櫻桃病毒A實時熒光定量PCR檢測技術的建立與應用

摘要：在櫻桃病毒A（CVA） mp基因保守區域設計了3對檢測引物，經特異性篩選后，獲得可用于病毒定量研究的引物。制備質粒標準品，建立標準曲線，同時驗證該方法的靈敏度和特異性，并應用于田間果樹樣品CVA定量檢測。最終成功篩選出1對檢測效率高、特異性強的引物（CVA-dF2、CVA-dR2），基于SYBR Green I熒光染料建立反轉錄實時熒光定量PCR檢測CVA的方法。該方法重復性好、靈敏度高，無需借助內參基因即可準確檢測目的病毒載量，絕對定量標準曲線斜率為-3.574 6，決定系數R2為0.998 6，擴增效率為0.904 4，比常規RT-PCR檢測靈敏度高10倍。該方法的建立為CVA定量研究提供了有力工具，可用于果樹中CVA批量檢測或低豐度病毒樣品檢測。

關鍵詞：櫻桃病毒A（CVA） ；反轉錄實時熒光定量PCR；快速檢測

中圖分類號：S432" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）07-0163-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.07.028 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract：Three pairs of detection primers were designed in the conserved region of cherry virus A （CVA） mp gene. After specific screening， primers were obtained that could be used for virus quantitative research. Preparation of plasmid standards， and establishment of standard curves were conducted the sensitivity and specificity of this method， were verified and it is applied to the quantitative detection of CVA in field fruit tree samples. One pair of primers with high detection efficiency and strong specificity （CVA-dF2， CVA-dR2） was successfully screened， and a real-time reverse transcription fluorescence quantitative PCR method for detecting CVA was established based on SYBR Green I fluorescent dye. This method had good repeatability and high sensitivity. It could accurately detect the target viral load without the help of internal reference genes. The slope of the absolute quantitative standard curve was" " " " " "-3.574 6， the coefficient of determination R2 was 0.998 6， and the amplification efficiency was 0.904 4， which was 10 times higher than the sensitivity of conventional RT-PCR detection.The establishment of this method provided a powerful tool for quantitative research on CVA， which could be used for batch detection of CVA in fruit trees or detection of low abundance virus samples.

Key words： cherry virus A （CVA）； reverse transcription real-time fluorescence quantitative PCR； quick detection

櫻桃病毒A（Cherry virus A，CVA）屬于β線性病毒科（Betaflexiviridae）發狀病毒屬（Capillovirus）成員［1］，病毒基因組為正義單鏈RNA［2］，包含2個重疊的開放閱讀框（Open reading frame，ORF）［3］，ORF1編碼一個266 ku的多聚蛋白，經切割加工后產生與復制相關的蛋白和外殼蛋白，ORF2編碼運動蛋白，大小約52 ku［4］。1995年，CVA首次在德國栽培的甜櫻桃樹中被檢測到［5］，之后印度［6］、意大利［7］、匈牙利［8］、波蘭［9］、英國［10］、加拿大［11］、澳大利亞［12］、捷克共和國［13］、日本［14］和中國［15，16］相繼檢測到CVA侵染不同寄主植物。自然狀態下，CVA主要侵染櫻桃樹。有研究表明，CVA在櫻桃樹中的發生率一直保持在較高水平。2004年，日本學者Isogaid等［17］對5種櫻桃病毒進行了分子檢測，CVA檢出率高達92%；2015年，印度學者Noorani等［18］利用ELISA和RT-PCR對74份櫻桃樣品進行CVA檢測，發現了40份陽性樣品；同年，盧美光等［19］對中國部分地區櫻桃病毒病進行分子檢測，結果表明，CVA在遼寧省大連市、山東省泰安市和北京市均有分布，綜合發生率為40%；2020年，曲誠懷等［20］對山東省煙臺市牟平區甜櫻桃病毒病進行調查、檢測及鑒定，結果發現，40份樣品中CVA檢出率為45%。此外，杏樹、桃樹、李樹也是該病毒的自然寄主［21，22］。CVA主要依靠果樹枝條嫁接和營養繁殖進行傳播，自然界尚未發現蟲傳介體。由于果樹病毒種類多，復合侵染嚴重，CVA往往與其他果樹病毒復合侵染［23-25］，加之缺少可用于研究CVA的草本模式寄主，因此，對病毒侵染引起的寄主癥狀尚不明確，也無法評估對果實產量和品質的影響。但多數學者認為CVA為潛伏侵染，不會表現出明顯癥狀［26］。而CVA與其他核果病毒共感染可能會導致嚴重癥狀，并引起產量和質量損失［27］。

CVA多依靠血清學和基因擴增技術進行檢測。RT-PCR應用較普遍，該方法準確性高、特異性強。在果樹生長季節也可用ELISA［28］和斑點雜交［29］技術對田間大量果樹葉片樣本進行檢測，具有耗時少、處理樣本多的優點，適合統計某個地區果樹中CVA的發生情況。近年來，中國學者陳玲等［30］建立了基于重組酶聚合酶擴增（RPA）技術的CVA檢測方法，配合側向流試紙條，實現了CVA的可視化檢測。實時熒光定量PCR技術（Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR）具有高靈敏度、高特異性、可對植物特定組織部位進行病毒定量研究等優點［31］，已成為分子植物病毒學常用的檢測方法之一，同時也可作為植物病毒致病機制研究的重要工具。運用TaqMan探針技術檢測CVA［32］的成本較高。利用RT-qPCR檢測CVA，國內外鮮有報道。本研究針對CVA mp基因設計了3對RT-qPCR檢測引物，篩選出1對靈敏度高、重復性好的引物，基于SYBR Green I熒光染料建立RT-qPCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料收集

2019年10月至2021年12月，在陜西省安康市櫻桃園采集癥狀表現為褪綠、斑駁、花葉和畸形的櫻桃葉片樣品21份，采集無癥狀葉片83份，保存于安康學院現代農業與生物科技學院分子遺傳學實驗室的-80 ℃超低溫冰箱，備用。

1.2 引物設計與合成

根據GenBank中已公布的CVA mp基因序列信息，使用ClustalW進行多序列比對，在基因保守區域設計3對用于RT-qPCR檢測CVA的引物和CVA mp基因全長擴增引物，所有引物序列見表1，引物由西安擎科澤西生物科技有限責任公司合成。

1.3 櫻桃葉片總RNA提取與cDNA合成

稱取0.2 g櫻桃葉片樣本，置于液氮中充分研磨，迅速轉入1.5 mL RNA free eppendorf管中。按照OmniPlant RNA Kit（北京康為世紀生物科技有限公司）說明書的操作步驟提取RNA。最終將獲得的RNA溶液保存至-80 ℃冰箱，備用。取1 μL的RNA溶液，使用HiFi-MMLV cDNA Kit（北京康為世紀生物科技有限公司）合成病毒cDNA第一鏈，并置于" " -20 ℃保存，備用。

1.4 CVA陽性植株檢測、mp基因擴增與克隆

使用CVA-F、CVA-R引物，通過RT-PCR篩選CVA陽性植株，以感染CVA植株的cDNA為模板，使用CVA-MP-F、CVA-MP-R引物擴增mp基因全長，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定后切膠回收，將純化的mp基因片段連接至pBM16A載體（博邁德生物），轉入JM109感受態細胞，挑取單克隆培養后，將PCR鑒定為陽性的菌液送至西安擎科澤西生物科技有限責任公司進行測序驗證。

50 μL PCR反應體系：25 μL 2×Taq MasterMix（北京康為世紀生物科技有限公司）、2 μL上游引物、2 μL下游引物、2 μL cDNA模板、19 μL ddH2O。PCR反應程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環數為35；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。取5 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.5 CVA質粒標準品的制備

選取經測序驗證無誤后的陽性菌液，提取質粒，使用Nanodrop測定質粒濃度后根據式（1）計算質粒拷貝數，將其作為CVA質粒標準品。質粒拷貝數的計算公式如下：

質粒拷貝數=（質粒濃度/質粒總堿基數）×9.12×1011" " " （1）

1.6 標準曲線的建立

經測定，質粒起始濃度為105 ng/μL，起始拷貝數為2.94×1010 copies/μL，將質粒標準品用ddH2O進行10倍梯度稀釋，最終獲得2.94×102～2.94×108 copies/μL的7個質粒模板。20 μL RT-qPCR反應體系：10 μL 2×UltraSYBR Mixture（北京康為世紀生物科技有限公司）、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、1 μL質粒模板、8 μL ddH2O。使用LightCycler480實時熒光定量PCR儀進行RT-qPCR，每對引物、每個濃度設置3次重復，利用Excel 2016軟件生成標準曲線并計算擴增效率（E）。擴增效率的計算公式如下：

式中，K為曲線斜率。

1.7 RT-qPCR和RT-PCR靈敏度比較

以最終獲得的7個不同濃度質粒標準品為模板，分別進行RT-qPCR和RT-PCR，比較2種方法的檢測靈敏度。

1.8 RT-qPCR特異性檢測

為了評估RT-qPCR檢測的特異性，選擇3種櫻桃樹中常見的植物病毒，即櫻桃小果病毒2（Little cherry virus 2， LchV2）、李屬壞死環斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus， PNRSV）和櫻桃綠環斑駁病毒（Cherry green ring mottle virus， CGRMV）。提取葉片的總RNA，使用RT-PCR篩選陽性樣品，分別作為RT-qPCR的模板進行特異性測試。LchV2、PNRSV和CRGMV的引物序列信息見表2。

1.9 櫻桃葉片和冬季休眠枝條中CVA病毒的定量檢測

2021年1月在陜西省安康市收集了12份櫻桃樹休眠枝條，在83份無癥狀櫻桃葉片樣品中隨機選取32份進行檢測，提取葉片或枝條韌皮部組織的總RNA，統一調整RNA濃度為100 ng/μL，以無毒植株葉片或枝條為健康對照，根據定量結果計算病毒含量。

2 結果與分析

2.1 RT-qPCR引物質量檢測與CVA mp基因克隆

提取感染病毒的櫻桃葉片總RNA，經過反轉錄合成病毒第一鏈cDNA，使用CVA-F、CVA-R引物進行PCR驗證，擴增得到約650 bp條帶（圖1，泳道2），與預期檢測的條帶大小吻合，確定為陽性樣本。使用CVA-MP-F、CVA-MP-R引物對CVA陽性樣本cDNA再次擴增，獲得約1.4 kb的mp全長基因片段（圖1，泳道3）。

使用CVA-dF1、CVA-dR1，CVA-dF2、CVA-dR2和CVA-dF3、CVA-dR3引物擴增分別得到153、139、360 bp特異性條帶（圖2），與引物設計的預期目標條帶大小一致。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳回收純化、連接至pBM16A載體，轉入大腸桿菌JM109，選擇陽性克隆進行測序，序列經Blast比對是正確的。從凝膠電泳結果看來，CVA-dF3、CVA-dR3引物擴增出現了非特異性條帶，因此，不建議使用CVA-dF3、CVA-dR3引物建立標準曲線。

2.2 標準曲線建立

以2.94×102～2.94×108 copies/μL濃度的7個質粒標準品作為RT-qPCR的模板，使用CVA-dF1、CVA-dR1和CVA-dF2、CVA-dR2引物分別進行擴增，每組試驗重復3次，Ct越低，說明樣本中病毒拷貝數越高。由圖3可知，在檢測同一濃度的標準品時，使用CVA-dF1、CVA-dR1引物檢測得到的Ct要高于CVA-dF2、CVA-dR2引物檢測的Ct，說明CVA-dF2、CVA-dR2引物的檢測效率高，因此，最終篩選出可用于CVA定量研究的引物為CVA-dF2、CVA-dR2，其具有靈敏度高、重復性好的特點。

使用CVA-dF2、CVA-dR2引物建立絕對定量標準曲線（圖4），得到的標準曲線斜率為-3.574 6，決定系數R2為0.998 6，線性方程為y=-3.574 6x+40.539，擴增效率為0.904 4，可用于CVA定量研究。

2.3 RT-qPCR和RT-PCR靈敏度對比

靈敏度對比試驗（圖5）結果顯示，RT-qPCR比常規RT-PCR檢測靈敏度高10倍，RT-qPCR能準確檢測2.94×102 copies/μL的質粒標準品，而普通的RT-PCR只能檢測到2.94×103 copies/μL的質粒標準品，而且此時凝膠電泳檢測到的CVA特異性條帶亮度較低。

2.4 RT-qPCR特異性檢測

RT-qPCR特異性結果顯示，只有感染CVA的樣品出現特異性擴增曲線（圖6a），而感染其他3種櫻桃病毒的樣品沒有檢測曲線，但通過RT-PCR驗證確定這些樣品帶有病毒（圖6b）。

2.5 RT-qPCR檢測櫻桃樹樣品中CVA病毒載量

12份休眠枝條RT-qPCR檢測結果（圖7a）顯示，10份休眠枝條感染CVA，Ct分別為15.02、16.43、16.87、17.22、18.48、19.91、30.51、31、31.21和31.78，且均為單一熔解峰（圖7b）。根據標準曲線計算得出CVA病毒量依次為4.05×107、1.63×107、1.23×107、9.81×106、4.36×106、1.74×106、1.88×103、1.37×103、1.20×103、8.29×102 copies/μL。

此外，為了使檢測方法應用更廣泛，在來自陜西省安康市的83份無癥狀櫻桃葉片樣品中隨機抽取32份進行RT-qPCR檢測，對Ct≥35.00的樣品不統計病毒定量數據。結果發現，陽性樣本為22份（表3），檢出率為68.75%，表明CVA在櫻桃樹中發生普遍，但如此高的病毒發生率對櫻桃的品質和產量的影響目前尚不明確，需持續監測研究，以確定有效的病毒病防控措施。

3 討論

CVA在果樹中普遍發生，植物病毒及其所致病害對各種農林作物的為害日趨嚴重且防治困難。近年來，人們針對不同病害進行了許多探索，但是，對大多數病毒病還很難防治，也沒有一個或一套通用、有效的方法［36］。為了確保果樹能優質、豐產、持續性地生產與提高，無毒種苗與植物組織脫毒技術成為控制病毒病的關鍵，而建立準確、可靠、靈敏的植物病毒檢測方法是控制病毒病的必要前提。

果樹和繁殖材料中病毒的早期檢測是李屬及其核果作物病毒病防控最有效的方法。因果樹病毒多為韌皮部專性寄生，常規RT-PCR有一定的局限性，對于病毒滴度低的樣本檢測比較困難，擴增后凝膠成像分辨率低，易導致假陰性。隨著分子植物病毒學實驗技術的不斷完善，RT-qPCR技術在果樹病毒檢測方面發揮重要作用，與標準RT-PCR相比，其具有更快速、更敏感、更精確、可定量檢測的特點［37］。雖然果樹病毒RT-qPCR檢測方法具有諸多優點，但有時缺少不同寄主分離物的病毒基因組序列信息，因此很難建立一套通用的RT-qPCR檢測技術［38］。本研究利用不同寄主和不同地理來源的CVA分離物mp基因序列，使用ClustalW軟件進行多重比對，確定病毒基因保守區域，設計3對用于檢測CVA的RT-qPCR引物，最終篩選出1對檢測效率高、重復性好、特異性強的CVA檢測引物，在田間樣品的實際檢測中表現優異。

有研究表明，基于SYBR Green I 熒光染料的RT-qPCR 標準品多來自重組質粒，因其純度高、單一性好的特點，可最大限度避免熔解曲線雙峰（非特異性擴增）。本研究以構建的CVA mp重組質粒為標準品，建立標準曲線，R2為0.998 6，表明CVA質粒拷貝數與Ct之間有良好的線性關系，并且在田間樣品的實際檢測中，獲得的擴增曲線仍具有單一熔解峰，進一步確定引物設計和檢測體系是特異的。此外，擴增效率（E）也是qPCR的關鍵參數，對于高擴增效率的檢測體系來說，E應在0.90～1.05，E低于0.90則表明引物設計或反應體系不合理，E高于1.05則可能存在模板稀釋問題或非特異性擴增，本研究獲得的標準曲線E為0.904 4，證實建立的CVA檢測體系符合定量研究標準。

4 結論

基于SYBR Green I 熒光染料的RT-qPCR為CVA檢測提供了新方法，該方法具有重復性好、特異性強、成本低、可對病毒進行絕對定量研究等優點。尤其是能檢測低豐度組織樣本（如果樹的休眠枝條），可為CVA的早期預測提供技術支撐，降低果樹產業中由CVA侵染帶來的潛在威脅或經濟損失，進而推動果樹病毒病防控。此外，該方法無需瓊脂糖凝膠電泳和染色，節省了時間，提高了檢測靈敏度，降低了假陰性風險，可作為CVA高效檢測的工具，在病毒病鑒定、定量研究方面具有一定的優勢，應用前景廣闊。

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