槲皮素對(duì)阿霉素所致腎病綜合征大鼠的保護(hù)作用及機(jī)制

摘要：探討槲皮素對(duì)腎病綜合征模型大鼠的保護(hù)作用。選用SPF級(jí)雄性大鼠，單次尾靜脈注射阿霉素6.5 mg/kg誘導(dǎo)腎病綜合征大鼠模型，收集尿液測(cè)定24 h尿蛋白，檢測(cè)血液生化血清總蛋白和白蛋白、總膽固醇、甘油三酯以及腎功能尿素氮和血肌酐的含量；HE染色觀察腎組織病理變化；透射電鏡觀察腎足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化；Western Blot檢測(cè)腎組織Desmin、Nephrin和Synaptopodin的表達(dá)。結(jié)果表明：槲皮素能有效緩解腎病綜合征模型大鼠的24 h尿蛋白，明顯改善各項(xiàng)血液生化指標(biāo)和腎功能損傷，減輕腎組織病理變化和腎足細(xì)胞的足突融合；同時(shí)，槲皮素可以降低Desmin的表達(dá)，并提高Nephrin和Synaptopodin的表達(dá)。槲皮素可有效治療阿霉素誘導(dǎo)的腎病綜合征模型大鼠，其可能通過(guò)穩(wěn)定足細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能發(fā)揮保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：槲皮素；腎病綜合征；阿霉素；蛋白尿；足細(xì)胞

中圖分類號(hào)：R965.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-4026（2023）04-0061-08

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)志碼（OSID）：

Protective effect and mechanism of quercetin on adriamycin-induced nephrotic syndrome in rats

SONG Zeyu，LI Zhenyuan，PAN Tao，MENG Xiangting，LI Song，DONG Hailun，F(xiàn)AN Huaying^*

（Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation，School of Pharmacy，Yantai University，Yantai 264005，China）

Abstract∶To investigate the protective effect of quercetin on nephrotic syndrome model rats. Specific Pathogen Free （SPF） male rats were selected， and a single tail vein injection of adriamycin 6.5 mg/kg was used to induce nephrotic syndrome in the rat model. Urine was collected to determine 24 h urine protein concentrations， and the contents of blood biochemical serum total protein and albumin， total cholesterol， triglyceride levels， and renal function markers （blood urea nitrogen and serum creatinine） were analyzed. The pathological changes in renal tissue were observed by hematoxylin and eosin staining. Transmission electron microscopy was used to examine the ultrastructure of renal podocytes. Western blot was used to detect the expression of desmin， nephrin， and synaptopodin in renal tissue. The results showed that quercetin effectively alleviated 24 h urinary protein in nephrotic syndrome model rats， significantly improved blood biochemical indicators and renal function injury， and alleviated pathological changes in renal tissue and the foot process fusion of renal podocytes. Simultaneously， quercetin can reduce the expression of desmin and increase the expression of nephrin and synaptopodin. Quercetin can effectively treat nephrotic syndrome model rats induced by adriamycin， and it may play a protective role by stabilizing the normal structure and function of podocytes.

Key words∶quercetin; nephrotic syndrome; adriamycin; urine protein; podocyte

腎病綜合征（nephrotic syndrome，NS）是腎內(nèi)科最常見(jiàn)的慢性腎病（chronic kidney disease，CKD），臨床上主要表現(xiàn)為大量尿蛋白、低白蛋白血癥、高脂血癥和水腫^［1］。有研究表明CKD患病率逐年上升，全球總患病率為14.3%^［2］，而中國(guó)患者高達(dá)10.8%^［3］。根據(jù)改善全球腎臟病預(yù)后組織（kidney disease： improving global outcomes， KDIGO）實(shí)踐臨床指南^［4］，目前主要采用糖皮質(zhì)激素類藥物進(jìn)行治療。但在長(zhǎng)期和大劑量使用此類藥物治療的過(guò)程中，往往會(huì)伴隨著嚴(yán)重的不良反應(yīng)^［5］，且還有部分患者存在對(duì)藥物治療無(wú)效的問(wèn)題^［6］，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。因此，尋找新的治療藥物和策略，以期提高治療NS的療效和減少治療過(guò)程中的不良反應(yīng)，對(duì)于臨床治療NS具有重要意義。

槲皮素是一種植物天然黃酮醇類化合物，廣泛存在于各種中草藥中^［7］，具有廣泛的藥理活性，包括抗氧化、抗炎、抗凋亡和抗纖維化等^［8］。近些年的研究表明^［9-10］，槲皮素可用于抗糖尿病、抗高血壓病和抗微生物感染等疾病的治療當(dāng)中，且可以通過(guò)減輕多種腎臟疾病中的腎毒性、細(xì)胞凋亡、纖維化和炎癥來(lái)保護(hù)腎臟^［7］，其在多種CKD的防治中有著廣泛的應(yīng)用。但槲皮素對(duì)NS是否有保護(hù)作用及其作用機(jī)制尚不清楚，因此，本研究以與臨床NS相似的阿霉素腎病大鼠模型為研究對(duì)象，探討槲皮素在NS中的有益作用及潛在機(jī)制，為槲皮素的臨床用藥和NS治療的新方法、新策略提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性的SD大鼠（sprague dawley）48只（180～220 g），購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育公司，合格證編號(hào)SCXK（魯）20190003。實(shí)驗(yàn)大鼠均在（24±1） ℃，濕度55%±5%的條件下飼養(yǎng)，給予足夠的飼料和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)過(guò)煙臺(tái)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（YTU20220523），實(shí)驗(yàn)方案嚴(yán)格按照煙臺(tái)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定設(shè)計(jì)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

全自動(dòng)血生化分析儀（美國(guó)雅培公司），ST16 型離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司），ImageQuant LAS 4000 型超靈敏化學(xué)發(fā)光成像分析儀（美國(guó)通用醫(yī)療有限公司），AE224C電子天平（上海舜宇恒平科技有限公司），低溫型研磨儀（武漢賽維爾生物科技有限公司），SpectraMax iD3型酶標(biāo)儀（美國(guó)Molecular Devices公司），透射電子顯微鏡（日本電子株式會(huì)社），大鼠代謝籠（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

槲皮素（純度≥98%）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；阿霉素（注射用鹽酸多柔比星）購(gòu)自深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司，批號(hào)2103E3，規(guī)格10 mg/支；醋酸潑尼松片購(gòu)自浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)210103，規(guī)格5 mg/片；BCA（bicinchoninic acid assay，二辛可寧酸測(cè)定）蛋白定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；Desmin、Nephrin和Synaptopodin多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組

適應(yīng)性飼養(yǎng)一周的SD大鼠48只，采用隨機(jī)對(duì)照表按照大鼠的體質(zhì)量隨機(jī)分為6組：正常對(duì)照組、模型組、6.3 mg/kg潑尼松組、25 mg/kg槲皮素組、50 mg/kg槲皮素組和100 mg/kg槲皮素組，每組8只。以上分組實(shí)驗(yàn)用的劑量均以藥物成分含量進(jìn)行計(jì)算設(shè)計(jì)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)造模及給藥

通過(guò)單次尾靜脈注射阿霉素6.5 mg/kg，正常對(duì)照組注射等體積生理鹽水。注射阿霉素當(dāng)日記為實(shí)驗(yàn)第1 d，第7 d時(shí)開(kāi)始給予潑尼松和不同劑量槲皮素灌胃。（1）正常對(duì)照組：以等體積0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液灌胃；（2）模型組：以等體積0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液灌胃；（3）潑尼松組：將醋酸潑尼松片溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中，配制成醋酸潑尼松混懸液，按照6.3 mg/kg的劑量灌胃；（4）25 mg/kg槲皮素組、50 mg/kg槲皮素組和100 mg/kg槲皮素組：將槲皮素溶于0.5%羧甲基纖維素鈉水溶液中，配制成10 mg/mL的槲皮素混懸液，按照大鼠的體重調(diào)整相應(yīng)的劑量灌胃。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 24 h尿蛋白含量測(cè)定

用大鼠代謝籠收集第3、7、14、21、28 d的24 h尿液。收集尿液后記錄尿量，并在1 000 g的條件下離心20 min，留取上清液，使用 BCA蛋白定量試劑盒對(duì)尿蛋白進(jìn)行定量。

1.3.2 血液生化和腎功能檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠稱重后麻醉，取大鼠腹主動(dòng)脈血液，靜置30 min，在1 000 g的條件下離心15 min，取上清液，用全自動(dòng)血生化檢測(cè)儀檢測(cè)血清總蛋白、白蛋白、總膽固醇、甘油三酯、尿素氮和血肌酐的含量。

1.3.3 腎組織病理學(xué)檢查

用動(dòng)脈夾將腎動(dòng)脈夾住后摘取大鼠雙側(cè)腎臟，將右側(cè)腎臟縱向切開(kāi)，一部分固定在4%多聚甲醛溶液中，梯度脫水，透明，浸蠟包埋制成組織蠟塊。經(jīng)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后觀察腎組織病理學(xué)形態(tài)變化。

1.3.4 腎組織超微結(jié)構(gòu)檢查

另一部分腎組織切取多個(gè)約1 mm³的立方體塊狀，固定在預(yù)冷的2.5% Gluta固定液（4 ℃）中。在2.5%戊二醛溶液、2%四氧化鋨溶液中依次固定，然后梯度脫水、包埋、切片。檸檬酸鉛和雙氧鈾對(duì)切片進(jìn)行染色后置于透射電鏡下觀察。

1.3.5 Desmin、Nephrin和Synaptopodin蛋白含量測(cè)定

取20 mg腎組織，加入250 μL RIPA裂解液，超聲破碎后于4 ℃、12 000 r/min條件下離心15 min，取上清液，BCA法進(jìn)行蛋白定量。每組蛋白樣品在10%SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉4 h，一抗于4 ℃過(guò)夜孵育。TBST洗膜3次，二抗于室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，最后超敏ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）來(lái)表示。采用One-way ANOVA進(jìn)行組間比較分析，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素對(duì)大鼠24 h尿液中尿蛋白定量的影響

槲皮素對(duì)大鼠尿蛋白定量的影響如表1所示。單次尾靜脈注射腎上腺素后，大鼠尿蛋白定量逐漸增加。實(shí)驗(yàn)第7 d，模型組和各給藥組大鼠尿蛋白定量顯著高于正常對(duì)照組（Plt;0.01）；經(jīng)藥物干預(yù)后，潑尼松、50 mg/kg槲皮素和100 mg/kg槲皮素可降低實(shí)驗(yàn)第14、21、28 d大鼠尿蛋白定量，顯著低于模型組（Plt;0.01），其中100 mg/kg槲皮素和潑尼松的降尿蛋白效果相當(dāng)。

2.2 槲皮素對(duì)大鼠血液生化指標(biāo)含量的影響

大鼠血液生化指標(biāo)如表2所示。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清總蛋白含量明顯下降（Plt;0.01），且血清白蛋白含量也明顯下降（Plt;0.01）；同時(shí)模型組大鼠還伴有總膽固醇含量明顯升高（Plt;0.01）以及甘油三酯含量明顯升高（Plt;0.01）。經(jīng)藥物干預(yù)后，潑尼松、50 mg/kg槲皮素和100 mg/kg槲皮素可顯著提高血清總蛋白和血清白蛋白含量，并降低總膽固醇和甘油三酯的含量；25 mg/kg槲皮素對(duì)血液生化指標(biāo)的改善效果不佳，與模型組比差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）。

2.3 槲皮素對(duì)大鼠血清尿素氮和血肌酐含量的影響

血清尿素氮和血肌酐是反應(yīng)腎功能的常用指標(biāo)，因此本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了大鼠血清中的尿素氮和血肌酐含量，進(jìn)而評(píng)估槲皮素對(duì)大鼠腎功能的影響，結(jié)果如表3所示。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠血清中尿素氮含量明顯升高（Plt;0.01），且血肌酐的含量也明顯升高（Plt;0.01）。與模型相比，潑尼松和100 mg/kg槲皮素明顯降低了尿素氮和血肌酐的水平。這表明100 mg/kg槲皮素可一定程度保護(hù)腎功能。

2.4 槲皮素對(duì)大鼠腎臟病理形態(tài)變化的影響

通過(guò)HE染色觀察槲皮素對(duì)大鼠腎組織病理形態(tài)變化的影響，結(jié)果如圖1所示。正常對(duì)照組腎組織結(jié)構(gòu)正常；經(jīng)腎上腺素注射后，模型組腎小管內(nèi)可見(jiàn)大量蛋白管型（圖中黑色箭頭所示），腎小管上皮細(xì)胞空泡樣變（圖中藍(lán)色箭頭所示），腎小管擴(kuò)張，且腎小球囊腔增寬（圖中紅色箭頭所示）；與模型組相比較，潑尼松組和100 mg/kg槲皮素組大鼠腎臟未見(jiàn)明顯病變，表明腎臟損傷得到明顯改善；25 mg/kg和50 mg/kg槲皮素對(duì)大鼠腎臟損傷改善效果不佳。

2.5 槲皮素對(duì)大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)變化的影響

為了評(píng)價(jià)槲皮素對(duì)大鼠腎組織中足細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響，通過(guò)電鏡觀察足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果如圖2所示。正常對(duì)照組足細(xì)胞足突結(jié)構(gòu)完整，突觸間隙清晰；模型組可見(jiàn)足突廣泛融合，突觸間隙消失（圖中黑色三角所示處為典型的足細(xì)胞融合區(qū)域）；與模型組相比，經(jīng)潑尼松干預(yù)后，足突融合明顯得到改善，且突觸間隙也較明顯；而不同劑量的槲皮素不同程度改善了足細(xì)胞足突融合的現(xiàn)象，其中100 mg/kg槲皮素的效果最佳。

2.6 槲皮素對(duì)大鼠腎組織Synaptopodin、Nephrin和Desmin蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步探討槲皮素對(duì)足細(xì)胞的影響，檢測(cè)了腎組織當(dāng)中Synaptopodin、Nephrin和Desmin蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖3所示。與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠Synaptopodin、Nephrin表達(dá)水平明顯降低，Desmin表達(dá)水平明顯升高；與模型組相比，各給藥組Synaptopodin、Nephrin表達(dá)水平呈現(xiàn)不同程度升高，Desmin表達(dá)水平呈現(xiàn)不同程度降低；其中以潑尼松組和100 mg/kg槲皮素組效果較好。

3 討論

阿霉素誘導(dǎo)的大鼠腎病模型是公認(rèn)的能較好模擬人類NS的模型^［11］。研究表明，阿霉素經(jīng)尾靜脈注射入大鼠體內(nèi)后能迅速分布到腎臟組織，一方面，在體內(nèi)產(chǎn)生活性氧，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)膜結(jié)構(gòu)和功能的破壞；另一方面，阿霉素能嵌入DNA而抑制RNA的合成，造成含有DNA、RNA的細(xì)胞器損傷，引起腎組織的代謝異常，最終導(dǎo)致大鼠出現(xiàn)與NS臨床相似的癥狀，即尿蛋白排泄增加、血清白蛋白和總蛋白降低以及血脂異常等^［12-13］。阿霉素由于其嚴(yán)重的消化道毒副作用，劑量過(guò)高常引起大鼠嚴(yán)重腹瀉，大鼠的死亡率較高。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)阿霉素的劑量做了探討，如5.5 mg/kg^［14］、6.0 mg/kg^［15］、6.5 mg/kg^［16］等，發(fā)現(xiàn)5.5 mg/kg的阿霉素劑量不能夠引起明顯的NS癥狀，而6.0 mg/kg和6.5 mg/kg的阿霉素便能很好地復(fù)制出NS大鼠模型。為了降低嚴(yán)重的毒副作用，本實(shí)驗(yàn)選擇了一次性尾靜脈注射6.5 mg/kg阿霉素復(fù)制大鼠NS的模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大鼠注射阿霉素后，24 h尿蛋白定量逐漸升高，血清總蛋白和白蛋白含量明顯降低，還伴隨總膽固醇和甘油三酯的含量異常升高，反映出模型大鼠出現(xiàn)血脂和血清蛋白異常；同時(shí)，尿素氮和血肌酐反映腎功能出現(xiàn)明顯異常，且腎臟病理顯示，模型組大鼠出現(xiàn)腎小管變性和擴(kuò)張、腎小管內(nèi)可見(jiàn)大量蛋白管型，以及腎小球囊腔增寬現(xiàn)象。以上結(jié)果符合臨床NS的特征和病理表現(xiàn)^［17］，表明阿霉素NS大鼠模型復(fù)制成功，可以進(jìn)行后續(xù)的槲皮素干預(yù)實(shí)驗(yàn)。槲皮素是一種植物類黃酮，廣泛存在于中草藥中，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗菌、抗纖維化等作用^［8］。已有研究報(bào)道槲皮素在治療慢性腎臟疾病方面是有效的^［7］，但槲皮素是否對(duì)腎病綜合征有治療作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)采用阿霉素成功復(fù)制出大鼠NS模型，經(jīng)藥物治療后，潑尼松顯示出良好的治療效果，不同劑量的槲皮素也對(duì)NS大鼠癥狀顯示出不同程度的緩解作用，其中以100 mg/kg的槲皮素治療效果最佳。應(yīng)用100 mg/kg槲皮素治療后，有效降低了大鼠24 h尿蛋白的排泄，伴有血脂和血清蛋白的異常也得到緩解，最終減緩了NS病理進(jìn)程的發(fā)展。

蛋白尿不僅是NS主要臨床特征，也是促進(jìn)疾病進(jìn)展快慢的危險(xiǎn)因素^［18］。近年來(lái)研究表明，漏出的蛋白尿可以導(dǎo)致腎小管、腎間質(zhì)等繼發(fā)性損傷，是腎小球?yàn)V過(guò)膜損傷的結(jié)果^［19］。足細(xì)胞、腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和腎小球基底膜共同構(gòu)成腎小球?yàn)V過(guò)屏障^［20］，而足細(xì)胞相鄰足突之間相互咬合構(gòu)成腎小球?yàn)V過(guò)膜最后一道屏障，當(dāng)足突結(jié)構(gòu)受損，大量大分子漏出形成蛋白尿^［21］。本實(shí)驗(yàn)中，阿霉素誘導(dǎo)的大鼠腎組織足細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)足突廣泛融合，突觸間隙明顯消失，這與Synaptopodin和Nephrin的表達(dá)異常有關(guān)。Synaptopodin和Nephrin分布于足細(xì)胞間的裂孔隔膜區(qū)域，維持足突結(jié)構(gòu)的正常功能，是腎小球?yàn)V過(guò)膜的主要成分^［22］。經(jīng)槲皮素治療后，大鼠腎組織中Synaptopodin和Nephrin表達(dá)均得到不同程度上調(diào)，恢復(fù)足突正常排列形態(tài)。同時(shí)，槲皮素有效抑制足細(xì)胞損傷標(biāo)志蛋白Desmin的表達(dá)。由此推測(cè)，槲皮素可以減輕足突融合，有效修復(fù)足細(xì)胞損傷，以此恢復(fù)腎小球?yàn)V過(guò)膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，發(fā)揮減少尿蛋白的作用。

綜上所述，槲皮素可有效緩解阿霉素誘導(dǎo)的大鼠NS癥狀，其中以100 mg/kg槲皮素的效果最佳。其作用機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)Synaptopodin和Nephrin，并降低Desmin的表達(dá)，穩(wěn)定足細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)和功能實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示槲皮素在治療NS方面有著廣闊的應(yīng)用場(chǎng)景，為臨床上治療NS的新策略和藥物開(kāi)發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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