液相色譜-串聯質譜法測定白芍禁用農藥殘留

摘要：建立液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）同時測定白芍中29種禁用農藥殘留的分析方法。白芍粉末試樣經乙腈浸泡過夜后超聲波提取，采用固相萃取小柱凈化，經LC-MS/MS正離子模式掃描分析29種禁用農藥殘留。結果表明，29種禁用農藥的線性相關系數良好 （R2gt; 0.995 1），檢出限為0.000 1～0.030 0 mg/kg，定量限為0.000 3～0.090 0 mg/kg；在0.01～0.50 mg/kg的加標水平下，29種禁用農藥的回收率為66.8%～108.4%，相對標準偏差（n=6）為0.9%～12.3%。此方法成功應用于白芍質控樣品中29種禁用農藥的定性和定量分析，定性準確，定量結果在質控證書不確定度范圍內，適用于白芍中29種禁用農藥的殘留分析。

關鍵詞：液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）；白芍；芍藥（Patagonia lactiflora Pall.）；禁用農藥殘留；基質效應

中圖分類號：TS657.7" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）07-0130-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.07.023 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： A liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS） method was established for the simultaneous determination of 29 prohibited pesticide residues in the white peony. The white peony powder sample was soaked overnight in acetonitrile and extracted by ultrasound. The solid phase extraction column was used for purification， and 29 prohibited pesticide residues were analyzed by LC-MS/MS positive ion mode scanning. The results showed that the linear correlation coefficient of 29 prohibited pesticides was good （R2gt;0.995 1）， with a detection limit of 0.000 1～0.030 0 mg/kg and a quantitative limit of 0.000 3～0.090 0 mg/kg； at the spiked level of 0.01～0.50 mg/kg， the recovery rates of 29 prohibited pesticides were 66.8%～108.4%， and the relative standard deviation （n=6） was 0.9%～12.3%. This method had been successfully applied to the qualitative and quantitative analysis of 29 prohibited pesticides in the quality control samples of the white peony. The qualitative accuracy was accurate， and the quantitative results were within the uncertainty range of the quality control certificate. It was suitable for the residual analysis of 29 prohibited pesticides in the white peony.

Key words： liquid chromatography-tandem mass spectrometry （LC-MS/MS）； white peony； Patagonia lactiflora Pall.； prohibited pesticide residues； matrix effect

白芍為毛茛科植物芍藥（Patagonia lactiflora Pall.）的干燥根，是中醫臨床常用中藥之一。白芍具有活血化瘀、清熱瀉火、清熱解毒、安神、利尿、安胎、益氣補虛、生津止渴、止瀉止痢等多種潛在功能［1，2］。白芍為多年生宿根植物，喜溫暖濕熱，在種植過程中極易受到病蟲害的侵襲和雜草的威脅［3，4］，為確保白芍產量，農藥在白芍的種植過程中被廣泛使用防治病蟲害及清除雜草［5，6］，噴施的農藥在根部富集和殘留并進入人體，嚴重危害人類健康，同時白芍中農藥殘留也是影響其出口的重要原因之一，因此為嚴格控制白芍質量，建立白芍農藥殘留的檢測方法具有重要意義。

目前，國內外學者對白芍農藥殘留的檢測方法展開大量研究，如王倩等［7］建立氣相色譜-串聯質譜（GC-MS/MS）檢測方法，測定白芍、黃芪、貓爪草和山茱萸中69種農藥殘留；沈君子等［8］通過氣相色譜-質譜技術測定白芍總苷原料藥中22種有機氯類農藥殘留；汪桂鳳等［9］采用乙腈提取，凝膠滲透色譜凈化，氣相色譜-串聯質譜法測定白芍中10種有機磷農藥殘留；劉小勤等［10］采用固相萃取技術（SPE）結合氣相色譜-三重四極桿質譜（GC/MS-MS）建立白芍中99種農藥同時檢測的分析方法。上述文獻報道主要是針對白芍出口貿易中歐盟等農藥殘留要求而建立的分析方法，《中華人民共和國藥典》四部（2020版）在0212 藥材和飲片檢定通則中明確規定植物類中藥材及飲片禁用農藥不得超過定量限；在2341農藥殘留測定法第五法藥材及飲片（植物類）中禁用農藥多殘留測定法針對所有藥材及飲片，采用白芍基質匹配校準曲線完成白芍中禁用農藥殘留分析的方法報導較少；此外，液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）分析白芍等復雜基質中的農藥殘留，常需要考慮基質效應對檢測結果的影響，常見的補償基質效應方法包括優化前處理方法［11］、標準添加法［12］、同位素內標法［13］、優化設備條件［14］、校正因子校準法［15］、分析保護劑法［16］和基質標準溶液校正法［17］等。本研究采用白芍基質匹配校準曲線，一定程度上消除了基質效應對檢測結果的影響，應用LC-MS/MS分析技術建立白芍中29種禁用農藥殘留的分析方法，并通過質控樣品準確性和精密度的驗證，適用于白芍中29種禁用農藥殘留檢測分析，同時也為其他藥材的禁用農藥殘留分析提供借鑒。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

AB SCIEX API 3200三重四級桿液質聯用儀（美國AB SCIEX公司），3K15臺式高速冷凍離心機（德國Sigma公司），EVAP 112氮吹儀（美國Organomation associates公司），200 μL、1 mL移液槍（德國Eppendorf公司），電子天平（德國Sartorius公司），AS-30600BDT超聲波清洗儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 材料

固相萃取柱：Cleanert-TPT（1 000 mg，6 mL，天津博納艾杰爾科技有限公司）；離心管：50 mL；有機系濾膜：13 mm×0.2 μm；白芍質控樣品：批號MRM0889，北京美正檢測技術有限公司；白芍飲片基質樣（不含29種禁用農藥的空白樣，且試樣均勻性、性狀等經權威組織確認），批號Z2108001，石家莊以嶺中藥飲片有限公司；15個白芍試樣均由普洱市藥協會提供，經鑒定為毛茛科植物芍藥。

1.3 試劑及對照品

乙腈、甲酸、甲醇均為HPLC級，美國J.T.Baker；甲苯、乙腈均為分析純，西隴科學股份有限公司；乙腈與甲苯混合溶液（體積比為3∶1）；29種禁用農藥單標對照品溶液分別為甲胺磷、苯線磷、苯線磷砜、苯線磷亞砜、地蟲硫磷、治螟磷、克百威、3-羥基克百威、胺苯磺隆、甲磺隆、氯磺隆、硫線磷、氯唑磷、甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜、蠅毒磷、硫環磷、磷胺、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、久效磷、內吸磷、滅線磷、特丁硫磷砜、特丁硫磷亞砜、水胺硫磷、甲基異柳磷，濃度均為100 μg/mL，購自天津阿爾塔科技有限公司；29種禁用農藥混合對照品溶液，濃度為10～50 μg/mL，天津阿爾塔科技有限公司（產品批號1ST2986-A）。

2 試驗方法

2.1 液相色譜-串聯質譜條件

1）色譜條件。流動相A相為乙腈，流動相B相為0.1%甲酸水溶液；色譜柱：ZORBAX SB-C18，3.5 μm，100 mm×2.1 mm（內徑）；柱溫：40 ℃；流速400 μL/min；梯度洗脫程序見表1。

2）質譜條件。進樣量：10 μL；電離源模式：電噴霧離子化（正離子模式）；霧化氣：氮氣；霧化氣壓力：344.7 kPa；輔助加熱氣壓力（GS2）：413.7 kPa；電噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃。優化后的監測離子對、碰撞電壓（CE）如表2所示。

2.2 試樣前處理

2.2.1 試樣提取 取2.0 g試樣（飲片粉碎過3號篩）置于50 mL聚乙烯離心管中，加入20 mL乙腈浸泡過夜，超聲波30 min，4 000 r/min離心2 min，取10 mL上清液于玻璃試管中，置于50 ℃氮吹儀中緩慢濃縮至2 mL，得到試樣提取液。

2.2.2 試樣凈化 將試樣提取液轉移至經乙腈-甲苯混合溶液（體積比為3∶1）活化的TPT固相萃取柱中，以1 mL/min的速率過柱，用30 mL乙腈-甲苯混合溶液淋洗萃取柱，收集淋洗液于50 mL雞心瓶中，置于50 ℃旋轉蒸發儀中、14 000 kPa壓力下濃縮至近干，加1 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液（體積比為2∶8）定容到1 mL，過0.22 μm有機系濾膜后測定。

2.3 對照品溶液配制

2.3.1 單標對照品使用液 取1 mL 100 μg/mL單標對照品溶液于10 mL容量瓶中，分別加入甲醇、乙腈、正己烷稀釋，將其混勻后定容，配制成濃度為10 μg/mL的單標對照品使用液，0～4 ℃避光保存，供29種禁用農藥確定定量離子、定性離子和優化質譜條件使用。

2.3.2 混合對照品使用液 取1 mL 29種禁用農藥混合對照品溶液（批號1ST2986-A，濃度100 μg/mL）于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋、搖勻后定容，濃度為1～5 μg/mL，得到混合對照品使用液A，0～4 ℃避光保存，供配制基質混合對照品使用液和回收率測定使用。

取混合對照品使用液A用乙腈稀釋，濃度為10～500 ng/mL，得混合對照品使用液B，供評價待測農藥基質效應使用。

2.3.3 基質混合對照品使用液 根據試樣前處理方法分別處理6個白芍基質樣，在白芍基質制備液中分別加入0、10、20、40、80、100 μL 的混合對照品使用液A，在常溫下氮氣緩慢吹至近干，加入1 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液（體積比為2∶8）后定容到1 mL，過0.22 μm有機系濾膜，配制的基質混合對照品使用液濃度為10～500 ng/mL，現配現用，供白芍中29種禁用農藥定量分析使用。

3 結果與分析

3.1 試樣提取條件的優化

農藥殘留前處理中提取溶劑的選擇主要考慮待測農藥的極性和試樣的性質2個因素，首先，提取溶劑應符合相似相溶的原理，確保待測農藥在溶劑中能最大程度地溶解；其次，所選的溶劑對試樣有足夠的滲透性，充分滲入細胞內部將待測農藥提取出來。因此，本研究比較了《中華人民共和國藥典》四部（2020版）提取溶劑（丙酮、乙腈、乙酸乙酯）的提取效率，考察提取溶劑分別添加200 μL混合對照品使用液A（添加量0.10～0.25 mg/kg）后，29種禁用農藥的回收率情況。回收率由高到低依次為乙腈、乙酸乙酯、丙酮，乙腈的回收率為67.4%～113.5%，乙酸乙酯的回收率為58.2%～135.8%，丙酮的回收率為50.5%～147.8%，這可能是因為丙酮極性強，對部分極性弱的農藥提取效率低，同時提取出較多的雜質，導致部分農藥的回收率較高；乙酸乙酯對白芍中的油脂具有較好的溶解性，影響其回收率；以乙腈為提取溶劑時，29種農藥的回收率范圍最窄，因此本研究選用乙腈為提取劑。

3.2 試樣凈化條件的優化

目標分析物通過各種有效的凈化去除提取過程中的非待測組分，凈化條件的選擇根據基質的化學成分確定。白芍的化學成分主要為萜類、揮發油類、黃酮類化合物等［18，19］，其分子結構都有碳基、酯基、醚鍵等極性官能團。本研究選擇Cleanert TPT固相萃取柱（GCB-NH2-amide polystyrene復合柱）作為凈化柱，填充劑中的NH2、石墨化碳能有效去除干擾組分，滿足分析方法的要求；同時通過增大淋洗液體積至30 mL確保待測農藥在凈化過程中被充分洗脫，保證回收率。

3.3 方法的線性范圍和定量限

基質混合對照品使用液按照“2.1”項確定的儀器條件測定，以目標物的質量濃度C（ng/mL）為橫坐標，峰面積A為縱坐標繪制標準工作曲線，得回歸方程和相關系數，以空白試樣的3倍、10倍信噪比確定29種禁用農藥的檢出限和定量限，結果見表3。29種禁用農藥線性相關系數良好，相關系數R2為0.995 1～0.999 7，本方法的檢出限為0.000 1～0.030 0 mg/kg、定量限為0.000 3～0.090 0 mg/kg，均小于標準方法［2341農藥殘留測定法第五法藥材及飲片（植物類）中禁用農藥多殘留測定法］要求的定量限。

3.4 方法的準確度和精密度

取2 g粉碎的白芍飲片基質樣，分別添加20、100、200 μL混合對照品使用液，靜置30 min，使白芍粉末與混合對照品使用液充分接觸后，根據“2.2”項處理后，按“2.1”項的儀器條件進行測定。每個添加水平平行測定6次，計算29種禁用農藥的平均回收率（MR）和相對標準偏差（RSD），考察方法的準確度和精確度。由表4可知，在0.01～0.50 mg/kg加標水平下，29種禁用農藥的平均回收率為66.8%～108.4%，滿足《中華人民共和國藥典》四部（2020版）對平均回收率要求（平均回收率應在70%～120%，在滿足重復性要求的情況下，部分農藥平均回收率可放寬至60%～130%）；29種禁用農藥的相對標準偏差為0.9%～12.3%，滿足《中華人民共和國藥典》四部（2020版）中9012生物樣品定量分析方法驗證指導原則中精密度的要求（批內相對標準偏差一般不得超過15%，定量下限的相對標準偏差不得超過20%），說明方法具有較好的定量準確性和重復性。

3.5 實際試樣及質控樣品的測定

取2.0 g粉碎的白芍質控樣，根據“2.2”項處理后，按“2.1”項的儀器條件進行測定（平行測定5次），白芍質控樣品的色譜見圖1，29種禁用農藥定性準確，定量檢測結果在質控證書標準值區間范圍內，實測平均值、質控證書指定值以及不確定度范圍見表5，結果表明，該方法對白芍中29種禁用農藥殘留分析具有較強的適用性。

取2.0 g粉碎的白芍試樣，根據“2.2”項處理后，按“2.1”項的儀器條件完成15個批次的白芍試樣品檢測，未發現29種禁用農藥的陽性試樣，29種禁用農藥殘留量均滿足《中華人民共和國藥典》四部（2020版）中0212 藥材和飲片檢定通則對中藥材及飲片禁用農藥的要求，也可能由于本研究采樣的局限性，未能獲取白芍中29種禁用農藥的陽性試樣。

3.6 基質效應

采用LC-MS/MS分析復雜基質中目標組分，基質效應產生的主要原因是非目標分析物與目標物共同流出噴霧針，對電荷產生競爭，產生的霧滴牢牢吸在一起，阻止其分裂成更小的微滴，改變了帶電霧滴的表面張力，影響離子化效率，最終導致基質抑制效應或基質增強效應［20，21］，本研究分別采集混合對照品溶液B和基質混合對照品使用液系列濃度的相應值，并繪制校準曲線，MF=Y/X，其中，X和Y分別表示混合對照品溶液B標準曲線的斜率和基質混合對照品使用液的斜率。若MF=1表明不存在基質效應，MFlt;1表明存在基質抑制效應，MFgt;1表明存在基質增強效應。

29種禁用農藥在白芍基質中的基質效應見圖2，氯唑磷不存在基質效應；甲胺磷等15種禁用農藥存在基質增強效應；苯線磷等13種禁用農藥存在基質抑制效應。因此，為了降低或消除基質效應的影響，本研究用白芍空白基質匹配校準曲線來進行定量分析。

4 小結與討論

本研究建立液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS），同時測定白芍中29種禁用農藥殘留的分析方法。通過乙腈浸泡過夜后超聲波提取白芍粉末，Cleanert-TPT固相萃取小柱凈化，經LC-MS/MS正離子模式掃描分析29種禁用農藥殘留。經驗證，本研究方法成功應用于白芍試樣和質控樣品中29種禁用農藥的定性和定量分析；使用白芍飲片基質樣，補償了禁用農藥因基質效應導致的定量結果不準確問題。同時，本研究詳細論述了試樣前處理、基質效應等分析方法的關鍵控制點，適用于白芍中29禁用農藥的檢測分析，也為其他藥材禁用農藥殘留分析提供參考。

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