多重微球懸浮陣列技術與化學發光法檢測糖類抗原125的相關性研究

doi：10.3969/j.issn.1672-6375.2023.11.019

摘 要：目的：觀察西門子化學發光儀西門子ADVIA Centaur CP（縮寫：發光儀CP）和多重微球懸浮陣列技術平臺Luminex200檢測糖類抗原125（CA125）的差別和相關性。方法：采用多重微球懸浮陣分析儀Luminex200和發光儀CP同時檢測106份標本CA125，比較2種方法測定結果的差異和相關性。結果：Luminex200檢測CA125結果為160±112 kU/mL，與ELISA檢測結果（46 kU/mL）比較有統計學差異（Plt;0.05）。Luminex200檢測CA125的陽性率為100%，發光儀CP檢測CA125的陽性率為64.71%，經配對資料χ²檢驗，2種測定方法測定CA125時差異有統計學意義（Plt;0.05）。Pearson和Spearman檢驗表明2種方法有相關性。結論：Luminex200檢測CA125的結果和發光儀CP的結果相關，但有差異，需建立不同的參考區間。

關鍵詞：化學發光法；多重微球懸浮陣列技術；腫瘤標志物；糖類抗原125

中圖分類號：R446.61 文獻標識碼：A

腫瘤標志物是腫瘤在發生和增殖過程中，由腫瘤細胞生物合成、釋放或者宿主對癌類反應性的一類物質。腫瘤標志物按照成分不同可以分為胚胎抗原標志物、糖類標志物、酶類標志物、激素類標志物、蛋白類標志物和基因類標志物等種類。腫瘤標志物對于腫瘤的診斷、治療監測和預后判斷有重要意義。糖類抗原125（CA125）是高分子糖蛋白，廣泛表達于上皮組織，在卵巢癌、肺癌和胰腺癌患者CA125均明顯升高^[1-2]。卵巢癌是女性致命的生殖系統的惡性腫瘤。在一項多中心的研究中，CA125和骨橋蛋白作為鑒別良惡性卵巢癌的單獨標物體現出較強的能力^[3]。

目前檢測CA125的常用方法主要有酶聯免疫吸附試驗、放射免疫和化學發光法。流式熒光技術是近年來發展起來的、基于激光激發熒光發光的免疫熒光類技術。多重微球懸浮陣列技術平臺Luminex200是一個多功能生物技術平臺，具有通量高、應用領域廣、既能檢測蛋白質又能檢測核酸等優點^[4-6]。Luminex檢測腫瘤患者血清CA125的研究僅有少量報道^[7]，且沒有與西門子化學發光儀CP（簡稱：發光儀CP）作比對試驗。因此，本研究收集了51份，在中國人民解放軍96604部隊醫院住院患者血清，分別采用化學發光儀CP和Luminex200進行檢測，觀察二者的相關性，以初步評價Luminex200的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 檢測對象

中國人民解放軍96604部隊醫院2021年1月—2021年12月住院患者中，通過Luminex200 多功能流式點陣儀檢測CA125超過正常參考值范圍的106例患者，其中男性51例，女性55例，年齡68±15歲。空腹抽取靜脈血5 mL，靜置30 min后3 000 rpm離心5 min，分離血清，-20 ℃儲存備用。

1.2 儀器和試劑

化學發光儀ADVIA Centaur CP系德國西門子公司產品，CA125試劑、校準品、質控品均為原廠配套試劑；Luminex200 多功能流式點陣儀系美國 Luminex公司，CA125試劑為上海透景公司產品。

1.3 檢測原理

用不同配比的2種紅色分類熒光染料將直徑為 5.6 μm的聚苯乙烯微球染成不同的熒光色，獲得多種熒光編碼的微球，每種不同熒光編碼的微球對應一種檢測分子。本研究中，把針對腫瘤標記物的抗體分子共價交聯到特定編碼微球。先把針對不同待測物的熒光編碼微球混合，加入待測物質，待測物和熒光編碼微球上的抗體結合形成熒光編碼微球抗體-抗原復合物，復合物再與標記熒光素二抗結合，形成熒光編碼微球抗體-抗原復合物-標記熒光素二抗的雙抗體夾心物。微球在流動鞘液的帶動下單列依次通過紅綠激光，紅激光用來判定微球的熒光編碼，綠激光用來測定微球上報告分子的熒光強度。熒光強度和待測標本中的抗原量成正比。

ADVIA Centaur CP檢測CA125采用雙抗體夾心法。磁微粒包被的抗體和標本中的抗原結合，然后和吖啶酯標記的二抗結合，形成固相化抗體-抗原-吖啶酯標記的二抗雙抗體復合物。吖啶酯生物發光強度和待測標本中的抗原量成正比。

1.4 檢測方法

對采集的106份樣本同時用Luminex200和發光儀CP 2種方法進行檢測。所有的操作均由操作熟練的專門技術人員嚴格按照操作規程進行，測定結果cutoff值見表1。

1.5 統計學處理

經Kolmogorow-Smirov檢驗，Luminex200檢測CA125的數據符合正態分布（Z=1.131，P=0.155＞0.05），發光儀CP檢測CA125的數據不符合正態分布（Z=1.439，P=0.032lt;0.05）；因此，Luminex200檢測CA125的結果采用mean±SD表示，發光儀CP檢測CA125的數據采用中位數表示。連續數據2種方法檢測結果比較采用配對比較的秩和檢驗，陽性率的比較采用配對資料的 χ²檢驗， Spearman和二元變量比較2種方法的相關性，Plt;0.05為差異有統計學意義。建立ROC曲線，并計算ROC曲線下面積（AUC），比較2種檢驗方法的診斷價值。

2 結果

2.1 2種方法結果比較

Luminex200檢測CA125的結果為160±112 kU/mL， 與發光儀CP檢測CA125的結果（46 kU/mL）比較有統計學差異，見表2，P＜0.05。

2.2 2種方法檢測結果

Luminex200檢測卵巢癌腫瘤標記物CA125的陽性率為100%，發光儀CP檢測卵巢癌腫瘤標記物CA125的陽性率為63.20%，四格表卡方檢驗結果表明兩種方法測定CA125時差異有統計學意義，見表3，P＜0.05。

2.3 2種方法相關性分析

為了比較Luminex200和發光儀CP檢測卵巢癌腫瘤標記物CA125結果之間有無相關性，用Pearson和Spearman檢測2種方法的相關性和散點圖表示結果。Pearson和Spearman 相關系數分別為1.00和0.88（P均lt;0.05），認為2種方法檢測結果具有相關性。散點圖結果Luminex200和發光儀CP檢測結果呈正相關，R²為0.741（圖1）。

3 討論

本研究最重要的結論：Luminex200檢測CA125的結果與發光儀CP檢測的結果有相關性，但檢測結果差異明顯，有必要對兩個不同的設備建立不同的參考區間。

卵巢癌是女性生殖系統的常見疾病，婦科惡性腫瘤死亡的主要原因，在女性癌癥常見的死亡原因中排名第5。盡管卵巢癌治療取得了進步，但存活率并沒有顯著提高。早診斷、早治療對于降低卵巢癌的死亡率至關重要^[8]。1981年Bast 等用卵巢囊腺癌的上皮細胞株，通過雜交瘤技術制備了抗卵巢癌上皮細胞單克隆抗體（OC125）。應用OC125抗體檢測出的抗原稱為糖類抗原 125（CA125）。CAl25廣泛分布在人體組織中，主要是由輸卵管、宮頸內膜、子宮內膜、陰道基底部等米勒管上皮結構合成。 CA125 在卵巢癌、子宮頸及子宮體癌、子宮內膜癌等婦科腫瘤的診斷、療效檢測、預后中的作用得到醫學界的普遍認可。例如，有研究認為 CA125是監測上皮性卵巢癌最重要的生物標志物之一。CA125還可用于卵巢癌與良性疾病的鑒別，良性疾病CA125不升高或者升高幅度不大；惡性卵巢疾病患者CA125升高的幅度比較大。血清CA125水平還與腫瘤分期有較強的相關性：CA125水平較低，患者的分期較早，預后較好；CA125水平較高，患者的分期較晚，預后較差。與預后不良的患者相比，存活5年以上的患者術前CA125水平較低^[9]。盡管如此，和其他腫瘤標志物類似，CA125在婦科腫瘤的診斷中也存在特異性比較差的問題，既不能完全區分是否為腫瘤性疾病，也不能判斷腫瘤的原發臟器。如CA125在男性胰腺癌（非婦科腫瘤）、自身免疫病、心臟疾病、炎癥、結核性疾病均可非特異性升高。也有研究表明，血清和胸腔積液中CA125均升高，但在其他炎癥性胸腔積液不升高，因此不能很好區分結核性和癌性胸腔積液，因此還需要結合其他檢查，如影像學、體液細胞學、病理學區分是否為惡性胸腔積液。此外，和其他腫瘤標志物聯合應用，也是提高卵巢癌CA125診斷準確性的重要策略。如采用卵巢惡性腫瘤風險算法（ROMA）評估絕經期婦女血清HE4和CA125的卵巢癌風險。與CA125相比，ROMA和HE4的診斷表現相對較好，特異性提高到75%，敏感性提高到94%^[9-10]。有學者將CA125和轉鐵蛋白、轉甲狀腺素前白蛋白、載脂蛋白AI和β-2微球蛋白聯合應用，敏感性提高到94%，但特異性僅為40%^[11]。有研究者觀察到，1/5的上皮性卵巢癌患者CA125濃度未超過35 u/mL，可能原因之一是循環免疫復合物的形成。CA125水平低的患者CICs的熒光強度高于CA125水平高的患者。這說明游離CA125可能與血清中的抗體結合形成CICs，從而干擾血清中CA125的檢測結果。成人血清CA125水平低于35 u/mL。

提高CA125檢測的準確性對診斷也有重要意義。早期檢測CA125的方法主要是放射免疫（RIA）和酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。RIA有一定的敏感性和特異性，但放射性同位素對測試者和環境產生的放射性污染影響了其使用。ELISA雖然不存在放射性污染，但其靈敏度不高，對于卵巢癌的早期診斷作用不大。采用辣根過氧化物酶和堿性磷酸標記，魯米諾、金剛烷作為發光底物的酶化學發光法，吖啶酯標記的直接化學發光法和三聯吡啶釕標記的電化學發光法出現大大提高了檢測的靈敏性和特異性，陸續成為各實驗室檢測腫瘤標志物的主流方法。化學發光法具有背景低、靈敏度高、線性范圍寬、設備簡單、分析快速等優點，在腫瘤標志物、激素、病毒標志物的檢測中具有重要意義^[12-13]。國外還建立了一種基于熒光共振能量轉移（FRET）系統的靈敏免疫傳感器，用于檢測卵巢癌細胞中CA125的過表達^[14]，該方法靈敏度高，檢出限極低，達到了0.5 fg/mL，濃度范圍寬，能在早期更準確地檢測和識別異常表達的CA125。

生物芯片技術是檢測和分析生命體海量信息的重要手段。液相芯片又稱懸浮芯片，最早是1997年美國Luminex公司開發研制的多功能分析平臺。該技術所有反應都在液相中完成，有機地整合了熒光編碼微球技術、激光分析技術、流式細胞技術、高速數字信號處理技術及計算機運算法則等多項最新科技成果，在同一平臺上即可完成蛋白質和核酸的檢測等。相比傳統固相生物芯片，液相芯片將固相平板載體替換為編碼微球，每個微球都攜帶一種可識別的編碼信息，以鑒別固定在其表面的探針。一旦微球表面探針種類被識別，探針所捕獲的靶分子就能被定性或定量分析，以實現高通量檢測，液相芯片技術是最適宜的高通量多指標檢測技術之一^[15]。Luminex的第一個平臺是由64個磁珠系統組成FlowMetrixTM系統，采用經典的流式細胞儀FL2/FL3通道進行檢測。但由于流式細胞儀是專業化很強的儀器，不是在每個醫院都擁有流式細胞儀，因此限制了XMAP技術的應用。因此，隨著FlowMetrixTM系統的開發，Luminex團隊陸續推出了在xMAP技術基礎上發展起來的基于微孔板的多重檢測抗體芯片技術Luminex100和Luminex200系統。該技術將單克隆抗體偶聯到不同熒光標記的微球上，捕獲抗體和標本中抗原結合后，生物素標記的二抗和標本中分子的不同抗原決定簇結合，形成夾心結構，實現大量目標樣本中多因子的同時檢測和準確定量。該技術目前在腫瘤標志物檢測、傳染病原體檢測和激素的檢測方面應用廣泛。具有靈敏度高、高通量、檢測線性范圍廣等優點^[16-17]。盡管Luminex200在腫瘤標志物的檢測方面應用廣泛，但目前有關Luminex200和化學發光法在檢測腫瘤標志物方面的相關性研究報道比較少^[17]。因此本研究同時通過Luminex200和發光儀CP測定了CA125，評價二者的相關性。

本研究中，通過比較Luminex200與發光儀CP檢測結果提示：Luminex200和發光儀CP檢測CA125結果呈正相關，但Luminex200檢出CA125的陽性率（100%）高于發光儀CP，分析原因可能是Luminex200的靈敏度與發光儀CP不一樣。本研究中，Luminex200檢測CA125結果顯著高于CLIA，陽性率顯著高于Luminex200，且兩種方法的相關系數僅為0.741。有文獻報道，Luminex200檢測AFP、CEA、CA125等腫瘤標志物的結果與羅氏電化學發光相關系數為0.875 3～0.982 5，2種方法線性擬合，斜率為 0.916～1.146 6，高于本研究結果，可能的原因是羅氏電化學發光采用的是三聯吡啶釕、西門子化學發光儀采用的是吖啶酯、Luminex200采用的是熒光物質標記的原因；3種方法采用的標記物不一樣，線性范圍、敏感度、特異度可能有一定的區別。因此，即使在同一個實驗室、針對同一個人群，也有必要建立Luminex200和西門子化學發光儀CP獨立的參考值范圍。文獻報道CA125診斷卵巢癌的敏感性介于0.64～0.96^[18]，ROC面積0.85。也有研究表明，不同年齡亞組的CA125 篩查切點值存在相對明顯的差異，其中60～69 歲女性CA125 的篩查切點值最低，≥70 歲女性CA125 篩查切點值最高，lt;60 歲女性CA125 篩查切點值居于兩者之間。PLCO 的外部驗證也觀察到了類似的趨勢^[19]。有文獻報道，CA125在子宮內膜癌的預測價值與預后的應用中，與臨界值大小有重要的關系。采用不同的臨界值，在預測子宮內膜癌的過程中，敏感度、特異性、陽性預測值和陰性預測值有區別^[20]。值得注意的是，CA125除在卵巢癌、子宮內膜癌、胰腺癌升高，在良性疾病如子宮內膜異位癥^[21]、結核^[22]等良性疾病患者血清升高，制訂恰當的參考值范圍，并結合臨床進行分析，對于區別良性和惡性疾病有重要意義。

Luminex200檢測CA125與化學發光法有相關性，但檢測結果有差異。需要建立Luminex200檢測CA125參考值范圍，可能無法參考化學發光法的參考值范圍。

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收稿日期：2023-08-10

作者簡介：陳彥（1975-），女，大學本科，副主任檢驗師，主要研究方向：醫學檢驗。

通信作者：陳曉娥（1986-），女，大學本科，主管檢驗師，主要研究方向：醫學檢驗。