“DNA片段的擴增及電泳鑒定”實驗探討

【摘要】人教版高中生物學新教材中“DNA片段的擴增及電泳鑒定”探究實驗相比舊教材有諸多處改動，在情境教學理論的指導下，越來越多的教師將單純的實驗課融合情境設計成為能夠解決具體生活問題的情境課堂。聚合酶鏈式反應（PCR）實驗技術廣泛應用于生命科學研究的各個領域中，但該實驗本身具有一定的操作難度。文章將結合相關文獻資料和實踐經驗對“DNA片段的擴增及電泳鑒定”這一探究活動中的常見問題進行剖析并提供技術優化策略。

【關鍵詞】生物教學；DNA片段；擴增；電泳鑒定；探討

【中圖分類號】G633.91【文獻標志碼】A【文章編號】1004—0463（2023）15—0102—06

人教版高中生物學新教材將“DNA片段的擴增及電泳鑒定”這一實驗調整到選擇性必修3·生物技術與工程中的第三章第二節“基因工程的基本操作程序”一節中，以培育轉基因抗蟲棉為具體情境，講述基因工程的操作程序，讓學生在情境中理解基因工程技術的應用。多聚酶鏈式反應（PCR）被用于目的基因的擴增，是生命科學研究中一項具有革命性的創舉，也被譽為生物學研究技術發展的里程碑。PCR實驗技術在生物學實驗室中被廣泛應用，是分子生物學研究的最主要實驗技術之一，但是在具體操作過程中，不同目的基因的擴增需要不同的實驗體系才能得到真實可靠的實驗數據和結果。因此，PCR實驗技術在操作上具有一定的難度，特別是對于高中教師來說，要想在一節實驗課課堂上得到較好的PCR實驗結果，需要實驗教師預先多次進行實驗，調整實驗體系和實驗條件，其中包括引物的設計和選擇、Taq酶的選擇、PCR循環程序的調整以及凝膠電泳條件的摸索等問題。新教材改革后，越來越多的教師也紛紛改進自己的教學方式，想通過更多具體的情境引導學生進行探究活動[1-3]，激發學生的探究興趣，并通過實驗解決具體問題，培養學生的探究能力和創新精神。“DNA片段的擴增及電泳鑒定”這一實驗在單純的講解過程中會顯得比較抽象和枯燥，但這一探究活動非常適合與生物科學問題相結合，利用該實驗技術解決相關問題，能夠讓學生動手參與并體驗科研探究活動，在實驗過程中培養學生的科學思維，讓學生深刻理解基因工程相關概念并領略現代科學的技術魅力。鑒于PCR實驗技術的操作具有一定難度，本文針對實驗中相關細節問題進行探討，希望能對教師的教學工作提供一些幫助和參考。

一、模板DNA的制備

1.模板DNA的種類。獲取模板DNA的思路有兩種，可以直接從細胞中提取基因組DNA，也可以先抽提細胞中的mRNA然后反轉錄成cDNA作為模板DNA。基因組DNA作為PCR模板通常用于目的基因的檢測以及突變的比較，而cDNA作為PCR模板通常用于目的基因相對表達量的分析研究。

2.模板DNA的制備方法。直接提取細胞中的基因組DNA，需要分以下三種情況：在中學生物實驗室，動物來源的DNA提取建議采用經典提取法，即苯酚/氯仿抽提法；植物來源的DNA建議采用CTAB法；微生物來源的DNA，如果需要提取質粒，可采用煮沸法、SDS裂解法、堿裂解法、Tri？ ton-溶菌酶裂解法等提取。如果需要提取真菌DNA，破除細胞壁是關鍵，通常采取酶解法破壁或以液氮冷凍法破壞細胞壁[4]。張瑾直接使用酵母菌懸液代替DNA模板溶液，省去了DNA提取這一步，雖然實驗結果可以看到條帶，但是條帶較寬且邊界模糊，因此模板DNA的純度會顯著影響實驗結果的呈現。若需要cDNA，為模板進行實驗，需要先提取細胞中的mRNA，常用的mRNA提取方法有TRIZOL法和CTAB法，這兩種方法對于動植物以及微生物均適用[5]。提取好的mRNA經過反轉錄后可得到cDNA，即可作為PCR實驗的模板。

綜上，依據實驗設計及實驗選材可選擇相應的模板制備方法，但在中學實驗室中，無論是提取基因組DNA還是提取細胞中的mRNA，最建議使用生物試劑公司相應的試劑盒完成DNA模板的制備，可以大大縮短制備時間并保證DNA模板的純度。

二、引物序列的獲取

引物是指人工合成的可以與模板DNA特異性結合，并引發新鏈合成的較短的DNA片段。在生物實驗室中，引物序列的獲取通常有兩種方法：自行設計引物或者使用其他研究已使用過的引物。引物的設計有諸多原則，因為引物的長度、含氮堿基C+G的含量、回文序列的存在等因素均會影響目的基因特異性擴增的效率，設計不合理的引物會導致非特異性擴增甚至PCR擴增失敗[7]。對于高中教師來說，自行設計引物難度較大，而且設計好的引物需要通過驗證才能用于正式實驗，因此設計引物這種方法并不適合在中學生物實驗室使用。更加方便快捷的方法是根據所要研究的目的基因，通過數據庫檢索或者文獻調研獲取其他研究人員已經使用過的引物序列。常用的引物數據庫有Primer Bank，可通過基因名稱直接檢索到相關引物序列。文獻調研可以通過中國知網、National Center for Biotechnology Information（NCBI）等網站檢索目的基因的相關研究，直接獲取引物序列。

三、PCR的反應體系

1.反應體系的體積。新教材中所提供的PCR反應體系是50μL，實際上PCR實驗的體系總體積從20μL到100μL都可以，而且20μL的反應體系在最后的瓊脂糖凝膠電泳鑒定中也能有很好的呈現效果，因此，教師可根據個人的實驗計劃調整反應體系的總體積，只要注意各個組分的終濃度在合理范圍內即可。由于PCR實驗反應體系體積較小，各試劑用微量，中學生又是第一次使用微量移液器，所以教師應多強調加樣的準確性。加樣順序遵循由多到少的原則，即先加體系中使用量最大的水，然后依次是擴增緩沖液、引物、模板等試劑。加樣完畢后需要在瞬時離心機上進行離心，避免試劑掛壁對反應造成影響。

2.反應體系的組分調整。反應體系中引物的量對實驗結果有顯著影響。引物濃度太低會造成產物量過少，而引物濃度過高會造成引物二聚體和非特異性擴增產物的產生。引物在體系中的終濃度范圍一般在0.1～0.5μmol/L[7]，如果預實驗結果不理想，可嘗試調整引物濃度。

反應體系中使用的Taq酶種類較多，一般情況下建議中學生物實驗室購買普通Taq酶即可。但是如果普通Taq酶擴增出的實驗結果不理想，可嘗試更換Taq酶解決問題。例如，瓊脂糖凝膠電泳顯示有雜帶，可選擇熱啟動Taq酶，這種酶具有更高的特異性和靈敏度；如果模板DNA是粗提取產物，或者提取的DNA模板純度不夠，甚至是酵母菌混懸液，建議使用具有高保真性的聚合酶。

反應體系中的模板用量也很重要，2007版的舊教材建議DNA模板用量是1 pg～1 mg，新教材中DNA模板用量修改為1 pg～1μg。實際上根據實驗室經驗，在PCR實驗中，DNA模板在純度較高的情況下，20μL的反應體系中1～200 ng的模板用量都能有較好的實驗結果。相關研究表明，反應體系中模板濃度低于300μg/mL時，可通過PCR獲得大量擴增產物；當模板濃度上升到300～800μg/mL時，PCR擴增產物的量明顯減少；當模板濃度高于800μg/mL時，很難獲得PCR產物。DNA模板的用量過高，會造成電泳條帶拖尾，甚至會產生抑制PCR的作用，可能的原因是模板濃度較高會導致引物的相對濃度降低，退火和復性時大量模板自身相互結合導致引物不能有效與模板結合，從而抑制PCR反應[7]。因此，在DNA模板純度較低的情況下可適當提高模板用量，在模板純度較高的情況下使用較少的模板用量即可。

四、PCR的循環程序

PCR的循環程序涉及預變性、變性、退火、延伸等多個步驟，表1的PCR反應循環參數是經過多次實踐優化后的程序設計，對絕大多數常見基因有良好的擴增效果，與教材提供的程序相比，該程序顯著縮短了反應時間。當然PCR反應程序并不是固定不變的，如果擴增效果不理想，生物學實驗室通常會根據不同DNA模板的長度以及C+G含量等因素對PCR循環程序進行微調。在對PCR循環程序進行調整的過程中，最常調節的是退火溫度。退火溫度的設定要依據引物的長度、濃度以及堿基組成等因素。適宜的退火溫度可以有效減少非特異性擴增的產生。一般情況下，較低的退火溫度可以提高PCR反應的敏感性但降低其特異性，而較高的退火溫度會提高 PCR反應的特異性但降低擴增效率。退火溫度通常設置范圍為45～55℃，適宜的退火溫度是引物的Tm值再降低5℃[7]。在中學生物實驗室中，若需要調整退火溫度，建議教師設計退火溫度梯度，PCR選取一個擴增效果最好的退火溫度即可；如果采用的引物是其他研究人員使用過的引物，直接采用文獻中的退火溫度即可。

五、瓊脂糖凝膠電泳及鑒定

1.瓊脂糖凝膠濃度的選擇。瓊脂糖凝膠電泳是檢測PCR產物最常見最便捷的方法，通過電泳可以鑒定出擴增產物的有無及大小。瓊脂糖凝膠電泳的原理：在堿性的電泳緩沖液中，線狀DNA雙鏈帶有凈負電荷，在電場力的作用下， DNA可以穿過瓊脂糖分子間的縫隙從負極向正極泳動，并且在凝膠中的遷移速率與DNA分子量大小成反比，即分子量越大的DNA分子遷移速率越慢。而一個固定堿基數目的線狀DNA，在不同濃度的瓊脂糖凝膠中的遷移速率不同。為了有效地將不同大小的DNA在電泳過程中分離開，需要選擇合適濃度的瓊脂糖凝膠，基本原則是DNA片段越小，選用的瓊脂糖凝膠濃度越大。中學生物實驗室可依據表2選擇適合擴增片段的瓊脂糖凝膠的濃度。

2.瓊脂糖凝膠的配制。瓊脂糖凝膠在配置過程中，需要在瓊脂糖溶液冷卻至60℃時加入核酸染料，市面上所售的常見核酸染料有：EB（溴化乙錠）、GoldView、GelGreen和SYBR Green等。對于中學實驗室來說，幾種核酸染料的靈敏度差異不大，都能滿足相關實驗需求。主要差異在于安全性和價格上，比較廉價的EB和GoldView生物毒性較大，而價格較高的GelGreen和SYBR Green毒性相對較低。無論是使用哪種核酸染料，在實驗中教師一定要強調在制膠和手持膠的過程中是需要佩戴一次性PE手套防止核酸染料滲入皮膚，以保證學生的安全。瓊脂糖凝膠配置的步驟也需要注意將溫熱的瓊脂糖溶液迅速倒入模具，并插入大小合適的梳子，以形成凝膠孔，這樣的操作順序容易使制備的凝膠在上樣孔處形成較多氣泡，從而影響條帶形狀。根據生物實驗室的實際操作經驗以及PCR理論與技術的指導，應該是先在水平桌面上放置好制膠模具并架好梳子，待熔化好的瓊脂糖溶液冷卻至60℃時將其倒入模具，并用牙簽排掉溶液中的氣泡。

3.電泳的條件。瓊脂糖凝膠電泳時，加樣孔位于電泳槽負極（一般黑色為負極）一側，電壓設置是根據擴增片段的大小來調整，擴增片段分子量越大，可適當上調電壓。例如，200～400bp的PCR產物使用50V電壓，電泳時間20～40分鐘。需要注意的是，電壓越大，電泳速度越快，過快的電泳速度容易使條帶產生變形，因此不能為了縮短電泳時間而施加過大的電壓。電泳時間長短是通過觀察載樣緩沖液藍色條帶的位置來確定。

六、實驗結果的分析方法

根據高中生物實驗課程的相關實驗設計，通常PCR凝膠電泳的結果分析可以分為兩大類：定性分析和半定量分析。兩種分析都需要進行凝膠電泳條帶的觀察和判讀。實驗中向瓊脂糖凝膠中加入的核酸染料會與DNA分子結合，在紫外線的照射下可以觀察到與染料結合DNA分子會發出熒光，可以在暗室中直接用肉眼觀察實驗結果或者使用專門的拍照成像系統來記錄實驗結果。由于DNA電泳的遷移距離和片段大小之間的關系是非線性的（如圖1所示），因此無法直接通過距離來確定某個位置DNA片段的大小。對凝膠電泳條帶的判讀，通常情況下需要借助標記物marker，標記物marker與實驗樣品同時加入上樣孔進行電泳，電泳結束后，添加了標記物marker的泳道會分離出已知片段大小的DNA條帶。通過對照標記物marker的說明書，可以確定不同位置每個條帶的大小。將樣品擴增出的條帶與標記物marker進行比較，可以確定樣品中擴增出的片段大小，從而判讀該條帶是擴增出的目的條帶還是雜帶（如圖2所示）。

1.定性分析。定性分析是指觀察并判讀樣品泳道擴增出的條帶是否為目的條帶，判讀的主要依據是根據DNA片段的大小。因此，實驗前需要查閱相關文獻或在NCBI網站中確定目的基因片段的大小。由于引物的特異性，目的基因條帶所發出的熒光是比較亮的。所以，可以判讀在目的基因片段大小的相應位置是否有特異性擴增出現，從而作出目的基因有或無的定性分析。也有實驗不需要借助標記物marker來定性分析，例如遺傳學相關實驗，利用多個樣品中DNA擴增條帶出現的情況來分析樣品間的親緣關系。定性分析的應用廣泛，可使用該方法分析樣品來源個體的性別、目的基因是否表達、基因突變點的檢出以及病原體的檢測等問題。

2.半定量分析。樣品之間DNA的相對含量也可以進行比較，因為較高的DNA濃度會產生較亮的條帶，因此可以使用PCR瓊脂糖凝膠的電泳結果來進行半定量分析。通常半定量分析用于比較不同樣品間目的基因的相對表達量的高低。一般需要cDNA作為模板，即提取mRNA反轉錄得到cDNA后用于特異性擴增，這樣可比較不同樣品間目的基因的表達差異。半定量分析只能比較不同樣品間同一目的基因的相對表達量，并不能得到目的基因的絕對表達量，因此在實驗時還需要同時引入內參基因進行擴增。常用的內參基因是各類管家基因，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、β-肌動蛋白（β-actin）和微管蛋白（tubulin）等，這些管家基因是在所有細胞中表達非常穩定的基因，它們的產物是維持細胞基本生命活動所必需的，因此這些基因的本底表達量較高而且表達量幾乎不受實驗處理條件的影響。綜上，PCR實驗可以通過引入內參基因的表達來校正樣品細胞載量、上樣量以及加樣過程中產生的實驗誤差。使用Image J或者其他能夠測量圖片灰度值的軟件對瓊脂糖凝膠電泳條帶照片進行測量，得到各個條帶的灰度值，然后使用歸一化的數據處理方法，計算實驗組相比對照組的相對表達量，如表3所示。半定量分析的應用也較為廣泛，可以分析不同處理條件下目的基因的表達量變化，如分析不同光照強度下光合作用相關基因的表達情況；也可分析不同來源的樣本中同一基因的表達差異，如比較腫瘤組織和正常組織中原癌基因和抑癌基因的表達差異。

*相對表達計算公式為目的基因條帶灰度值/內參條帶灰度值，結果意為對照組、實驗組1和實驗組2中目的基因的表達量分別是內參的1.06倍、1.37倍和0.69倍。

**表達倍數計算公式為實驗組相對表達/對照組相對表達，結果意為實驗1和實驗2組目的基因的相對表達量分別是對照組的1.29倍和0.65倍。

七、電泳結果常見問題及策略

1.實驗組無擴增條帶。實驗組如果沒有擴增條帶出現，說明PCR反應失敗，建議按照下列因素順序逐一排查：一是檢查或更換引物，可利用BLAST檢查引物特異性或重新獲取另一對引物。二是檢查酶是否失活，引物是否降解，確保試劑保存在4℃（短時間保存）或-20℃（長期保存），實驗過程中試劑都置于冰上。三是反應體系配置有誤，需要重復實驗。

2.非特異性擴增（雜帶多）。一是引物特異性差，建議更換引物。二是PCR反應程序不夠優化。如果雜帶比目的條帶小，可通過提高退火溫度、降低循環數調整；如果雜帶比目的條帶大，可縮短延伸時間、降低循環數。三是更換Taq酶。

3.凝膠電泳條帶變形、拖尾或彌散。一是凝膠不均勻，沒有徹底熔化或者倒膠時凝膠已經有凝固現象，需重新制備凝膠。二是DNA模板保存及使用不當，出現降解，需重新制備DNA模板。

在新教材生物學課程標準的指導下，高中生物課堂更多地聚焦于培養學生的科學思維和科學探究能力，因此，實驗探究活動的重要性日益增加。“DNA片段的擴增及電泳鑒定”這一實驗在農業、醫學及環境科學等領域應用廣泛，教師可以充分利用本節實驗課，將實驗與生活情境相結合，指導學生利用實驗技術解決現實生活問題，加深學生對課本知識的理解，提升學生應用知識的能力，培養創新精神，進一步培養學生的社會責任素養，從而實現生物學課程培養目標。應用PCR實驗技術解決相關生活問題，需要嚴謹的實驗設計與熟練的實驗操作技術，本文將實驗中可能會遇到的疑難問題進行了探討與分析，希望能為教師的實驗教學提供相關參考和問題解決策略，為實驗的順利開展奠定基礎。

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編輯：張昀