六君子湯治療H. pylori相關(guān)性胃炎潛在靶點(diǎn)的篩選

從GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索共獲得H. pylori相關(guān)性胃炎相關(guān)靶點(diǎn)800個(gè)。將H. pylori相關(guān)性胃炎相關(guān)疾病靶點(diǎn)與香砂六君子湯的活性成分作用靶點(diǎn)應(yīng)用Venny軟件進(jìn)行分析，最終獲得101個(gè)交集靶點(diǎn)，作為香砂六君子湯治療H. pylori相關(guān)性胃炎的潛在靶點(diǎn)（OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1）。

3.3 活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

將3.1中135種藥物活性化合物所對應(yīng)的藥物作用靶點(diǎn)與101個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行比對篩選，刪除無對應(yīng)靶點(diǎn)的藥物活性化合物13個(gè)，將最終剩余的122個(gè)藥物活性化合物與101個(gè)潛在靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)集導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，建立藥物-化合物-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖（OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2）。

3.4 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PPI分析，得到96個(gè)節(jié)點(diǎn)、449條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)（OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖3）。PPI網(wǎng)絡(luò)圖中degree值≥20的節(jié)點(diǎn)共有10個(gè)，由大到小分別為轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、腫瘤抑制因子p53（TP53）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、二聚化蛋白2（JUN）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）。

3.5 GO和KEGG通路富集分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，GO功能富集分析后得到BP 534個(gè)、CC 56個(gè)、MF 91個(gè)。根據(jù)Plt;0.01，選取BP、CC和MF排名前10的富集條目（OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖4）。KEGG通路富集分析獲取109條通路，結(jié)果顯示，香砂六君子湯治療H. pylori相關(guān)性胃炎的關(guān)鍵通路主要涉及癌癥相關(guān)通路、Toll樣受體信號通路、TNF信號通路、T細(xì)胞受體信號通路、Nod樣受體信號通路、P53信號通路等（OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖5）。

3.6 潛在靶點(diǎn)-BP-CC-MF-KEGG網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

通過Cytoscape 3.8.0軟件對藥物潛在靶點(diǎn)、GO功能分析中的BP、MF、CC富集分析以及KEGG富集分析構(gòu)建潛在靶點(diǎn)-BP-CC-MF-KEGG網(wǎng)絡(luò)（OSID附科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容圖6）。結(jié)果顯示，香砂六君子湯藥效靶點(diǎn)主要位于細(xì)胞外隙物質(zhì)和胞質(zhì)，并通過蛋白質(zhì)融合等多重結(jié)合方法參與了藥物反應(yīng)、細(xì)胞凋亡過程負(fù)調(diào)節(jié)、缺乏配體的細(xì)胞外源性凋亡信息通路等在內(nèi)的生物學(xué)過程。

3.7 分子對接分析

PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前3的靶點(diǎn)STAT3、TP53、AKT1與香砂六君子湯有效活性成分槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素進(jìn)行分子對接（表2）。結(jié)合自由能越低，表示活性化合物與靶蛋白的結(jié)合能力越好。圖1以3D圖的形式展示了靶點(diǎn)STAT3、TP53和AKT1分別與有效活性成分槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素的結(jié)合。

3.8 吉姆薩染色驗(yàn)證香砂六君子湯對H. pylori的體外抑制作用

如圖2所示，吉姆薩染色結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組的細(xì)胞數(shù)量明顯減少；而與模型組（H. pylori）相比，香砂六君子湯給藥組中的細(xì)胞數(shù)量有所增加，細(xì)胞形態(tài)趨于正常。

fected cells

3.9 香砂六君子湯對H. pylori感染GES-1細(xì)胞凋亡的影響

如圖3所示，與對照組相比，24 h和48 h后模型組GES-1細(xì)胞細(xì)胞活力明顯下降；與模型組（H. pylori）相比，香砂六君子湯（100 μg/mL）+H. pylori組細(xì)胞活力在給藥24 h和48 h后沒有差異；與模型組相比，香砂六君子湯（20 μg/mL）+H. pylori組在給藥24 h后細(xì)胞活力沒有差異，在給藥48 h后細(xì)胞活力有明顯差異；而與模型組相比，香砂六君子湯（10 μg/mL）+H. pylori組在給藥24 h和48 h后細(xì)胞活力都有明顯差異。

3.10 香砂六君子湯處理對H. pylori感染GES-1細(xì)胞中靶點(diǎn)蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，與對照組相比，模型組p-STAT3蛋白表達(dá)明顯升高；與模型組比較，香砂六君子湯低、中和高質(zhì)量濃度（10、20、100 μg/mL）給藥組的p-STAT3蛋白表達(dá)都有明顯的降低。

4 討論

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法分析了香砂六君子湯治療H. pylori相關(guān)性胃炎的有效成分135種及262個(gè)藥物靶點(diǎn)，其中，山柰酚和氨芐西林聯(lián)用時(shí)，能夠顯著降低氨芐西林的最小抑菌濃度，增強(qiáng)氨芐西林的抗菌活性，有較好的體外抗H. pylori的作用^［13］。槲皮素可以通過影響p38、MAPK、BCL-2和BAX水平來改善H. pylori感染引起的胃炎癥和凋亡^［14］。木犀草素具有抗氧化、抗炎、抗過敏、抗癌和降尿酸的作用^［15］。楊曉曄等^［16］研究發(fā)現(xiàn)木犀草素可以通過JAK/STAT信號通路來抑制胃癌細(xì)胞的增殖和凋亡。川陳皮素除了有抗癌、抗真菌、抗炎、抗癲癇作用，還具有抗血細(xì)胞凝集、抗血栓形成的作用^［17］。已有研究證明，川陳皮素通過降低H. pylori感染GES-1細(xì)胞中ROS的水平，從而增加細(xì)胞活力^［18］。

對香砂六君子湯作用靶點(diǎn)和H. pylori相關(guān)性胃炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集，得到潛在靶點(diǎn)109個(gè)，PPI網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)分析顯示香砂六君子湯可能通過STAT3、TP53、AKT1、TNF、JUN、MAPK1、MAPK3、IL-6等靶點(diǎn)蛋白起作用。分子對接的結(jié)果顯示，該藥的有效活性成分與H. pylori相關(guān)性胃炎的疾病靶點(diǎn)有很好的結(jié)合，其中STAT3、TP53、AKT1與香砂六君子湯有效活性成分槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素均有結(jié)合。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）是一種高度通用的信號蛋白和轉(zhuǎn)錄因子，在胃黏膜上皮轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要的作用，激活的STAT3與H. pylori相關(guān)性胃炎和人類癌癥進(jìn)展有關(guān)^［19］。H. pylori感染通過ROS積累誘導(dǎo)了STAT3的激活^［20］。TP53是一種抑癌蛋白，在H. pylori感染誘發(fā)胃癌發(fā)病機(jī)制中具有重要功能^［21］。AKT1即為蛋白激酶B（AKT）的同源異構(gòu)體，PI3K/AKT信號通路主要由PI3K、AKT及下游相關(guān)分子組成，PI3K/AKT信號通路在調(diào)控細(xì)胞增殖與細(xì)胞生長代謝方面發(fā)揮重要作用^［22］，H. pylori通過PI3K/AKT信號通路介導(dǎo)FoxO1/3a的活性來調(diào)控細(xì)胞凋亡^［23］。腫瘤壞死因子（TNF）家族指一組可以引起細(xì)胞死亡（凋亡）的細(xì)胞因子。TNF-α水平的升高可能在H. pylori感染的消化性潰瘍的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用^［24］，研究發(fā)現(xiàn)，感染H. pylori的個(gè)體中TNF-α等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)或血清水平明顯高于未感染的個(gè)體^［25］。Jun是一種原癌基因，有研究發(fā)現(xiàn)H. pylori感染后可能誘導(dǎo)Jun基因的激活，從而誘導(dǎo)相關(guān)炎癥的發(fā)生^［26］。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯(lián)激活是多種信號通路的中心，MAPK信號級聯(lián)會導(dǎo)致基因表達(dá)的改變。細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素1（IL-1）、白細(xì)胞介素8（IL-8）和TNF-α被認(rèn)為在H. pylori感染相關(guān)的炎癥和增殖反應(yīng)中發(fā)揮激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）作用^［27］。已有研究證實(shí)，H. pylori感染的胃組織中MAPK活化的水平高于正常胃組織。大量的研究已經(jīng)證實(shí)STAT3、AKT1、IL-6、TNF等靶點(diǎn)蛋白與H. pylori感染密切相關(guān)，表明本研究對香砂六君子湯對治療H. pylori相關(guān)性胃炎分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制的預(yù)測具有一定準(zhǔn)確性。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證香砂六君子湯對治療H. pylori相關(guān)性胃炎的有效性，本研究還進(jìn)行了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。首先通過吉姆薩染色和CCK-8活性檢測驗(yàn)證了在香砂六君子湯處理后，GES-1細(xì)胞受H. pylori感染的凋亡情況明顯改善。接著使用Western Blot對STAT3靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，H. pylori感染可以激活GES-1細(xì)胞中STAT3蛋白的表達(dá)。之后，觀察不同質(zhì)量濃度的香砂六君子湯處理H. pylori感染的GES-1細(xì)胞中STAT3蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，與H. pylori模型組相比，香砂六君子湯給藥組明顯降低H. pylori感染GES-1細(xì)胞中p-STAT3蛋白的表達(dá)水平。研究結(jié)果表明香砂六君子湯能有效改善胃黏膜上皮細(xì)胞受H. pylori誘導(dǎo)的凋亡影響，其作用機(jī)制可能與降低STAT3蛋白的磷酸化有關(guān)。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和部分體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，對中藥香砂六君子湯治療H. pylori相關(guān)性胃炎進(jìn)行了系統(tǒng)分析與驗(yàn)證，為香砂六君子湯治療H. pylori相關(guān)性胃炎的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

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