細胞蠟塊抗酸染色在淋巴結結核診斷中的應用

【摘要】 目的：探討淋巴穿刺液細胞蠟塊抗酸染色在淋巴結結核診斷中的應用價值。方法：納入贛州市第五人民醫院2021年1月—2022年6月收治的100例疑似淋巴結結核患者。所有患者均采集淋巴結抽吸液標本，均行直接涂片及細胞蠟塊抗酸染色、瑞氏-吉姆薩染色、結核分枝桿菌培養，以結核分枝桿菌培養結果為金標準，比較不同方法診斷淋巴結結核的價值。結果：100例患者經結核分枝桿菌培養確診淋巴結結核38例（38.00%）。涂片抗酸染色法診斷準確度為73.00%，敏感度為34.21%，特異度為96.77%；細胞蠟塊抗酸染色法診斷準確度為85.00%，敏感度為78.95%，特異度為88.71%；瑞氏-吉姆薩染色法診斷準確度為83.00%，敏感度為73.68%，特異度為88.71%。以上三種方法與金標準的一致性Kappa值分別為0.351、0.680、0.634。結論：淋巴結穿刺液細胞蠟塊抗酸染色法在淋巴結結核診斷中具有較高的診斷效能，相較于傳統的涂片抗酸染色法、瑞氏-吉姆薩染色法，其診斷準確度更高。

【關鍵詞】 淋巴結結核 臨床診斷 細胞蠟塊技術 抗酸染色法 細胞學

Application of Acid-fast Staining of Cell Wax Block in the Diagnosis of Lymph Node Tuberculosis/PENG Haiying， ZENG Jiang， LAI Xiaoju， ZHANG Runlan. //Medical Innovation of China， 2023， 20（22）： -138

[Abstract] Objective： To explore the the value of acid-fast staining of cell wax block in lymphopuncture fluid in the diagnosis of lymph node tuberculosis. Method： A total of 100 patients with suspected lymph node tuberculosis admitted to the Fifth People's Hospital of Ganzhou from January 2021 to June 2022 were included. Lymph node aspiration fluid samples were collected from all patients， and all of them underwent direct smear and cell wax block acid-fast staining， Wright's-Giemsa staining and Mycobacterium tuber-culosis culture. Taking the result of Mycobacterium tuber-culosis culture as the gold standard， the value of different methods in the diagnosis of lymph node tuberculosis were compared. Result： Among 100 patients， 38 cases （38.00%） were diagnosed as lymph node tuberculosis by Mycobacterium tuber-culosis culture. The diagnostic accuracy， sensitivity and specificity of smear acid-fast staining respectively was 73.00%， 34.21% and 96.77%. The diagnostic accuracy， sensitivity and specificity of cell wax block acid-fast staining diagnostic respectively was 85.00%， 78.95% and 88.71%. The diagnostic accuracy， sensitivity and specificity of Wright's-Giemsa staining respectively was 83.00%， 73.68% and 88.71%. The consistency Kappa values between the above three methods and the gold standard respectively was 0.351， 0.680 and 0.634. Conclusion： The acid-fast staining of cell wax block of lymph node aspiration fluid has higher diagnostic efficacy in the diagnosis of lymph node tuberculosis， compared with the traditional smear acid-fast staining and Wright's-Giemsa staining， the diagnostic accuracy is higher.

[Key words] Lymph node tuberculosis Clinical diagnosis Cell wax block technique Acid-fast staining method Cytology

First-author's address： The Fifth People's Hospital of Ganzhou， Jiangxi Province， Ganzhou 341000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.22.032

淋巴結結核是指結核分枝桿菌在淋巴系統內存儲、繁殖而形成的淋巴感染，常見于頸部，好發于兒童及青少年，臨床表現為淋巴結腫大，或伴疼痛、發熱等癥狀，隨著病情進展可能導致多發淋巴結受累，且該病晚期預后較差，因此需早發現、早診斷、早治療[1-3]。臨床診斷方法包括組織活檢、結核分枝桿菌培養等，由于組織活檢具有創傷性，結核分枝桿菌培養耗時長且成本較高，導致應用受限。因此需尋找更便捷、實用且準確度較高的檢查方法?？顾崛旧ㄊ墙Y核疾病的常見檢查手段，將采集標本直接涂布于載玻片固定后染色，但直接涂片導致抗酸桿菌的聚集性相對較差，陽性率相對較低[4-6]。細胞蠟塊技術即采用蠟液包埋的方式將體液、痰液、組織細胞等標本制成細胞蠟塊，可有效保存細胞成分，且可相對提高細胞聚集性，提高檢出率。近年來，細胞蠟塊技術廣泛應用于細胞病理學診斷中，如胸腹水、子宮頸癌及其他婦科疾病中均有學者證實細胞蠟塊技術有顯著應用價值，其特異度和準確度均較高，值得臨床推廣應用[7-10]?；诖耍狙芯恐荚谔接懠毎瀴K技術聯合抗酸染色法在淋巴結結核診斷中的應用價值，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取贛州市第五人民醫院2021年1月—2022年6月收治的100例行淋巴結穿刺檢查的患者。（1）納入標準：①疑似淋巴結結核：根據患者臨床癥狀、病史等進行綜合計分，觸診可見成堆淋巴結、實驗室檢查顯示結核抗體陽性或結核菌素試驗陽性、X線顯示活動性肺結核、出現竇道均計2分，淋巴結腫大數量gt;3個、多部位出現淋巴結腫大、具有發熱、盜汗等臨床癥狀、年齡30歲以下均計1分，綜合得分gt;5分考慮為淋巴結結核[11]；②行淋巴結穿刺檢查；③臨床資料完整。（2）排除標準：①腫瘤性淋巴結病變；②檢查前已進行抗結核或手術治療。其中男37例，女63例；年齡19～67歲，平均（43.11±7.86）歲；病程2～4周，平均（3.11±0.28）周；病變部位：頸部78例、腋下13例、腹股溝9例。本研究已經通過本院醫學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 取材方法 局部消毒淋巴結腫塊，左手固定腫大淋巴結，采用10 mL一次性注射器和7號注射針頭刺入腫塊，負壓多方位抽吸取材1 mL，一式4份。

1.2.2 檢驗方法

1.2.2.1 涂片抗酸染色 以上標本，一份直接涂片行抗酸染色：抽取液直接涂于載玻片，采用石炭酸復紅溶液（5%）染色15 min，后采用5%酸性乙醇液脫色（3～5 s/次，共2次）至無色，水洗后加堿性美蘭復染5 min，后洗去多余染液，冷風吹干后采用中性樹膠封固，鏡下背景顯示藍色，抗酸桿菌顯示紅色。

1.2.2.2 細胞蠟塊抗酸染色 一份標本制成細胞蠟塊后再進行抗酸染色：采用玻片法制作細胞蠟塊，將淋巴結抽吸液標本推至玻片采用針尖將細胞聚集成團，使用95%酒精短暫硬化，再用10%的中性甲醛溶液固定30 min，輕刮取細胞團塊用濾紙包裹后置入包埋盒，浸入10%的中性甲醛溶液固定2 h，脫水后整齊放入裝有蠟液的浸蠟容器內包埋，再采用LEICA 2245切片機切片（厚5 μm），將石蠟切片貼附于載玻片后采用電熱恒溫箱65 ℃烤片20 min，使用松節油脫蠟（共2次，10 min/次），沖洗切片表面油性物后使用抗酸染色法進行染色處理。

1.2.2.3 瑞氏-吉姆薩染色 一份標本采用瑞氏-吉姆薩染色法進行染色：將抽吸液涂片，干燥后用10%的中性甲醛溶液固定，瑞氏-吉姆薩染液染色10～15 min后采用PBS溶液漂洗后沖洗數秒，常規封片，由專業病理科醫師采用顯微鏡觀察病變細胞學形態特征，鏡下見細胞核為藍色，細胞質為紅色。

1.2.2.4 結核分枝桿菌培養 一份標本使用氫氧化鈉溶液（40 g/L）處理后接種在結核分枝桿菌培養基內，環境溫度調為37 ℃，觀察4周，若結核分枝桿菌培養基斜面有結核分枝桿菌菌落生長則記為陽性，反之則為陰性。同時對非結核分枝桿菌、結核分枝桿菌復合群進行鑒定。

一次性注射器、包埋盒、載玻片、蓋玻片均購自江蘇世泰公司，染色液、羅氏培養管均購自珠海貝索生物技術有限公司。標本采集、細胞蠟塊制作、鏡檢、結核分枝桿菌培養均由同組專業病理醫師及檢驗師完成。

1.3 觀察指標及判定標準

抗酸染色結果判定標準：以100個油鏡視野為單元，單元內無抗酸桿菌判為（-）、可見1～9條抗酸桿菌判為（±）、可見10～99條抗酸桿菌判為（+）、可見100～999條抗酸桿菌判為（++）、可見≥1 000條抗酸桿菌判為（+++），（+）、（++）、（+++）均為陽性結果[12]。淋巴結結核分型：多見成熟型小淋巴細胞、原幼淋巴細胞增生，或可見少量類上皮細胞為1型；可見少量類上皮細胞及少量結核結節為2型；可見大量類上皮細胞及結核結節，或可見朗格罕巨細胞為3型；可見干酪樣壞死組織為4型；可見大量增生及纖維結締組織為5型[13]。

1.4 統計學處理

采用SPSS 20.0軟件進行數據統計分析。計數資料以率（%）表示，采用字²檢驗；各診斷方法與金標準結果的一致性分析采用配對四表格字²檢驗。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結核分枝桿菌培養結果

經結核分枝桿菌培養，100例患者中共檢出38例，其中頸部27例（71.05%）、腋下9例（23.68%）、腹股溝2例（5.26%）；陰性62例，其中46.77%（29/62）為非特異性淋巴結炎，38.71%（24/62）為壞死性淋巴結炎，14.52%（9/62）為肉芽腫性病變。

2.2 不同檢查方法結果比較

以結核分枝桿菌培養結果為金標準。涂片抗酸染色法陽性率為15.00%（15/100），漏診率為65.79%（25/38），誤診率為3.23%（2/62，2例診斷為淋巴結結核改變，最終證實均為非特異性淋巴結炎）。細胞蠟塊抗酸染色法陽性率為37.00%（37/100），漏診率為21.05%（8/38），誤診率為11.29%（7/62，7例診斷為淋巴結結核改變，最終證實4例為肉芽腫性病變、3例為壞死性淋巴結炎）。瑞氏-吉姆薩染色法陽性率為35.00%（35/100），漏診率為26.32%（10/38），誤診率為11.29%（7/62，7例均鏡下見類上皮細胞，診斷為淋巴結結核改變，最終證實3例為非特異性淋巴結炎、2例為壞死性淋巴結炎、2例為肉芽腫性炎）。上述三種檢測方法陽性率比較，差異有統計學意義（字²=14.376，Plt;0.05），其中細胞蠟塊抗酸染色法檢測的準確度最高，與金標準的一致性最好。見表1、2。

3 討論

淋巴結結核往往由肺結核繼發而來，好發于免疫力低下者，淋巴結最常見的部位是頸部。臨床表現為淋巴結增大、質硬、互不粘連且可移動的特點，隨著病情進展，結核灶破潰可引發感染，甚至遷徙至脊柱、關節等部位形成冷膿腫，嚴重危害患者生命健康[14]。因此，淋巴結結核一旦確診需及時予以規范治療以防止病情惡化。目前常以臨床病史結合病理活檢進行診斷，但病理活檢存在耗時長、費用貴的缺點，亟需一種診斷效能高、操作簡單、耗時短的檢測方法進行淋巴結結核的臨床診斷。

抗酸染色法以5%石炭酸復紅在加熱條件下染色可使分枝菌酸與石炭酸復紅牢固結合，不易脫色。目前抗酸染色法在臨床結核檢測中被廣泛應用[15-16]。本研究中細胞直接涂片抗酸染色法抗酸桿菌檢出率為15.00%、漏診率為65.79%、誤診率為3.23%，與陳中秀等[17]研究結果接近，說明直接涂片后染色陽性檢出率相對較低，容易造成漏診情況發生，可能因為：直接涂片的固定效果與標本中抗酸桿菌量有關，且惡性上皮細胞的極性較差，直接涂片中抗酸桿菌的聚集性相對較差，因此檢出率較低，漏診率較高。為解決這一問題，有學者提出集菌涂片，如楊劍鋒等[18]研究證實離心集菌涂片法可有效提高細菌檢出率，避免漏檢。

細胞蠟塊技術是將含脫落細胞體液、灌洗液或直接采用細針穿刺吸取的細胞液采用蠟液包埋制成細胞蠟塊，可將細胞成分保存在蠟塊中以判別細胞性質、類型。本研究中細胞蠟塊抗酸染色法中陽性率為37.00%，漏診率為21.05%，誤診率為11.29%，漏診率明顯低于直接涂片法。分析原因為：細胞質由Golgi體、核糖體、內質網、線粒體和代謝物等組成，是細胞染色的重要影響因素，細胞質變性可能導致細胞內容物溢出。細胞蠟塊技術有利于完整保存標本，降低標本中細胞質變性風險，且細胞蠟塊制作時采用針尖將細胞聚集成團，可增加細胞的聚集性，提高陽性檢出率，降低漏診率和誤診率[19-20]。相對而言，直接涂片法不利于抗酸桿菌成團聚集，且未經包埋的標本經反復沖洗、晾干可能破壞細胞質，不利于染色，導致檢出率較低，漏診率較高。此外，抗酸染色法也有局限性，因為奴卡菌、放線菌等在抗酸染色法中也顯示陽性結果，易造成誤診，導致診斷效能較低，故臨床檢驗中需注意鑒別結核菌與奴卡菌、放線菌等細菌。

為進一步研究細胞蠟塊技術在淋巴結結核診斷中的應用價值，本研究采用瑞氏-吉姆薩染色法對其中一份標本進行染色處理，其陽性率為35.00%，漏診率為26.32%，漏診率較細胞蠟塊抗酸染色法高。分析原因為：瑞氏-吉姆薩染色法是通過辨別細胞形態判斷淋巴結是否病變，不僅淋巴結結核會導致細胞形態改變，非特異度淋巴結炎、壞死性淋巴結炎等也可能導致細胞形態改變，如類上皮細胞不僅見于淋巴結感染結核分枝桿菌，還見于淋巴結炎性病變的細胞學變化之中，因此類上皮細胞改變對于結核分枝桿菌感染特異度較低。此外，淋巴結結核干酪型無特異性細胞學改變，與癌性等原因引起的壞死難以區分，導致準確度降低。因此，采用瑞氏-吉姆薩染色法檢測淋巴結結核病變時需注意區分鑒別壞死性淋巴結炎、非特異度淋巴結炎等病變。此外，該項技術的專業難度較高，考驗檢驗科人員的專業性，且受取材范圍、標本質量等因素的影響較大，導致出現誤診、漏診發生。

綜上所述，淋巴結穿刺液細胞蠟塊抗酸染色法在淋巴結結核診斷中應用價值顯著，相較于傳統的直接涂片抗酸染色法、瑞氏-吉姆薩染色法，診斷準確度更高。

參考文獻

[1]劉宇思，曹偉靈，胡必杰，等.臨床藥師參與1例淋巴結核患者個體化給藥的治療實踐[J].中國藥物應用與監測，2022，19（3）：169-172.

[2] GANCHUA S K C，WHITE A G，KLEIN E C，et al.Lymph nodes-The neglected battlefield in tuberculosis[J/OL].PLoS Pathog，2020，16（8）：e1008632.https：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32790739/.

[3] CHAI Q，LU Z，LIU C H.Host defense mechanisms against Mycobacterium tuberculosis[J].Cell Mol Life Sci，2020，77（10）：1859-1878.

[4]劉啟梁，雷美.首診誤診為淋巴結核的25例淋巴結惡性腫瘤原因分析[J].臨床誤診誤治，2020，33（1）：8-11.

[5]黃蓉飛，蔡瑋，樊元春，等.抗酸染色與熒光定量PCR檢測在淋巴結結核診斷中的應用[J].成都醫學院學報，2020，15（5）：630-633.

[6]張紅軍，楊巧娟，張海濤，等.EBUS-TBNA標本檢測熒光定量TB-PCR對縱隔淋巴結核的診斷價值[J].中華肺部疾病雜志，2020，13（2）：159-163.

[7]董小霞，安曉靜，劉炯，等.細胞蠟塊制作在婦科及非婦科液基細胞學中的應用[J].診斷病理學雜志，2020，27（9）：678-679.

[8]傅春玲，劉定榮，吳彤，等.液基細胞學及細胞蠟塊聯合免疫細胞化學檢測在胸腹水細胞病理診斷中的臨床價值[J].重慶醫學，2018，47（8）：1058-1060.

[9]顧維娜，俞吉霞，于偉.一種新型宮頸液基細胞學標本蠟塊的制作方法[J].臨床與實驗病理學雜志，2019，35（4）：488-489.

[10] SAQI A.The state of cell blocks and ancillary testing： past， present， and future[J].Arch Pathol Lab Med，2016，140（12）：1318-1322.

[11]陳孝平，汪建平，趙繼宗.外科學[M].9版.北京：人民衛生出版社，2018：282.

[12]楊平安，張芳.抗酸染色法聯合細針吸取細胞學在診斷淋巴結核中的臨床應用[J].寧夏醫科大學學報，2017，39（11）：1341-1344.

[13] GUPTA S，SHENOY V P，BAIRY I，et al.Diagnostic efficacy of Ziehl-Neelsen method against fluorescent microscopy in detection of acid fast bacilli[J].J Pak Med Assoc，2010，3（4）：328-329.

[14] ARDAIN A，DOMINGO-GONZALEZ R，DAS S，et al.Group 3 innate lymphoid cells mediate early protective immunity against tuberculosis[J].Nature，2019，570（7762）：528-532.

[15]李玉雪，柳曉金，王薇，等.改良抗酸染色法在檢測痰結核分枝桿菌中的應用[J].標記免疫分析與臨床，2018，25（7）：1070-1073.

[16]竇權利，周九鵬，楊元利，等.改良抗酸染色法檢測胸腔積液中結核分枝桿菌對結核性胸膜炎的診斷[J].昆明醫科大學學報，2017，38（9）：35-38.

[17]陳中秀，謝清波，周風榮.聚集沉淀涂片與直接涂片抗酸染色法檢測抗酸桿菌的應用比較[J].中國防癆雜志，2009，31（4）：225-226.

[18]楊劍鋒，鐘清蘭，熊熙.高濃度蛋白穿刺液直接涂片法與離心集菌涂片法鏡檢效果的研究[J].臨床輸血與檢驗，2017，19（5）：454-456.

[19]羅娟，王麗麗，閻紅琳，等.痰液細胞蠟塊在肺癌診斷中的應用[J].診斷病理學雜志，2020，27（3）：212-213，215.

[20]柯曉康，張清平，袁靜萍，等.細胞蠟塊診斷淋巴瘤18例[J].中國組織化學與細胞化學雜志，2020，29（2）：159-164.