肝豆靈片通過調控PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路改善肝豆狀核變性鐵死亡的機制

摘要：基于PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路，探討肝豆靈片對 TX 小鼠肝豆狀核變性鐵死亡的影響以及對 CuCl2誘導的HT22細胞鐵死亡的作用機制。將 TX 小鼠分為對照組、模型組、肝豆靈片組、Fer-1組、谷胱甘肽組，HT22細胞分為對照組、模型組、肝豆靈片組、Fer-1組、肝豆靈片+Fer-1 組，采用 HE染色檢測各組小鼠海馬組織病理學改變，蛋白質免疫印跡檢測各組小鼠海馬組織與HT22細胞中PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5蛋白的表達，以及HT22細胞中SLC7A11、GPX4蛋白的表達，微量法檢測各組TX小鼠海馬組織中Fe2+的濃度，微板法檢測各組HT22細胞中SOD（超氧化物歧化酶）、MDA（丙二醛）、GSH-Px 水平，實時熒光定量聚合鏈式反應檢測各組HT22細胞中PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5 mRNA 的表達。結果表明：與對照組相比，模型組海馬組織出現明顯損傷，PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5蛋白表達均明顯增高，SLC7A11、GPX4蛋白表達明顯下降，Fe2+的濃度明顯升高（Plt;0.05）；與模型組相比，肝豆靈片組、Fer-1組和谷胱甘肽組海馬組織的病理損傷均得到改善，且肝豆靈片組效果明顯；肝豆靈片組和Fer-1組能抑制HT22細胞鐵死亡，PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5蛋白與 mRNA 表達較模型組均明顯減少，MDA的濃度明顯降低（Plt;0.05），SOD活力及GSH-Px濃度明顯增加（Plt;0.05）。肝豆靈片能減輕 TX 小鼠海馬組織鐵死亡，抑制CuCl2誘導的HT22細胞鐵死亡，其機制可能與下調PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路，減輕細胞內脂質過氧化有關。

關鍵詞：肝豆靈片；肝豆狀核變性；PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路；鐵死亡；機制

中圖分類號：R285"" 文獻標志碼：A"" 文章編號：1002-4026（2024）04-0034-11

開放科學（資源服務）標志碼（OSID）：

The mechanism by which Gandouling tablets improve ferroptosis in

hepatolenticular degeneration through PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5

signaling pathway regulation

WU Bojin1，DONG Ting2*，WEN Yuya1，TIAN Liwei1，ZHAO Chenling1

（1. The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine， Hefei 230031， China;

2. Key Laboratory of Xin’An Medicine， Minisity of Education，Hefei 230038， China）

Abstract∶This study investigates the effects of Gandouling （GDL） tablets on ferroptosis in hepatolenticular degeneration in TX mice and their mechanism of action on the ferroptosis of HT22 cells induced by CuCl2， based on the PKCβII/ACSL4/ ALOX5 signaling pathway. TX mice were divided into five groups： control， model， GDL tablet， Fer-1， and Glutathione. HT22 cells were also divided into five groups： control， model， GDL tablet， Fer-1， and GDL tablet + Fer-1. Hematoxylin and eosin staining was used to detect the pathological changes in the hippocampus tissues of the mice. Western blotting was used to detect the expression of PKCβⅡ， ACSL4， and ALOX5 in the hippocampus tissues and HT22 cells of the mice， as well as the expression of SLC7A11 and GPX4 in HT22 cells. The content of Fe2+ in the hippocampus tissues of the mice was detected via microassay. The levels of SOD， MDA， and GSH-Px in HT22 cells were detected by microplate assay. Finally， the expression of PKCβⅡ， ACSL4， and ALOX5 mRNA in HT22 cells was detected by quantitative real-time polymerase chain reaction. Compared with the control group， the hippocampus tissues of mice in the model group showed clear damage; the protein expression of PKCβⅡ， ACSL4， and ALOX5 showed a clear increase; the protein expression of SLC7A11 and GPX4 decreased significantly; and Fe2+content increased significantly （Plt;0.05）. Compared with the model group， the pathological damage to hippocampus tissues showed improvements in the GDL tablet， Fer-1， and Glutathione group with the effects being noticeable in the GDL tablet group. It was possible to inhibit ferroptosis of HT22 cells in the GDL tablet and Fer-1 group and significantly lower their expression of PKCβⅡ， ACSL4， and ALOX5 protein and mRNA in comparison to the model group（Plt;0.05）. The MDA contentalso decreased significantly （Plt;0.05） while the SOD activity and the GSH-Px content increased significantly（Plt;0.05）. Thus， GDL tablets can inhibit ferroptosis in hippocampus tissues of TX mice andinhibit ferroptosis induced by CuCl2 in HT22 cells. Moreover， the ferroptosis mechanism may be related to the down-regulation of the PKCβⅡ， ACSL4， and ALOX5 signaling pathway and the attenuation of intracellular lipid peroxidation.

Key words∶Gandouling tablets;hepatolenticular degeneration; PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5 signaling pathway;ferroptosis; mechanism of action

肝豆狀核變性（hepatolenticular degeneration，HLD），又稱 Wilson 病（Wilson Disease，WD）是一種由ATP7B突變導致的常染色體隱形遺傳病，以銅代謝障礙為主要特征。銅通過在大腦、肝腎、角膜等組織器官中異常沉積，導致相應組織器官損害，相關研究表明HLD患者的腦銅濃度比對照組高10～15倍［1-2］。銅還可以誘導細胞中谷胱甘肽過氧化物酶4（Glutathione Peroxidase 4，GPX4）自噬降解來促進鐵死亡［3］。鐵死亡是一種新型程序性細胞死亡，主要與鐵離子過載及脂質過氧化相關［4］。大腦長期暴露于高濃度銅最終會導致星形膠質細胞鐵死亡，進而促進神經元細胞鐵死亡［5］。同時，銅代謝障礙會導致血腦屏障功能障礙以及包括神經元和少突膠質細胞在內的其他腦組織受損，從而出現神經癥狀［2，5］。PKCβⅡ是蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）家族中的一種，PKC包括PKCα、PKCβⅠ、PKCβⅡ、PKCγ、PKCδ、PKCθ、PKCη，它們通過磷酸化絲氨酸、蘇氨酸殘基來控制下游蛋白質的活性。PKC可以促進活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成，增加的ROS進一步放大PKC信號傳導［6］。最新研究表明，脂質過氧化會激活PKCβII，其通過激活長鏈酰基輔酶A （CoA）合成酶4 （long-chain-fatty-acid-CoA ligase 4，ACSL4） 進一步放大脂質過氧化，構成脂質過氧化-PKCβII-ACSL4正反饋環，從而產生鐵死亡［7］。在大腦相關神經元中，ACSL4與脂氧合酶 （ALOX） 家族對于鐵超載和多不飽和脂肪酸平衡障礙所引起的鐵死亡起關鍵作用［8］。研究表明，鐵死亡在HLD神經變性的發生和發展中起重要作用，現代醫學在治療HLD神經變性方面使用的藥物有銅螯合劑、腦細胞激活劑等，均可有效改善病人的病情，但存在療效不佳、副作用大等缺點，使其在臨床上的使用受到了制約［8-10］。

肝豆靈片（GDL，皖藥制字Z20050071）是安徽中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，由雞血藤、姜黃、黃連、生大黃、丹參、莪術等中藥組成。方中重用黃連、姜黃，活血行氣、化痰燥濕，取“治痰先治氣，氣順痰自消”之意；丹參、莪術、雞血藤為臣，活血行血，祛瘀散結，活絡通經以祛銅濁之邪外出；佐以大黃清熱通腑，利濕排銅。六味藥共奏行氣活血、祛瘀散結、利濕排銅之功［11］。研究表明，肝豆靈片可以顯著改善HLD神經變性，但其作用機制尚待明確［11-12］。

低劑量Cu2+暴露會導致HT22細胞活力下降，凋亡增多，細胞內氧化產物水平升高，且抗氧化能力降低，提示低劑量Cu2+暴露可引起神經元損傷，而氧化還原水平紊亂可能是其主要機制［13］。課題組前期研究表明，槲皮素能夠通過調控Nrf2/NLRP3通路，降低CuCl2刺激的BV2細胞中炎癥水平，促進細胞自噬［14］；肝豆靈片可通過調節p62/Nrf2信號通路減輕肝豆狀核變性小鼠模型的氧化應激和自噬而減輕認知功能障礙，通過水迷宮實驗、曠場實驗、透射電鏡、HE染色可體現［15］；肝豆靈片可通過調節 TLR4/NF-κB/NLRP3 信號通路減輕肝豆狀核變性神經炎癥［16］。本研究從鐵死亡的角度出發，以PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路為基礎，探討了肝豆靈片對HLD神經變性的保護作用，為后續關于HLD認知障礙的相關研究提供了基礎。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物與細胞

所有小鼠飼養在安徽中醫藥大學教育部重點實驗室動物中心，分別為10只6月齡SPF級DL雄鼠、50只6月齡SPF級TX雄鼠（品系號C3He-Atp7Btx-J/J）。動物房通風良好，溫度適宜，相對濕度為45%～55%，各小鼠自由取水飲食。本動物實驗方案經安徽中醫藥大學動物倫理委員會審查批準（批準文號 AHUCM-mouse-2021011）。

HT22細胞（購自武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號cl-0481）。

1.2 藥物與試劑

肝豆靈片（安徽中醫藥大學第一附屬醫院院內制劑，批號Z20050071，規格0.3 g×150片）；谷胱甘肽片（重慶藥友制藥有限責任公司，生產批號H20050667，規格0.1 g×36片）；完全培養基（武漢普諾賽生命科技有限公司，規格500 mL，貨號PM150210B）；胰蛋白酶-EDTA（上海賽默飛世爾科技有限公司，規格100 mL，貨號25300054）；RNA提取試劑盒（上海賽默飛世爾科技有限公司，批號AM1912）；逆轉錄試劑盒（新貝（上海）生物科技有限公司，批號R202-02）；Fer-1（CSNpharm公司，批號347174-05-4）；亞鐵離子檢測試劑盒（Solarbio公司，批號BC5415）；增強型CCK8 試劑盒（碧云天生物技術有限公司，批號C0038）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒（南京建成生物有限公司，批號A001-3-2、A003-1、A005-1-2）；兔抗β-actin（Affinity公司，AF7018，規格100 μL）；鼠抗PKCβⅡ（Immunoway公司，批號 YT3752，規格40 μL）；兔抗ACSL4（Proteintech公司，批號22401-1-AP，規格50 μL）；兔抗ALOX5（Affinity公司，批號AF4699，規格50 μL）；兔抗 SLC7A11（Proteintech公司，批號26864-1-AP，規格

50 μL）；鼠抗GPX4（Proteintech公司，批號67763-1-Ig，規格50 μL）。

1.3 主要儀器

CX53型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；BioTekEpoch2型全波段酶標儀（美國BioTek公司）；LightCycler 480II型實時熒光定量PCR儀（瑞士Roche公司）；5430R型高速冷凍離心機 （德國Eppendorf公司）；VE180型免疫蛋白印跡系統（瑞士Tanon公司）。

2 實驗

2.1 動物實驗

2.1.1 動物分組與處理

小鼠分為對照組、模型組、肝豆靈片組（GDL組）、Fer-1組和谷胱甘肽組（Glu組），各10只，其中對照組為10只DL雄鼠，其余各組為TX雄鼠。灌胃劑量按70 kg成人每日劑量的9.01倍進行等效換算。通過計算，Glu組按0.18 g/（kg·d）灌胃；Fer-1組按0.001 g/（kg·d）灌胃；GDL組按1.16 g/（kg·d）灌胃［15］。對照組與模型組則是灌胃等劑量生理鹽水。考慮小鼠耐受及生物利用度，其中Fer-1組灌胃1周，其余組灌胃6周。末次灌胃后禁食12 h，按照50 mg/kg劑量對小鼠進行1%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉。取出小鼠海馬組織，10%中性福爾馬林進行固定處理，或液氮處理并于-80 ℃冰箱保存。

2.1.2 觀察肝豆靈片對TX小鼠海馬區鐵死亡的影響實驗

（1）HE 染色觀察TX小鼠海馬區病理學改變

小鼠取材后，將海馬組織用4 ℃冰箱預冷過的磷酸緩沖液（PBS）沖洗，之后用干凈濾紙吸干水分，再用組織固定液固定24 h。之后進行梯度脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟染色、脫水封片等處理，通過光學顯微鏡進行觀察。

（2）微量法檢測各組TX小鼠海馬中Fe2+濃度。

冰浴超聲波破碎樣品后轉速10 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液置于冰上，其余按照試劑盒說明書步驟檢測吸光度并計算亞鐵離子濃度。

（3）PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5 信號通路觀測

通過免疫蛋白印跡（Western blot）法檢測PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路的蛋白表達情況：首先，取出各組小鼠海馬區樣本，加入裂解液，放于冰上裂解20 min，4 ℃離心15 min后吸取上清液，加入SDS-PAGE loading buffer，水浴加熱20 min。配制SDS-PAGE膠、快速電泳液、快速轉膜液，上樣后快速電泳30 min，快速轉膜40 min，將蛋白質轉移至PVDF膜上。為增強檢測效果，使用5%的牛血清白蛋白（BSA）對PVDF膜進行浸泡處理，并在室溫下快速封閉液封閉30 min。隨后，加入一抗，

4 ℃搖床過夜。加入二抗室溫下孵育2 h，后進行曝光顯影，β-actin作為內參。目標條帶的灰度值分析和計算通過ImageJ軟件進行。

2.2 細胞實驗

2.2.1 細胞培養

采用含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM（Dulbecco’s modified eagle medium）培養基，在37 ℃、5%CO2孵箱中培養。

2.2.2 肝豆靈片含藥血清的制備與保存

選用20只SPF級SD大鼠，體重250 g左右，飼養于清潔動物房。隨機分為對照組與肝豆靈片組，其中對照組灌胃等量生理鹽水，肝豆靈片組按70 kg成年人每日劑量的6.25倍進行換算，灌胃0.4 g/（kg·d）的肝豆靈片，連續灌胃5 d。末次灌胃后1 h，進行1%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動脈收集取血。之后4 ℃、4 000 r/min離心15 min，使用0.22 μm濾膜過濾除菌，并將濾出物放在-20 ℃的環境中儲存。

2.2.3 CCK8篩選HT22細胞的Cu2+最佳負荷濃度和最佳作用時間

調整96孔培養板

每100 μL培養液含有5.0×103個HT22細胞

，在37 ℃、5%CO2孵箱中進行培養。分別使用100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400 μmol/L的Cu2+刺激HT22細胞，同時設置空白組。每組包含3個復孔，孵育時間為12、24、36、48 h。之后，每孔加入CCK8 10 μL，并在2 h后使用酶標儀在450 nm處測定各孔的吸光值。在不同時間下，觀察不同濃度的銅離子對HT22細胞的影響，為后續HT22細胞的HLD造模篩選出最佳負荷濃度及最佳作用時間。

2.2.4 CCK8篩選肝豆靈片含藥血清最佳作用濃度與時間

調整96孔培養板每100 μL培養液含有5.0×103個HT22細胞，在37 ℃、5%CO2孵箱中培養。加入最佳負荷濃度Cu2+刺激HT22細胞，并在加Cu2+的孔內，分別加入質量分數為15%、20%、25%、30%、35%、40%的肝豆靈片含藥血清，繼續孵育12、24、36、48 h后，每孔加入10 μL的CCK8溶液，后放入培養箱繼續孵育1 h。取出96孔板，放置于酶標儀中，測定450 nm出吸光值，之后導出數據并進行數據處理，計算出HT22細胞的最佳肝豆靈含藥血清作用濃度與時間。

2.2.5 HT22細胞處理

HT22細胞被分為5組，分別為對照組、模型組、肝豆靈片組、Fer-1組和肝豆靈片+Fer-1組。其中對照組未做其他處理，細胞正常生長。模型組加入317.8 μmol/L的CuCl2溶液進行HLD造模處理［13-14］。肝豆靈片組則加入317.8 μmol/L的CuCl2溶液及30%的肝豆靈片含藥血清共同處理。Fer-1組則是同時加入317.8 μmol/L的CuCl2溶液和鐵死亡抑制劑Fer-1。肝豆靈片+ Fer-1組同時加入肝豆靈片含藥血清、317.8 μmol/L的CuCl2以及鐵死亡抑制劑Fer-1。

2.2.6 PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路觀測

（1）通過Western blot 檢測各組細胞中PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路及鐵死亡相關蛋白PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5、GPX4、SLC7A11的表達情況。

將HT22細胞養至對數生長期，按照2.2.5節中的方法進行處理，同時按照2.1.2中步驟進行Western blot，內參為β-actin。目標條帶的灰度值分析和計算通過ImageJ軟件進行。

（2）RT-qPCR檢測細胞中PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路相關蛋白mRNA的表達情況。

按照2.2.5節細胞處理，采用試劑盒提取細胞總RNA，并進行逆轉錄，合成cDNA。以上述反應液作為熒光定量的模板，進行擴增。使用GAPDH作為內參，進行擴增。利用2-ΔΔCT計算相對表達量。引物由北京擎科生物科技股份有限公司進行設計，詳見表1。

（3）微板法檢測各組HT22細胞中SOD、MDA、GSH-Px 水平。

按照 2.2.5 項進行細胞處理，在37 ℃、5%CO2孵箱中進行培養，分別在冰上研磨裂解后，3 000 r/min 15 min離心取上清液。其余步驟按照試劑盒說明書，檢測MDA、SOD、GSH-Px含量。

2.2.7 統計學分析與處理

使用GraphPad Prism 9.5.1軟件進行數據統計與分析，兩組數據相較使用t檢驗，多組數據相較使用單因素方差分析（OnewayANOVA），以（均數±標準差）來表示所有數據，Plt;0.05時差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 肝豆靈片對TX小鼠海馬區的影響

使用HE染色觀察發現，在正常的小鼠海馬區中，未見顯著細胞死亡，其細胞的形態正常，未見神經元固化、萎縮、顏色加深；與對照組相比，模型組小鼠的海馬區中出現顯著細胞壞死，固化、萎縮的神經元數量明顯增多；肝豆靈片組、Fer-1組、谷胱甘肽組與模型組相比，神經元結構松散，未見明顯神經元固化、萎縮、顏色加深，顯示細胞壞死明顯減輕。見圖1。

3.2 肝豆靈片對TX小鼠海馬組織中Fe2+水平的影響

結果顯示，與對照組相比，模型組Fe2+相對濃度（2.39±0.08）顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，肝豆靈片組、Fer-1組、谷胱甘肽組Fe2+濃度均有下降，其中肝豆靈片組 Fe2+相對濃度（1.65±0.07）明顯降低（P＜0.05）。相比于肝豆靈片組，谷胱甘肽組Fe2+的相對濃度為（1.25±0.05）下降最為明顯（P＜0.05），這可能與谷胱甘肽片具有消除體內自由基、抗氧化作用相關。結果表明，肝豆靈片與Fer-1均可以降低組織中Fe2+濃度，進一步佐證TX小鼠大腦海馬區中發生了鐵死亡，而肝豆靈片可改善鐵死亡，這與銅過量會導致GPX4自噬降解進而促進鐵死亡結果相一致［3］。見圖2。

3.3 免疫蛋白印跡（Western blot）法檢測各組小鼠PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路相關蛋白的表達情況

在模型組TX小鼠海馬區中，與正常對照組相比，PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05），其中PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的蛋白相對表達量分別為1.431±0.066、1.523±0.087、1.566±0.038；結合模型組Fe2+相對濃度顯著增加（P＜0.05），提示TX小鼠海馬區中存在鐵死亡，這與PKCβⅡ激活ACSL4，增強脂質過氧化水平進而誘導鐵死亡一致［7］；而在肝豆靈片組、Fer-1組、谷胱甘肽組中，與模型組小鼠比較發現，PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的蛋白表達水平均降低（Plt;0.05），其中肝豆靈片組中PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的蛋白相對表達量下降，分別為1.272±0.070、1.124±0.058、1.131±0.049，表明肝豆靈片具有抑制PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路的作用。見圖 3。

3.4 CCK8法觀察Cu2+最佳負荷濃度和作用時間

與對照組比較，Cu2+在負荷12、24 h后，HT22細胞增殖抑制率在Cu2+濃度高于250 μmol/L后細胞增殖存活率降低。Cu2+在負荷36、48 h后，Cu2+濃度高于200 μmol/L時，HT22細胞增殖存活率顯著降低，并且以劑量依賴性方式抑制HT22細胞的增殖。實驗結果表明，作用12、24 h時Cu2+對HT22細胞的抑制較穩定，此時Cu2+對HT22細胞的IC50值分別為258.8、317.8 μmol/L。因此，本實驗選擇258.8 μmol/L、317.8 μmol/L，12、24 h作為HT22細胞的Cu2+最佳負荷濃度和時間繼續后期GDL含藥血清的藥物濃度篩選。見圖4。

3.5 CCK8法觀察肝豆靈片含藥血清最佳作用濃度和作用時間

數據結果表明，15%肝豆靈片含藥血清組在12、24、36、48 h作用時間內細胞存活率并沒有明顯變化；而30%肝豆靈片含藥血清組在12、24 h后細胞存活率有所提升，尤其是24 h后提升顯著，為92.643±2.652，但在36、48 h細胞存活率下降；20%肝豆靈片含藥血清組在 12、24、36 h后細胞活性值沒有明顯的變化；35%肝豆靈片含藥血清組在12、36、48 h的存活率降低；40% 肝豆靈片含藥血清組在12、36、48 h細胞存活率有所下降。綜上，本研究選用體積分數30%肝豆靈片含藥血清與24 h作為后續細胞實驗的最佳濃度及最佳作用時間。見圖5。

3.6 肝豆靈片對HT22細胞PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路相關蛋白表達的影響

Western Blot法檢測HT22細胞中通路相關蛋白表達情況。如圖6所示，與對照組比較，在模型組中，PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的蛋白表達水平均不同程度升高（Plt;0.05）；而與模型組相比，肝豆靈片組、Fer-1組中PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的蛋白表達水平均顯著降低（Plt;0.05）；與肝豆靈片組相比，肝豆靈片+Fer-1組中PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5蛋白下降明顯（Plt;0.05）。

3.7 肝豆靈片對HT22細胞鐵死亡的影響

Western Blot法檢測HT22細胞SLC7A11、GPX4蛋白表達情況。結果表明，與對照組比較，模型組細胞中SLC7A11、GPX4表達水平明顯下降（Plt;0.05），這與銅過量會導致GPX4自噬降解進而促進鐵死亡結果一致［3］；與模型組比較，肝豆靈片組、Fer-1組細胞中SLC7A11、GPX4表達水平顯著提高（Plt;0.05），Fer-1組中SLC7A11提升明顯（Plt;0.05）。這表明CuCl2誘導的HT22細胞中存在鐵死亡，肝豆靈片可以抑制HT22細胞中的鐵死亡。見圖7。

3.8 肝豆靈片對HT22細胞PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路相關mRNA表達的影響

RT-qPCR檢測HT22細胞PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5mRNA表達結果：與對照組比較，模型組PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5 mRNA表達顯著升高（Plt;0.05）；而與模型組比較，肝豆靈片組和Fer-1組PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5 mRNA表達均下降（Plt;0.05）。顯示肝豆靈片可以降低PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5 mRNA的表達。見圖8。

3.9 肝豆靈對HT22細胞中SOD、MDA、GSH-Px水平的影響。

結果顯示，與正常組比較，模型組中MDA濃度顯著增加（P＜0.05），SOD活力及GSH-Px濃度明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，肝豆靈片組MDA濃度下降，SOD活力與GSH-Px濃度明顯升高（P＜0.05）。相比于肝豆靈片組，Fer-1+肝豆靈片組MDA的下降、SOD活力的提升及GSH-Px濃度的增加最為明顯。見圖9。

4 討論

肝豆靈片具有清熱解毒、祛瘀散結、利膽排銅的功效，能夠祛濕熱、疏通瘀血，從而達到治療的目的。方中黃連具有清熱燥濕清火去毒的功用，小檗堿是其主要藥效物質，其抗炎作用顯著，目前研究表明，小檗堿可通過調控Nrf2-HO-1/GPX4信號途徑抑制鐵死亡，從而產生抗炎作用［17］；姜黃能破血活血，行氣止痛，其有效成份為姜黃素及揮發油，目前研究結果表明，姜黃素通過促進銅排泄和抑制鐵死亡從而產生對HLD的保護作用［9］；丹參有活血祛瘀養血安神之效；莪術具有行氣破血消積止痛之用；雞血藤可活血舒筋養血調經；大黃則有瀉火解毒清熱化瘀的功用；有研究顯示，甘草含藥血清可以通過Nrf2/HO-1通路抑制鐵死亡，改善細胞炎癥［18］。

研究表明，鐵死亡與HLD神經變性相關，大腦長期暴露于高濃度銅最終會導致星形膠質細胞鐵死亡，并促進神經元細胞鐵死亡，進而加重HLD神經變性。銅可以促進GPX4自噬降解進而影響脂質過氧化水平，從而導致鐵死亡［3］。PKCβⅡ是蛋白激酶C（PKC）家族中的一種，它在多種細胞過程中發揮著重要作用，比如細胞增殖、細胞死亡和氧化應激反應［6］。脂質過氧化激活PKCβⅡ，PKCβⅡ磷酸化并激活ACSL4，進一步放大脂質過氧化水平，從而促進鐵死亡［7］。MDA是脂質過氧化的一種代表產物，會引起細胞代謝與功能的障礙，促進細胞死亡。而SOD、GSH-Px作為抗氧化酶可以防止ROS對組織、細胞造成損傷。細胞內的 GSH-Px4 通過利用谷胱甘肽將脂質過氧化氫物轉化為脂醇，并降低ROS的形成與累積。ACSL4能夠通過促進花生四烯酸（Arachidonic acid，AA）轉化成多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA），進而導致脂質過氧化物致死性積累，促進鐵死亡的發生。

實驗結果顯示，PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路參與了肝豆狀核變性中鐵死亡的發生與發展。當PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路被激活，促進細胞內脂質過氧化形成，導致細胞鐵死亡。在CuCl2誘導的HT22細胞HLD模型中，MDA濃度明顯增加，SOD、GSH-Px濃度顯著減少，PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的蛋白表達水平明顯上升，而SLC7A11、GPX4蛋白水平顯著下調，PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的mRNA水平明顯上升，提示CuCl2誘導的HT22細胞HLD模型中存在鐵死亡。經肝豆靈片干預后，SOD、GSH-Px濃度增多，MDA濃度減少，PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的蛋白表達水平顯著下調，而SLC7A11、GPX4蛋白水平顯著上調，PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的mRNA水平顯著下調。在TX小鼠海馬組織中，模型組中Fe2+濃度明顯上升，HE染色中模型組海馬組織細胞固化萎縮，細胞壞死明顯增多，模型組中PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的蛋白表達水平顯著上調，經肝豆靈片干預后，各組Fe2+濃度減少，細胞壞死減少，PKCβⅡ、ACSL4、ALOX5的蛋白表達水平顯著下調。以上結果表明肝豆靈片能夠通過抑制PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路降低脂質過氧化水平，抑制鐵死亡的發生。課題組前期在體內體外實驗驗證肝豆靈片對HLD的治療作用，并探究了Nrf2信號通路對小膠質細胞氧化應激及鐵死亡的影響［14］，肝豆靈片可明顯改善TX小鼠認知功能［15］，同時肝豆靈片通過抑制TLR4/NF-κB/NLRP3信號通路減輕HLD神經炎癥［16］。

綜上所述，本研究旨在探討HT22細胞HLD模型中，存在鐵死亡的發生，肝豆靈片作為肝豆狀核變性臨床用藥，可以通過調控PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路改善CuCl2誘導的HT22細胞中的鐵死亡，其機制可能與抑制PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5通路降低脂質過氧化水平進而抑制鐵死亡有關；同時體內實驗進一步佐證了TX小鼠大腦海馬中存在鐵死亡，肝豆靈片通過調控PKCβⅡ/ACSL4/ALOX5信號通路可以改善神經元細胞鐵死亡。本項研究為肝豆靈片治療HLD神經變性提供了一定的實驗依據，對中醫藥治療HLD具有現實意義，但其作用機制仍需進一步探究，比如中醫藥對于不同證型HLD的治療作用以及作用機制。

參考文獻：

［1］錢南南， 楊文明， 魏濤華， 等. 肝豆狀核變性伏毒阻絡病因病機探要［J］. 中國實驗方劑學雜志， 2022， 28（12）： 133-140. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20221291.

［2］CZONKOWSKA A， LITWIN T， DUSEK P， et al. Wilson disease［J］. Nature Reviews Disease Primers， 2018， 4（1）： 21. DOI： 10.1038/s41572-018-0018-3.

［3］XUE Q， YAN D， CHEN X， et al. Copper-dependent autophagic degradation of GPX4 drives ferroptosis［J］. Autophagy， 2023， 19（7）： 1982-1996. DOI： 10.1080/15548627.2023.2165323.

［4］QIU Y M， CAO Y， CAO W J， et al. The application of ferroptosis in diseases［J］. Pharmacological Research， 2020， 159： 104919. DOI： 10.1016/j.phrs.2020.104919.

［5］RYAN S K， ZELIC M， HAN Y N， et al. Microglia ferroptosis is regulated by SEC24B and contributes to neurodegeneration［J］. Nature Neuroscience， 2023， 26（1）： 12-26. DOI： 10.1038/s41593-022-01221-3.

［6］LEE H B， YU M R， SONG J S， et al. Reactive oxygen species amplify protein kinase C signaling in high glucose-induced fibronectin expression by human peritoneal mesothelialcells［J］. Kidney International， 2004， 65（4）： 1170-1179. DOI： 10.1111/j.1523-1755.2004.00491.x.

［7］ZHANG H L， HU B X， LI Z L， et al. PKCβII phosphorylates ACSL4 to amplify lipid peroxidation to induce ferroptosis［J］. Nature Cell Biology， 2022， 24（1）： 88-98. DOI： 10.1038/s41556-021-00818-3.

［8］SUN X， ZHANG X Y， YAN H， et al. Protective effect of curcumin on hepatolenticular degeneration through copper excretion and inhibition of ferroptosis［J］. Phytomedicine： International Journal of Phytotherapy and Phytopharmacology， 2023， 113： 154539. DOI： 10.1016/j.phymed.2022.154539.

［9］BOUCHAOUI H， MAHONEY-SANCHEZ L， GARON G， et al. ACSL4 and the lipoxygenases 15/15B are pivotal for ferroptosis induced by iron and PUFA dyshomeostasis in dopaminergic neurons［J］. Free Radical Biology amp; Medicine， 2023， 195： 145-157. DOI： 10.1016/j.freeradbiomed.2022.12.086.

［10］WEISS K H， ASKARI F K， CZLONKOWSKA A， et al. Bis-choline tetrathiomolybdatein patients with Wilson’s disease： an open-label， multicentre， phase 2 study［J］. The Lancet Gastroenterology amp;Hepatology， 2017， 2（12）： 869-876. DOI： 10.1016/S2468-1253（17）30293-5.

［11］張玉婷， 李立華， 陳浩. 新安特色制劑肝豆靈片治療肝豆狀核變性的研究進展［J］. 中國實驗方劑學雜志， 2022， 28（23）： 97-102. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20222396.

［12］王艷昕， 鮑遠程， 孫敏， 等. 肝豆靈干預銅負荷大鼠認知障礙及海馬細胞凋亡的研究［J］. 中國臨床藥理學雜志， 2015， 31（23）： 2333-2336. DOI： 10.13699/j.cnki.1001-6821.2015.23.018.

［13］姜琨彥， 王建鈺， 王濤， 等. 低劑量銅暴露對HT22神經細胞氧化應激和凋亡的誘導作用［J］. 空軍軍醫大學學報， 2022， 43（7）： 679-684. DOI： 10.13276/j.issn.2097-1656.2022.06.004.

［14］江張勝， 董婷， 唐露露， 等. 槲皮素對CuCl2誘導的小鼠BV2小膠質細胞神經炎癥的保護機制研究［J］. 現代中藥研究與實踐， 2022， 36（6）： 29-33. DOI： 10.13728/j.1673-6427.2022.06.006.

［15］JIANG Z S， DONG T， WANG Y， et al. Gandouling alleviates cognitive dysfunction by regulates the p62/Nrf2 signaling pathway to reduce oxidative stress and autophagy in mice models of Wilson’s disease［J］. Arabian Journal of Chemistry， 2023， 16（2）： 104477. DOI： 10.1016/j.arabjc.2022.104477.

［16］聞雨雅， 董婷， 江張勝， 等. 肝豆靈片通過調節TLR4/NF-KB/NLRP3信號通路減輕肝豆狀核變性神經炎癥的機制［J］. 山東科學， 2023， 36（4）： 42-51. DOI： 10.3976/j.issn.1002-4026.2023.04.006.

［17］黃慶洋， 紀東東， 田繡云， 等. 小檗堿通過激活Nrf2-HO-1/GPX4通路抑制小鼠海馬神經元HT22細胞的鐵死亡［J］. 南方醫科大學學報， 2022， 42（6）： 937-943. DOI： 10.12122/j.issn.1673-4254.2022.06.19.

［18］孔金融， 施高翔， 侯靜， 等. 基于Nrf2/HO-1通路抑制鐵死亡探究甘草含藥血清對LPS誘導的Caco2細胞炎癥的影響［J］. 中國實驗方劑學雜志， 2023， 29（16）： 144-153. DOI： 10.13422/j.cnki.syfjx.20230601.