不同葉齡青海云杉針葉內生真菌多樣性研究

摘 要：為尋找可能導致青海云杉感染頂芽銹病的原因，采用高通量測序技術對兩組1齡和2齡青海云杉針葉進行測序，分析其內生真菌多樣性和群落結構變化。結果顯示，6個樣本共得到407個可以用于物種分類的運算分類單位（Operational Taxonomic Units，OTU），其中1齡針葉特有OTU數為16個，2齡針葉特有OTU數為20個，共有OTU數為93個。經Alpha多樣性分析發現，2齡針葉內生真菌豐富度和多樣性略高于1齡針葉，群落結構相對穩定，更有利于抵御病原菌侵染；兩組樣本的群落結構差異較為明顯，其中1齡針葉組優勢菌群為Kabatina和Aspergillus，2齡針葉組各菌群占比相差不大，沒有明顯優勢菌群。經Bata多樣性分析發現，兩組樣本間的不同重復分別聚在一起，相似性較高。初步推測，1齡針葉中Aspergillus真菌優勢生長導致其內生真菌群落結構失衡，對針葉造成了一定的損害。

關鍵詞：青海云杉；高通量測序；內生真菌；多樣性；群落結構

中圖分類號：S791.18 文獻標志碼：A 文章編號：1674-7909（2023）03-108-4

0 引言

青海云杉（Picea crassifolia Kom.）是松科云杉屬高大常綠針葉喬木，是我國特有樹種，主要分布在青海省、甘肅省、寧夏回族自治區及內蒙古自治區等西北干旱地區，在造林綠化、涵養水源等方面發揮著重要作用。青海云杉主要生長于海拔1 700～3 000 m的陰坡山地，具有極強的耐寒、耐旱性，是組成高原森林系統最主要的樹種之一。目前，學者對青海云杉的研究多見于病蟲害防治［1-3］、育苗造林［4-6］等，還有不同生長狀態針葉內生真菌多樣性［7］及根系內生真菌多樣性［8］等研究。近年來，青海省海東市互助縣南門峽林區青海云杉頂芽銹病發生嚴重，導致云杉及林區生態平衡受到嚴重影響。在調查中發現，頂芽銹病病原菌只侵染新生針葉，對多年生針葉不具有侵染性。針對這一現象，筆者采用高通量測序技術，從植物內生真菌角度出發探索健康青海云杉新生針葉（1齡針葉）和2齡針葉內生真菌多樣性和群落結構變化，尋找其內生真菌與頂芽銹病病原菌之間的相關性。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

研究樣本于2022年7月中旬采集自互助縣南門峽林區（東經101°53′17″E、北緯36°59′11″）。在3個不同林班采集青海云杉健康新生針葉（1齡針葉）與2年生針葉（2齡針葉）作為試驗樣本，其中1齡針葉樣本分別命名為H1、H2、H3，2齡針葉樣本分別命名為F1、F2、F3，采集的樣本用冰盒保存帶回實驗室。在超凈工作臺對樣本進行表面殺菌消毒處理，具體步驟如下。先依次將樣本在75%乙醇溶液中浸泡1 min，而后在5%次氯酸鈉溶液中浸泡5 min，最后用無菌水沖洗干凈，并用滅菌后的濾紙吸干水分。為盡量減小試驗過程中產生的誤差，將殺菌消毒后的樣本放置于液氮中進行速凍處理。試驗所用儀器和試劑如表1所示。

1.2 樣本DNA提取及PCR擴增

樣本基因組DNA采用CTAB法進行提取，使用引物18S-R（5’-GTAACCCGCTGAACCTCC-3’）和18S-F（5’-GTCCGAAGACCTCACTAAATCA-3’）進行18S片段擴增。PCR反應體系（50 μL）：2x Premix Taq 25 μL，引物18S-R和18S-F各1 μL，DNA模板50 ng，ddH2O補加至50 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。PCR產物經過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將純化后的擴增產物送往廣東美格基因科技有限公司測序。

1.3 測序數據分析

利用Illumina HiSeq 2500測序平臺進行測序，將得到的數據用FLASH v1.2.7軟件進行拼接、過濾優化，得到優化序列（Tags）；再利用Usearch軟件對Tags在97%的相似度水平下進行聚類，獲得運算分類單位（Operational Taxonomic Units，OTU）數量。基于OTU豐度表，利用usearch-alpha_div進行Alpha多樣性分析，再利用R軟件的prcomp函數進行Bata多樣性分析，最后進行共有及特有物種統計、群落組成分析。

2 試驗結果與分析

2.1 測序數據基本情況

由表2可知，6個樣本測序共獲得481 023對Reads，雙端Reads拼接過濾后共產生427 613條有效序列，有效序列數占比超過87.72%，且GC含量為49.1%，Q30含量大于97.6%，表明測序數據質量較好，堿基錯誤率較低。

稀釋性曲線可以反映測序深度及物種豐富程度。由圖1稀釋性曲線可知，隨著樣本測序條數增加，稀釋性曲線表現為先急劇增加，隨后逐漸趨于平緩，表明測序樣本包含絕大多數的微生物物種信息，測序結果可以反映青海云杉針葉內生真菌群落結構。

6個樣本在97%的相似度水平下進行聚類，共獲得407個可以用于物種分類的OUT，其中H1、H2、H3、F1、F2、F3的OUT數分別為66、66、68、67、72、68個，且H組特有OTU數為16個，F組特有OTU數為20個，兩組樣本共有OTU數為93個（見圖2）。其中，共有OTU數占H組和F組OTU數的比例分別為82.3%和85.3%。共有OTU數較多，表明兩組樣本內生真菌群落結構相似性較高。

2.2 內生真菌Alpha多樣性分析

Richness和Chao1指數表示物種豐富度，香農指數與物種多樣性呈正相關，辛普森指數與物種多樣性呈負相關。由內生真菌群落Alpha多樣性指數統計結果可知，H組樣本Richness和Chao1指數除H2外均低于F組樣本，H組樣本辛普森指數均低于F組樣本，但兩組樣本香農指數差異不明顯（見表3）。由此可見，F組樣本內生真菌多樣性與豐富度略高于H組，其內生真菌群落結構相對穩定。

2.3 群落組成分析

利用QIIME軟件對獲得的OTU在不同分類水平上進行注釋分類。由圖3可知，在門水平上，相對豐度較高的內生真菌種類共注釋到了3個門，分別是子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）和被孢霉菌門（Mortierellomycota）。其中，H組中Basidiomycota占比3.88%，Ascomycota占比44.71%；F組中Basidiomycota占比19.98%，Ascomycota占比37.22%。Mortierellomycota在兩組樣本中占比均不超過1%，其他未被注釋菌群（Unassigned）占比較高。

由圖4可知，在科水平上，兩組樣本相對豐度較高的物種有（Dothioraceae）、（Aspergillaceae）、（Taphrinaceae）、叢赤殼科（Nectriaceae）、（Mrakiaceae）、格孢腔菌科（Pleosporaceae）、（Sporidiobolaceae）及（Tremellaceae）。除了未被注釋的菌群外，Dothioraceae、Aspergillaceae、Taphrinaceae等菌群占比相對較高。H組中占比較高的優勢菌群是Dothioraceae和Aspergillaceae；F組中占比較高的優勢菌群主要是Taphrinaceae。上述3科菌群在兩組樣本中占比差異較明顯。

由圖5可知，在屬水平上，兩組樣本相對豐度較高的物種有Kabatina、曲霉屬（Aspergillus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、Udeniomyces、匍柄霉屬（Stemphylium）、Rhodosporidiobolus、絲狀擔子菌屬（Filobasidium）及隱球酵母屬（Cryptococcus）。H組優勢菌群為Kabatina和Aspergillus，其余菌群占比均較低；F組中除了未被注釋的菌群外，其余菌群相對豐度較為平衡，各屬菌群占比相似，沒有明顯優勢菌群。在屬水平上，兩組樣本差異較為明顯，主要體現在Kabatina和曲霉屬（Aspergillus）上，這兩種菌群在H組中相對豐度明顯高于F組。

2.4 Beta多樣性分析

利用QIIME軟件對兩組進行Beta多樣性分析，比較不同樣本間物種多樣性的相似程度（見圖6）。由PCoA分析可知，第1主成分（PC1）和第2主成分（PC2）分別可以解釋所有的變量的64.9%和15.3%，共解釋變量的80.2%。H組（1齡針葉）和F組（2齡針葉）中的3個樣本分別聚在一起，組內內生真菌群落差異不明顯，相似性高。

3 結論與討論

利用高通量測序技術對1齡和2齡青海云杉針葉的6個樣本進行內生真菌多樣性分析，發現2齡針葉內生真菌多樣性與豐富度略高于1齡針葉，菌群結構相對穩定，更有利于抵御外來病原菌侵染；兩組樣本優勢菌群存在明顯差異，H組樣本中Kabatina和Aspergillus為明顯優勢菌群，F組樣本中各屬組成占比相對均衡，沒有明顯差距。有研究結果顯示，Aspergillus屬多種真菌會對植物造成病害，如水稻稻曲病［9］、武夷巖茶赤葉斑病［10］、蘋果黑點病［11］等。尚未發現與Kabatina相關的研究文獻，該屬真菌作用尚不明確。初步推測，青海云杉新生針葉內生真菌中Aspergillus占比較高，導致其內生真菌群落結構失衡，可能對新生葉造成一定損害，加之新生針葉表皮細胞尚未發育成熟，在應對銹病病原菌侵入時沒有建立良好的抵御屏障；在這一系列因素的共同作用下，青海云杉頂芽銹病病原菌更易侵染新生針葉。此次研究中的PCoA結果顯示，兩組樣本中的3個重復聚在一起，相似性高，數據結果合理、可靠。

參考文獻：

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