早期2型糖尿病腎病與醛糖還原酶基因甲基化水平的臨床研究

包利文，尹麗明，王少波

【摘要】目的 探討醛糖還原酶（AKR1B1）基因甲基化水平和早期2型糖尿病（T2DM）腎病蛋白尿之間的聯系。方法 選取2020年5月至2022年4月期間東莞市厚街醫院收治的40例T2DM合并蛋白尿陽性患者作為糖尿病腎病（DN）組，選擇同時期39例診斷T2DM且尿蛋白陰性志愿者作為糖尿病（DM）組，進行前瞻性研究。比較兩組患者的臨床資料，亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）與AKR1B1基因甲基化水平，并分析AKR1B1基因甲基化水平與臨床資料中差異有統計學意義的指標的相關性。結果 DN組患者糖化血紅蛋白（HbA1c）、空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖（2 h PG）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）及尿微量白蛋白與肌酐比值（UACR）水平均高于DM組，腎小球濾過率（eGFR）低于DM組（均P<0.05）；DN組AKR1B1甲基化水平低于DM組（P<0.05），兩組MTHFR甲基化水平比較，差異無統計學差異（P>0.05）；Pearson相關分析結果表明，AKR1B1甲基化水平與FBG、2 h PG、HbA1c、Scr、BUN、UACR呈負相關，而與eGFR水平呈正相關（均P<0.05）。結論 AKR1B1基因DNA甲基化可能參與了DN的發生、發展過程，且AKR1B1甲基化水平與FBG、2 h PG、HbA1c、Scr、BUN、UACR呈負相關，與eGFR水平呈正相關，可預估患者T2DM患者病情。

【關鍵詞】醛糖還原酶 ; 甲基化 ; 糖尿病腎病 ; 亞甲基四氫葉酸還原酶

【中圖分類號】R587.1【文獻標識碼】A【文章編號】2096-3718.2023.20.0087.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2023.20.029

隨著我國經濟和社會的發展，人民飲食習慣的改變，糖尿病（diabetes mellitus， DM）發病率日益升高，已成為威脅人類健康的重要因素[1]。 DM可產生多種并發癥，糖尿病腎病（diabetic nephropathy， DN）是其最明顯的微血管并發癥，DN目前是除腎小球腎炎之外，導致終末期腎病（end stage renal disease， ESRD）的第二大病因，對DM患者的生活質量造成極大的影響， DN的發生發展受遺傳和環境因素的影響，而環境因素會改變表觀遺傳狀態，因此表觀遺傳機制可能在DN的發病機制中起關鍵作用[2]。近年來，表觀遺傳修飾的相關研究越來越受到重視， DM患者的高血糖代謝狀態可能存在相關的“代謝記憶效應”，長期的高血糖狀態，即使患者血糖水平恢復正常，仍可出現DM的相關并發癥。最新研究提示，“代謝記憶”與靶細胞的表觀遺傳改變的關系密切[3]。表觀遺傳修飾是指在不改變DNA序列的情況下影響基因的表達和功能。其中， DNA甲基化是研究最廣泛的表觀遺傳標記。醛糖還原酶（AKR1B1）基因編碼一種催化葡萄糖還原為山梨醇的酶，而山梨醇所導致的氧化應激是糖尿病慢性并發癥的主要途徑之一[4]。亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）是高同型半胱氨酸（Hcy）代謝過程中重要的酶，通過甲基化Hcy轉化為甲硫氨酸，從而降低血漿Hcy水平，而Hcy具有血管毒性作用，可通過氧化應激損傷血管內皮細胞、刺激血管平滑肌細胞增生等多種途徑，導致腎小球濾過率增加，從而參與DN病變進程[5]。本研究旨在探討AKR1B1和MTHFR甲基化水平與早期2型糖尿病（diabetes mellitus type 2， T2DM）腎病的關系，為患者病情預估提供參考依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2020年5月至2022年4月期間東莞市厚街醫院收治的40例T2DM合并蛋白尿陽性（尿蛋白含量≥ 30 mg/24 h或20 μg/min [7]）患者作為DN組，選擇同時期39例診斷T2DM且尿蛋白陰性（尿蛋白含量<30 mg/24 h或20 μg/min）的研究對象作為DM組，進行前瞻性研究。納入標準：①所有患者均符合《中國2型糖尿病防治指南（2017年版）》 [6]中T2DM的診斷及分型標準；②DN組患者同時符合《糖尿病腎臟病診治專家共識》 [7]中的DN的診斷標準，尿微量白蛋白與肌酐比值（UACR>30 μg/mg）；③近期未服用腎毒性藥物；無精神疾病或意識障礙。排除標準：①合并慢性腎炎、尿路感染等疾病；②半年內有惡性高血壓、心腦血管意外等危重病史；③伴凝血功能障礙。本研究獲得東莞市厚街醫院醫學倫理委員會的批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料統計 收集所有患者的一般資料，包括性別、年齡、BMI、病程。囑其禁食8 h，次日清晨在患者空腹狀態和餐后2 h各抽取靜脈血3 mL，同時收集晨尿3 mL，均以3 500 r/min的離心速率離心10 min后取得上清液待測。利用全自動生化分析儀[貝克曼庫爾特（美國）股份有限公司，型號：AU5800]測定血清糖化血紅蛋白（HbA1c）、空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖（2 h PG）、血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBiL）、直接膽紅素（DBiL）、血紅蛋白（Hb）、總膽固醇（CHOL）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、三酰甘油（TG）水平，采用全自動生化分析儀檢測尿微量白蛋白與尿肌酐，并計算腎小球濾過率（eGFR）、UACR，采用電子血壓計[松下電氣機器（北京）有限公司，京械注準20162070530，型號：EW3106]檢測患者收縮壓（SBP）與舒張壓（DBP）。另取患者空腹靜脈血3 mL，取一部分抗凝后離心（離心條件同上），取血漿待檢。采用全自動凝血分析儀（Instrumentation Laboratory Co.，型號：ACL TOP 700）檢測血漿凝血酶原時間（PT），采用酶聯免疫吸附法檢測血漿纖維蛋白原（FiB）。利用全自動血液分析儀（深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，型號：6800PLUS）檢測白細胞計數（WBC）。

1.2.2 MTHFR、AKR1B1基因甲基化水平檢測 通過基于下一代測序的亞硫酸氫鹽測序（BSP）評估基因特異性DNA甲基化。首先針對目標區域或位點，完成重亞硫酸鹽修飾的基因組DNA序列PCR（BS-PCR）引物設計和合成，使用在線MethPrimer軟件設計BSP引物。使用ZYMO EZ DNA Methylation-GoldTM Kit轉換1 μg基因組DNA，使用KAPA HiFi HotStart Uracil+ReadyMix PCR試劑盒將二十分之一的洗脫產物用作35個循環的聚合酶鏈式反應（PCR）擴增模板。對于每個樣本，將多個基因的BSP產物平均匯集，5'-磷酸化，3'-dA尾，并使用T4 DNA連接酶（NEB）連接到條形碼適配器。在Illumina平臺上對所有樣本的條形碼庫進行測序[5]。C位點的甲基化水平=支持甲基化的reads數/（支持甲基化的reads數+支持非甲基化的reads數），引物由上海捷瑞公司設計合成，引物序列：

MTHFR

上游5'-TAGATTTAGGTACGTGAAGTAGGGTAGAC-3'，

下游5'-GAAAAACTAATAAAAAACCGACGAA-3'；

AKR1B1

上游5'-GGGTTATTTAAAGGTATGTGTT-3'，

下游5'-AACACCATTATTAAACAAAAA-3'；

U6（內參）

上游5'-TTTAGGTATGTGAAGTAGGGTAGATGT-3'，

下游5'-CAAAAAACTAATAAAAAAAACCAACAAA-3'。

1.3 觀察指標 ①比較兩組患者的一般資料。②比較兩組患者MTHFR與AKR1B1基因甲基化水平。③分析DN組患者AKR1B1基因甲基化水平與一般資料中差異有統計學意義的指標的相關性。

1.4 統計學方法 應用SPSS 23.0統計學軟件分析數據，計數資料包含臨床療效，以[例（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗；符合正態分布的計量資料采用（ x ±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，不符合正態分布的計量資料使用中位數（四分位數間距） [M（P25，P75）]進行描述，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗，采用Pearson法進行相關性分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者臨床資料比較 DN組患者HbA1c水平、FBG、2 h PG、Scr、BUN及UACR水平均高于DM組，eGFR低于DM組，差異均有統計學意義（均P<0.05）；兩組患者性別、年齡、BMI、病程、SBP、DBP、ALT、AST、TBiL、DBiL、PT、WBC、Hb、FiB、CHOL、HDL、LDL、TG比較，差異均無統計學意義（均P>0.05），見表1。

2.2 兩組患者基因AKR1B1和MTHFR甲基化水平比較 DN組AKR1B1甲基化水平低于DM組，差異有統計學意義（P<0.05），DN組MTHFR甲基化水平高于DM組，但差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

2.3 DN組患者AKR1B1甲基化水平相關性分析 Pearson相關分析結果表明，AKR1B1甲基化水平與FBG、2 h PG、HbA1c、Scr、BUN、UACR呈負相關，而與eGFR水平呈正相關，差異均有統計學意義（均P<0.05），見表3。

3 討論

DN是T2DM的一種嚴重的微血管并發癥，是導致ESRD最常見的原因之一，預防或減緩DN的進展能帶來相當的社會經濟效益，且DN可以通過早期指標檢測來預防或延緩病情進展，因此，尋找早期診斷和預后的生物標志物是DN臨床研究的重點問題。研究表明，表觀遺傳對于DN的發生發展影響明顯，而表觀遺傳的改變易受到較多因素的影響，如長期高血糖所導致的基因甲基化等[8]。DNA甲基化改變是表觀遺傳的主要表現方式，已被認為參與了DN的發病機制，通過動物實驗已證實DNA甲基化抑制劑對DN有益[9]。因此，早期預測DN高風險患者從而預防和延遲患者病情顯得非常重要，本研究搜索Scopus，Pubmed，CochraneCentral等數據庫選擇了在糖尿病腎病中具有重要作用的基因（AKR1B1、MTHFR）進行研究，測定早期DN患者外周血中靶基因啟動子區甲基化水平，探討目標基因的DNA甲基化水平與蛋白尿及eGFR的關系。

本研究結果顯示，DN組患者HbA1c、FBG和2 h PG水平均高于DM組，提示DN患者血糖控制情況較差，其中FBG和2 h PG是常用的血糖檢測指標，而HbA1c是紅細胞血紅蛋白的β鏈N端纈氨酸與葡萄糖非酶化結合的產物，占血紅蛋白總量的60%～70%，紅細胞壽命是120 d，所以HbA1c能很好地反映2～3個月的血糖水平，且不受飲食、運動、血糖忽高忽低影響，因此檢測HbA1c更能評價患者的血糖情況，已經成為評價糖尿病管理的重要途徑[10]。DN組患者Scr、BUN及UACR水平均高于DM組，eGFR低于DM組，均提示DN患者有明顯的腎功能損害。

NAZIR等[11]關于DN遺傳變異的薈萃分析發現，有11個基因變異與DN顯著相關，且證實炎癥與DN的發生進展有很強的相關性。本研究表明，AKR1B1基因的甲基化水平在DN患者中低于DM患者，而DN組MTHFR甲基化水平高于DM組，但差異無統計學意義。劉愷遠等[12]對于DN的研究顯示，AKR1B1基因DNA甲基化與糖尿病腎病的發生、發展有關，AKR1B1基因DNA甲基化水平越低，血糖及尿蛋白水平越高。而MTHFR基因的甲基化水平與DN無關，這可能與MTHFR通過基因突變而不是甲基化影響血漿Hcy濃度，從而損傷血管，最終促進DN病變發生有關[13]。

此外，本研究結果顯示，AKR1B1甲基化水平與FBG、2 h PG、HbA1c、Scr、BUN、UACR呈負相關，而與eGFR水平呈正相關，提示在DN患者中AKR1B1基因DNA的甲基化水平越低，血糖水平越高，腎功能損傷越嚴重，AKR1B1甲基化水平可能是一種新的預測DN生物標志物和新的分子靶點，可替代早期的DN分子預測靶點，這與ALDEMIR等[14]的研究結果相同。推測這一結果可能與AKR1B1基因主要功能是編碼AKR1B1有關，AKR1B1是多元醇通路的關鍵限速酶，能導致山梨醇堆積，從而增加氧化應激，使機體內細胞呈現高滲狀態，進而出現細胞水腫、缺氧等，最終導致腎臟、眼底及周圍神經的損害[15]。AKR1B1基因DNA的甲基化水平越低，提示AKR1B1越多，腎臟、眼底及周圍神經的損害現象越明顯。有研究表明，T2DM患者體內長期高糖環境致使DNA甲基化狀態發生改變，甲基化水平降低，激活AKR1B1基因，導致腎功能組織病變，進而致使DN的發生[16]。

綜上，AKR1B1基因DNA甲基化可能參與了DN的發生、發展過程，可作為預測DN的潛在生物標志物，且AKR1B1甲基化水平與FBG、2 h PG、HbA1c、Scr、BUN、UACR呈負相關，與eGFR水平呈正相關。但本研究樣本量較少，后續可以進一步進行大樣本甲基化研究，探索早期預測及治療DN高風險患者的新途徑。

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