HSV-tk基因和IL-12基因抑制VEGF的表達(dá)及對(duì)鼻咽癌荷瘤裸鼠模型放射增敏作用的實(shí)驗(yàn)研究

【摘要】 目的：研究HSV-tk基因和IL-12基因抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達(dá)對(duì)鼻咽癌荷瘤裸鼠模型放射增敏作用。方法：建立鼻咽癌荷瘤裸鼠模型，將42只成瘤鼠隨機(jī)分成IL-12組、IL-12+放射治療組、HSV-tk/GCV組、HSV-tk/GCV+放射治療組、IL-12+HSV-tk/GCV組、IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組、空白對(duì)照組、每組6只。采用瘤內(nèi)注射分別給予相對(duì)應(yīng)的重組腺病毒液（AdKDR-tk）、重組逆轉(zhuǎn)錄腺病毒液IL-12及生理鹽水，24 h后重復(fù)注射1次。次日起HSV-tk/GCV組、HSV-tk/GCV+放射治療組、IL-12+HSV-tk/GCV組、IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組連續(xù)10 d每天腹腔內(nèi)注射GCV 100 mg/（kg·d），連續(xù)10 d。各放射治療組第3周開(kāi)始給予6MV-X照射，每天2 Gy，連續(xù)5 d。治療結(jié)束后處死裸鼠，檢測(cè)裸鼠腫瘤質(zhì)量及腫瘤生長(zhǎng)抑制率，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腫瘤微血管密度及VEGF陽(yáng)性細(xì)胞灰度值。結(jié)果：IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組裸鼠瘤體質(zhì)量明顯低于IL-12組、IL-12+放射治療組、HSV-tk/GCV組、HSV-tk/GCV+放射治療組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率最高，達(dá)71.7%。IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組微血管密度均低于其他各組，VEGF陽(yáng)性細(xì)胞灰度值均高于其他各組（Plt;0.05）。結(jié)論：HSV-tk基因和IL-12基因聯(lián)合應(yīng)用在鼻咽癌荷瘤裸鼠模型放療中可抑制移植瘤的生長(zhǎng)，為鼻咽癌的放療產(chǎn)生增敏作用。

【關(guān)鍵詞】 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 鼻咽癌 放射治療 HSV-tk基因 IL-12基因

Experimental Study of HSV-tk Gene and IL-12 Gene Inhibiting VEGF Expression and Radiosensitization Effect on Nasopharyngeal Carcinoma Tumor Bearing Nude Mouse Models/ZHOU Yuhua， ZHU Qianyuan， ZENG Yougen， LI Baojin. //Medical Innovation of China， 2023， 20（19）： 0-027

[Abstract] Objective： To investigate the radiosensitization effect of HSV-tk gene and IL-12 gene on the expression of vascular endothelial growth factor （VEGF） in nasopharyngeal carcinoma tumor bearing nude mouse models. Method： A nude mouse model of nasopharyngeal carcinoma was established， and 42 tumor-forming mice were randomly divided into IL-12 group， IL-12 + radiotherapy group， HSV-tk/GCV group， HSV-tk/GCV + radiotherapy group， IL-12 + HSV-tk/GCV + radiotherapy group， blank control group， and 6 mice in each group. The corresponding recombinant adenopathy venom （AdKDR-tk）， recombinant retrograde adenopathy venom IL-12

and normal saline were given by intratumoral injection， and the injection was repeated once 24 hours later. From the next day， the HSV-tk/GCV group， the HSV-tk/GCV + radiotherapy group， the IL-12 + HSV-tk/GCV group， and the IL-12 + HSV-tk/GCV+radiotherapy group were intraderally injected 100 mg/ （kg·d） of GCV every day for 10 consecutive days. Each radiotherapy group was given 6MV-X irradiation at 2 Gy per day for 5 consecutive days starting from the 3rd week. After treatment， the nude mice were killed， the tumor quality and tumor growth inhibition rate were detected， and the tumor microvascular density and positive expression of gray value of VEGF positive cells were detected by immunohistochemical methods. Result： The tumor mass of nude mice in IL-12 + HSV-tk/GCV + radiotherapy group was significantly lower than those in IL-12 group， IL-12 + radiotherapy group， HSV-tk/GCV group and HSV-tk/GCV + radiotherapy group， with statistical significance （Plt;0.05）. The tumor growth inhibition rate of IL-12+HSV-tk/GCV + radiotherapy group was the highest， reaching 71.7%. The microvascular density and gray value of VEGF positive cells in IL-12 + HSV-tk/GCV + radiotherapy group were lower than those in other groups （Plt;0.05）. Conclusion： The combined application of HSV-tk gene and IL-12 gene can inhibit the growth of transplanted tumor in the nude mouse model of nasopharyngeal carcinoma， and produce sensitization for the radiotherapy of nasopharyngeal carcinoma.

[Key words] VEGF Nasopharyngeal carcinoma Radiotherapy HSV-tk gene IL-12 gene

First-author's address： Ji’an Third People's Hospital， Jiangxi Province， Ji’an 343000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.19.006

鼻咽癌在我國(guó)南方地區(qū)常見(jiàn)，病理以低分化、未分化鱗癌為主，放療是鼻咽癌的首選。近年來(lái)，立體適形放療、立體定向放療等放療新技術(shù)的應(yīng)用，但其5年生存率仍改善不明顯。隨著腫瘤生物治療學(xué)的快速發(fā)展，基因-放射治療研究正成為抗惡性腫瘤對(duì)放療敏感的新策略[1-4]。本實(shí)驗(yàn)探討HSV-tk基因結(jié)合IL-12基因治療鼻咽癌的基礎(chǔ)上聯(lián)合放射治療，通過(guò)HSV-tk基因結(jié)合IL-12基因通過(guò)阻止血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體（VEGFR）來(lái)抑制VEGF的表達(dá)，從而增強(qiáng)鼻咽癌放射敏感性，為進(jìn)一步開(kāi)展鼻咽癌生物基因放射治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

帶有HSV-tk基因的重組腺病毒（AdKDR-tk）及含IL-12基因重組逆轉(zhuǎn)錄腺病毒液由廣州醫(yī)科大學(xué)李寶金博士構(gòu)建并提供[5]。丙氧鳥(niǎo)苷（GCV）購(gòu)自Roche公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SCID荷瘤裸鼠模型小鼠，4～6周齡，雌雄不分，20～25 g，購(gòu)自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，SPF無(wú)菌條件下飼養(yǎng)，（25±5）℃，相對(duì)濕度40%～70%，自由攝取食物和水。S-P超敏試劑盒，DAB顯色試劑盒，蘇木素試劑盒，CD34抗體購(gòu)自Maixin-Bio公司。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的鼻咽癌細(xì)胞CNE-2，制成單細(xì)胞懸液，荷瘤裸鼠單側(cè)腋部皮下植入5×105（0.2 mL）CNE-2細(xì)胞，每日觀察瘤體生長(zhǎng)情況，以皮下結(jié)節(jié)直徑超過(guò)0.7 cm為成瘤標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.2 方法

取成瘤荷瘤裸鼠42只，隨機(jī)分成IL-12組、IL-12+放射治療組、HSV-tk/GCV組、HSV-tk/GCV+放射治療組、IL-12+HSV-tk/GCV組、IL-12+

HSV-tk/GCV+放射治療組、空白對(duì)照組，每組6只。IL-12組、IL-12+放射治療組癌灶內(nèi)注入重組逆轉(zhuǎn)錄腺病毒液IL-12 0.1 mL；HSV-tk/GCV組、HSV-tk/GCV+放射治療組癌灶內(nèi)注入重組腺病毒液AdKDR-tk 0.1 mL；IL-12+HSV-tk/GCV組、IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組癌灶內(nèi)注入重組腺病毒液AdKDR-tk和重組逆轉(zhuǎn)錄腺病毒液IL-12各 0.1 mL；空白對(duì)照組癌灶內(nèi)注射生理鹽水0.1 mL，24 h后重復(fù)注射1次。次日起HSV-tk/GCV組、HSV-tk/GCV+放射治療組、IL-12+HSV-tk/GCV組、IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組、分別在腹腔內(nèi)注射GCV 100 mg/（kg·d），連續(xù)10 d。IL-12+放射治療組、HSV-tk/GCV+放射治療組、IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組第3周開(kāi)始給予6MV-X照射，每天2 Gy，連續(xù)5 d。照射后繼續(xù)飼養(yǎng)2周，每天觀察荷瘤裸鼠腫瘤生長(zhǎng)情況。

1.3 觀察指標(biāo)與判定標(biāo)準(zhǔn)

（1）裸鼠瘤體質(zhì)量及腫瘤生長(zhǎng)抑制率。飼養(yǎng)2周后處死裸鼠，裸鼠體內(nèi)取出腫瘤稱其質(zhì)量。腫瘤生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式：腫瘤生長(zhǎng)抑制率=（1-治療組瘤重量/空白對(duì)照組瘤重量）×100%。（2）腫瘤微血管密度及VEGF陽(yáng)性細(xì)胞灰度值。腫瘤微血管密度檢測(cè)方法：CD34陽(yáng)性反應(yīng)物為淺棕至深棕色顆粒，分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞，采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)CD34標(biāo)記的腫瘤微血管密度[6]；VEGF陽(yáng)性細(xì)胞灰度值判定：以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照物，在胞核、胞膜或胞漿中呈現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性。對(duì)免疫免疫組化的切片，按照分析系統(tǒng)測(cè)定的要求進(jìn)行系統(tǒng)設(shè)置和操作，在20倍物鏡下，隨機(jī)測(cè)量100個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值（背景灰度值-實(shí)測(cè)灰度值），顏色越深，灰度值越小[7]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 12.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，多組間比較行方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組瘤體質(zhì)量及腫瘤生長(zhǎng)抑制率

HSV-tk/GCV+放射治療組、IL-12+HSV-tk/GCV組與IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組裸鼠瘤體質(zhì)量均較空白對(duì)照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組裸鼠瘤體質(zhì)量明顯低于IL-12組、IL-12+放射治療組、HSV-tk/GCV組、HSV-tk/GCV+放射治療組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05）。IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率最高，達(dá)71.7%。見(jiàn)表1。

2.2 各組腫瘤微血管密度及VEGF陽(yáng)性細(xì)胞灰度值

IL-12組、IL-12+放射治療組、HSV-tk/GCV組、HSV-tk/GCV+放射治療組、IL-12+HSV-tk/GCV組、IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組微血管密度均低于空白對(duì)照組（Plt;0.05）。IL-12+放射治療組、HSV-tk/GCV組、HSV-tk/GCV+放射治療組、IL-12+HSV-tk/GCV組、IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組VEGF陽(yáng)性細(xì)胞灰度值均高于空白對(duì)照組（Plt;0.05）。IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組微血管密度均低于其他各組，VEGF陽(yáng)性細(xì)胞灰度值均高于其他各組（Plt;0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

3 討論

腫瘤生物治療學(xué)相關(guān)研究在近年來(lái)取得了諸多進(jìn)展，目前已用于增加腫瘤治療效果的靶基因主要集中于p53、Survivin、sKDR、ElA、mda-7、94、TRAIL、VEGF、以及自殺基因CD，TK等多個(gè)基因[8-10]。盡管各種基因在腫瘤治療中頗具前景，但單獨(dú)應(yīng)用的效果欠佳，聯(lián)合治療策略應(yīng)用是當(dāng)下及今后腫瘤治療研究的趨勢(shì)[11]。

惡性腫瘤中VEGF及VEGFR的表達(dá)高低與腫瘤微血管密度相關(guān)密切。通過(guò)一系列生化反應(yīng)可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。目前鼻咽癌治療是以放療為主。腫瘤的輻射抗性是癌癥放療面對(duì)的難題，研究表明放療可阻止VEGF的表達(dá)，增加放療射線的殺傷力，增強(qiáng)放射敏感性[12-16]。鼻咽癌中VEGF表達(dá)率可達(dá)60%～80%，尋找影響鼻咽癌放療敏感性相關(guān)基因阻止VEGF的表達(dá)提高鼻咽癌的放療敏感性、降低其放療抵抗對(duì)改善鼻咽癌治療預(yù)后具有重要意義[17-18]。

自殺基因HSV-tk/GCV在腫瘤基因治療中應(yīng)用最為廣泛。利用HSV1-tk磷酸化GCV產(chǎn)生細(xì)胞毒性，從而殺傷腫瘤細(xì)胞。IL-12是腫瘤生物治療中的細(xì)胞因子，具有刺激NK細(xì)胞和T細(xì)胞的增殖活化，已用于多種腫瘤的臨床試驗(yàn)治療。前期研究發(fā)現(xiàn)AdKDR-HSV-tk可靶向表達(dá)于鼻咽癌血管內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)給予GCV可有效地破壞腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞。結(jié)合注射攜帶IL-12基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒可使鼻咽癌腫瘤局部IL-12基因長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤血管的破壞，促使腫瘤壞死退縮；本次研究通過(guò)HSV-tk基因結(jié)合IL-12基因通過(guò)阻止VEGFR抑制VEGF的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)鼻咽癌放射敏感性，通過(guò)檢測(cè)瘤體質(zhì)量、微血管密度、VEGF陽(yáng)性細(xì)胞灰度值，IL-12+HSV-tk/GCV+放射治療組與其他組比較，有明顯差異。說(shuō)明基因聯(lián)合應(yīng)用較單一應(yīng)用效果更好。下一步將深入探討HSV-tk基因結(jié)合IL-12基因在鼻咽癌放療中增敏作用的感性發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，為鼻咽癌的治療提供新的治療途徑。

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（收稿日期：2022-12-20） （本文編輯：田婧）