基于系統藥理學和分子對接探討浙貝母-瓜蔞配伍調控慢性阻塞性肺病并發心臟衰竭的作用機制

摘要：基于GEO數據庫挖掘慢性阻塞性肺疾病（COPD）和心力衰竭（HF）關聯靶點，檢索浙貝母、瓜蔞化學成分及靶點，以獲得其調控COPD并發HF潛在靶點，挖掘靶點功能及通路注釋分析，構建組織特異性蛋白相互作用（PPI）網絡。浙貝母-瓜蔞影響COPD并發HF進展共涉及靶點227個，包括表達上調基因153個，表達下調基因74個；網絡拓撲學分析顯示PPI網絡平均介數為0.4，平均度值為1.83，關鍵靶點包括RPS23、SNU13、NOL6、ELAVL1、NCL等；細胞組分定位于內膜系統、核內體和細胞外囊泡；生物學過程涉及囊泡介導的運輸、基于微管的運動、細胞內蛋白質運輸等；信號通路涉及MAPK信號傳導途徑；MCODE分析發現Cluster 1涉及TKT、ENO1、NCL、KIF1B等，參與調控驅動蛋白、雌激素的高爾基體運輸；Cluster 2涉及SIN3B、PHF20、CTBP1、XPNPEP1等，參與調控組蛋白反應；心耳、左心室、肺的組織特異性PPI網絡提示浙貝母-瓜蔞配伍可能通過調控ELAVL1-ENO1-NCL軸影響COPD并發HF進展；分子對接表明其“寬胸散結”主要活性成分瓜蔞酸、“化痰散結”主要成分貝母新堿與ELAVL1、ENO1、NCL蛋白質靶標的結合高度穩定，且貝母新堿與靶蛋白結合力強于瓜蔞酸，體現兩者配伍后先治肺再調心，相須為用以實現心肺共治的作用特點。

關鍵詞：浙貝母；瓜蔞；慢性阻塞性肺病；心臟衰竭；系統藥理學

中圖分類號：R285"" 文獻標志碼：A"" 文章編號：1002-4026（2024）04-0045-11

開放科學（資源服務）標志碼（OSID）：

The mechanism of Fritillariae Thunbergii Bulbus-Trichosanthis Fructu pairing

in regulating heart failure complicated by chronic obstructive pulmonary

disease based on systems pharmacology and molecular docking

FANG Mengxiang1 ，CHENG Cheng2，CAO Mingchen2*，REN Wei2，YANG Zhiwei2，LI Wenjing2，XIN Xiaowei2 ，LIU Yuefen2，XU Long2

（1. The Second Traditional Chinese Medicine Hospital of Qingdao West Coast New District， Qingdao 266427， China;

2. The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266300， China）

Abstract∶We used the Gene Expression Omnibus database to identify targets associated with chronic obstructive pulmonary disease （COPD） and heart failure（HF）. Then， we explored the chemical composition and targets of Fritillaria thunbergii-Trichosanthis fructus to determine their potential to regulate COPD complicated by HF. We analyzed the target function and pathway annotation to create a network of tissue-specific protein-protein interactions （PPI）.A total of 227 targets were involved in regulating COPD complicated by HF progression through Fritillaria thunbergii-Trichosanthis fructus， including 153 upregulated and 74 downregulated genes.Topological analysis showed that the average median of the PPI network was 0.4， and the average degree value was 1.83， with key targets including RPS23， SNU13， NOL6， ELAVL1. The cellular components were mainly located in the endomembrane system， nuclear endosomes， and extracellular vesicles. Biological processes mainly involved vesicle-mediated transport， microtubule-based motility， and intracellular protein transport.The relevant signaling pathway was the MAPK signaling pathway.MCODE analysis revealed two core clusters： Cluster 1 involves genes such as TKT，ENO1， NCL， and KIF1B， which are involved in regulating the Golgi transport of kinesin and estrogen， and Cluster 2 involves genes such as SIN3B， PHF20， CTBP1， and XPNPEP1， which are involved in the regulation of histone-associated responses.Tissue-specific PPI networks in the auricles， left ventricle， and lungs suggest that the Fritillaria thunbergii-Trichosanthis fructus pairing may affect the progression of COPD complicated by HF through the regulation of the ELAVL1-ENO1-NCL axis.Molecular docking showed that the binding of trichosanic acid， the main active ingredient involved in relieving the chest and dispersing mass， and peimisine， the main ingredient involved in dissipating phlegm and dispersing mass， to the protein targets ELAVL1， ENO1， and NCL was highly stable， and that the binding of peimisine to said three target proteins was stronger than that of trichosanic acid.This indicates that the combination of the two ingredients is first used to treat the lungs and then to regulate the heart， and that they are mutually necessary， resulting in therapeutic effects on both the heart and lungs.

Key words∶ Fritillariae Thunbergii Bulbus ；Trichosanthis Fructus; chronic obstructive pulmonary disease; heart failure; systems pharmacology

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種進行性的以不可逆氣流受限為特點的慢性氣道炎癥性疾病，因高患病率和病死率，成為目前世界范圍內重要的公共衛生問題之一［1］。隨著COPD的進展，約有25％的患者后期發展為持續性肺動脈高壓，心室結構發生病變，出現心力衰竭（heart failure，HF）等并發癥，嚴重影響COPD預后［2］。COPD相關心衰（以下簡稱COPD-HF）主要臨床表現為心悸、胸悶、咳嗽氣喘、不能平臥、吐泡沫樣痰、紫紺、少尿、水腫、上腹部脹滿和疼痛、食欲不振、頸靜脈怒張、肝臟腫大等，在中醫學屬于“喘證”“水腫”“痰飲”范疇，主要病機在于痰飲上凌心肺所致，由于肺、脾、腎功能失調導致津液代謝失常、水液停聚于肺部，血氣長期運行不暢、心脈瘀阻［3］。“其人喘滿，心下痞堅，面色黝黑”與心肺功能受損、肝脾充血腫大及缺血缺氧等COPD相關心臟衰竭表現一致。

目前COPD治療中常用支氣管舒張劑、糖皮質激素等，合并心衰時應用抗血小板類、他汀類藥物等。這些藥物短期內可有效緩解癥狀并減少急性加重次數，但長期用藥引發的副作用如耐藥性、多重感染、消化道潰瘍、免疫力低下、骨質疏松、肝損傷等問題不容忽視［4-5］。浙貝母-瓜蔞（Fritillariae Thunbergii Bulbus-Trichosanthis Fructus，FTBTF）配伍是中醫治療肺部疾病常用的藥對，浙貝母歸肺、心經，具有清熱化痰散結、潤肺止咳之功，瓜蔞甘寒而潤心肺，善祛痰散結、清熱滌痰、利氣潤燥，兩者相須為用，以增強清肺、化痰、止咳之功效。中醫學認為兩者均作用于肺、心，可能在COPD相關心臟衰竭的治療中有一定的價值，但目前尚無這一藥對在COPD合并心衰治療相關的分子機制研究。

目前，系統藥理學、基因組學和生物信息學等新興學科的不斷發展，促進多學科技術交叉應用融合，系統藥理學研究思路符合中藥作用于人體時表現出來的整體性、協同性等特點，有助于發現中藥“新功能”及臨床應用的新途徑，更好地指導臨床合理用藥。

1 研究方法

1.1 COPD-HF相關數據集的預處理

以關鍵字“chronic obstructive pulmonary disease”、“heart failure”檢索GEO基因表達綜合數據庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）數據庫，分別獲得COPD和HF相關數據集；基于R軟件包inSilicoMerging對HF的數據集合并，合并矩陣后應用Empirical Bayes法去除批次效應。

1.2 差異表達基因（differential expressed genes， DEGs）分析

R語言的“sva”包獲取去除批次效應后的歸一化基因表達矩陣文件，“limma”包分析獲取DEGs；t檢驗法計算的P值，Benjamini和Hochberg法計算調整后的P值。

1.3 浙貝母-瓜蔞活性小分子配體庫構建及靶點篩選

基于中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP， http：//tcmspw.com/tcmsp.php ）、BATMAN-TCM數據庫 （http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/），檢索浙貝母、瓜蔞的化學成分及靶點信息，下載活性化合物的SMILES格式，整理涉及的靶點信息。

1.4 FTBTF-COPD-HF靶點富集

FUNRICH軟件將FTBTF活性成分靶點蛋白與已篩選的COPD-HF所有 Gene Symbol （relevance score≥ 0.19）富集靶點蛋白，獲得FTBTF-COPD-HF的相關富集靶點？厱

1.5 構建蛋白相互作用網絡（protein-protein interaction networks， PPI）

FTBTF-COPD-HF相應的靶點信息映射至String 數據庫，設置Organism為“homo sapines”后，計算每個蛋白相互作用程度的P值，設置為最高置信度（score≥0.95）后，選取P＞0.9的最高置信度的蛋白關系，將分析結果導入Cytoscape軟件可視化，Network Analysis插件展開網絡拓撲學分析，構建FTBTF-COPD-HF靶點的PPI網絡圖。

1.6 多數據庫聯合挖掘靶點功能及通路注釋分析

對于每個給定的基因列表，使用GO生物過程、KEGG途徑、Reactome基因集的本體論來源開展生物學途徑和信號通路富集分析；基因組中的所有基因都被作為富集背景，篩選標準為Plt;0.01，最小計數為3，觀察到計數與偶然預期計數之間比率gt;1.5的基因被富集，并根據相似性歸入集群；多重檢驗規則根據累積超幾何分布計算P值，Benjamini-Hochberg程序計算q值；Kappa分數作為相似度指標（＞0.3）對富集基因分層聚類。

1.7 中樞基因的鑒定和驗證

基因的模塊內連接性等于該基因與該模塊中其他基因之間的相關程度之和，通過分子復合物檢測方法（molecular complex detection， MCODE）插件識別該PPI網絡中的中樞模塊。

1.8 構建組織特異性PPI網絡

FTBTF-COPD-HF的富集基因集映射至DifferentialNet數據庫，分別選取人體組織類型為心耳、左心室、肺，構建組織特異性表達的PPI表達網絡。

1.9 分子對接實驗

基于計算機蛋白-配體對接軟件AutodockVina 1.2.2（http：//autodock.scripps.edu/）評估候選小分子與其靶標之間的結合能和相互作用模式并用于模型可視化，從PubChem化合物數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲得活性化合物分子結構；從PDB（http：//www.rcsb.org/）下載獲取蛋白的3D結構；首先準備蛋白和配體文件，將所有蛋白質和分子文件都轉換為PDBQT格式，去除了所有水分子，并添加極性氫原子。網格框居中以覆蓋每個蛋白質的結構域并適應自由分子運動。對接口袋設置為一個3 nm×3 nm×3 nm的正方體口袋，格點距離為0.05 nm。

2 結果與分析

2.1 COPD-HF數據集的分析前預處理

檢索GEO數據庫，分別獲得COPD相關數據集GSE475，心衰相關數據集GSE2240、GSE79768、GSE41177。基于R軟件包inSilicoMerging對GSE2240、GSE79768、GSE41177數據集合并，合并矩陣后應用Empirical Bayes法去除批次效應。箱線圖（圖1（a））顯示去除批次效應后各數據集之間的數據分布趨于一致，中位數位于一條線；圖1（b）所示分別為去除批次效應前后的密度圖，顯示去除批次效應后各個數據集之間的數據分布趨于一致，均值和方差相近；圖1（c）所示分別為去除批次效應前后的UMAP圖，顯示去除批次效應后各數據集之間的樣本相互聚類交織在一起，提示較好地去除了批次效應。

2.2 COPD-HF的差異表達基因（DEGs）

使用R軟件及其擴展包分析COPD相關數據集GSE475和合并后的心衰相關數據集，數據預處理后獲得基因表達矩陣，其中COPD相關基因8 780個，HF相關基因1 151個。所有基因的火山圖如圖2所示。基因熱圖列出50個最顯著的下調基因和上調基因（圖3）。

2.3 浙貝母-瓜蔞活性小分子配體庫構建及靶點篩選

TCMSP數據庫以口服生物利用度（OB）≥20，類藥性（DL）≥0.1為標準對浙貝母-瓜蔞成分篩選，涉及活性化合物28個及相關靶點75個；BATMAN-TCM數據庫的目標預測方法給出的得分超過給定分界線“score cutoff≥2”被確定為潛在靶標，涉及浙貝母-瓜蔞的55個活性成分及1 875個活性靶點。合并兩個數據庫涉及的活性化合物及靶點信息，分別下載活性化合物的SMILES格式。

2.4 FTBTF-COPD-HF相關靶點

如圖4所示，浙貝母-瓜蔞影響慢性阻塞性肺病并發心臟衰竭進展所涉及的靶點共227個，包括COPD-HF表達上調的基因153個，表達下調的基因74個。

2.5 構建FTBTF-COPD-HF的蛋白-蛋白相互作用（PPI）網絡

如圖5中所示，顏色越深，面積越大，表示靶點度值越大，在網絡中越重要。該網絡包含226個節點和207條相互作用關系，網絡拓撲學分析顯示該網絡平均介數為0.4，平均度值為1.83，P值0.115。涉及的關鍵靶點如RPS23、SNU13、NOL6、ELAVL1、NCL、EEF1A1等。

2.6 基于DAVID數據庫的關鍵靶點GO細胞組分富集分析

基于FTBTF-COPD-HF關鍵靶點的PPI互作網絡，利用R語言的ClusterProfiler功能包分別從細胞組分（cellular component， CC）進行GO分析的標準化描述。結果如表1，表明FTBTF-COPD-HF相關細胞組分主要定位于內膜系統、核內體和細胞外囊泡。

2.7 信號通路和生物學過程富集分析

富集結果見表2與圖6，FTBTF-COPD-HF在生物學過程主要涉及囊泡介導的運輸、基于微管的運動、蛋白質復合體的寡聚、細胞內蛋白質運輸、核胞漿運輸、血管發育等；Reactome通路主要涉及細胞對壓力的反應、小分子物質的運輸、鳥苷酸三磷酸酶（RHO GTPases）激活Formins蛋白等；信號通路方面主要涉及MAPK信號傳導途徑。

2.8 中樞模塊基因的鑒定和驗證

如圖7所示，在STRING數據庫中分析上述226個基因編碼蛋白間的相互作用關系，接著采用Cytoscape軟件中的MCODE法分析，發現Cluster 1和Cluster 2子網絡處于中樞核心位置，總共包含18個關鍵基因。其中Cluster 1涉及TKT、ENO1、NCL、KIF1B、CLIP4等基因；Cluster 2涉及SIN3B、PHF20、CTBP1、XPNPEP1等基因。

映射上述核心基因至Reactome 生物分子通路知識數據庫分析，結果如表3所示，Cluster 1主要涉及驅動蛋白、COPI依賴的高爾基體至ER逆行運輸及高爾基體-ER逆行運輸；Cluster 2主要涉及基因表達的表觀遺傳調控、形成含WDR5的組蛋白修飾復合物、組蛋白修飾調控。

2.9 組織特異性PPI網絡的構建

DifferentialNet數據庫收集組織特異性蛋白質-蛋白質相互作用數據，顯示了人類不同類型組織中的蛋白質相互作用。如圖8所示，映射相關基因至DifferentialNet數據庫并選取人體組織為心耳、左心室、肺，構建FTBTF-COPD-HF組織特異性PPI網絡，結果如圖所示，發現ELAVL1-ENO1-NCL軸在各個組織表達網絡中均處于核心位置，推測浙貝母-瓜蔞配伍可能通過調控ELAVL1-ENO1-NCL軸的表達影響COPD并發心臟衰竭的進展。

2.10 分子對接結果

根據“成分-靶點-通路”網絡圖核心網絡和通路富集篩選出的核心靶點ELAVL1、ENO1、NCL，與度值排名靠前的瓜蔞酸、貝母新堿作分子對接，以AutodockVina獲得候選化合物與蛋白質相互作用的結合能。化合物配體分子與受體蛋白之間的結合能越低則親和力越高，結合構象也越穩定，以分子對接評分（docking score）大于5表示結合能力較好，大于7時表示結合能力極好。對接可視化結果如圖9所示，其中瓜蔞活性成分瓜蔞酸與ELAVL1、ENO1、NCL的分子對接評分分別為-25.916、-28.424、-24.244" kJ/mol；而浙貝母活性成分貝母新堿與ELAVL1、ENO1、NCL的分子對接評分分別為-34.694、-40.546、-44.308 kJ/mol，結果表明，活性化合物通過可見的氫鍵和強靜電相互作用與蛋白質靶標結合高度穩定。

3 結論與討論

慢性阻塞性肺疾病的病變位置主要為氣道和肺血管，發作時患者心肌缺血缺氧，收縮力下降，極易引發肺動脈高壓，引發心力衰竭［6］。信號通路富集分析提示浙貝母-瓜蔞配伍調控COPD-HF的途徑涉及鳥苷酸三磷酸酶（RHO GTPases） 激活Formins蛋白，并可能與有機硝酸脂類藥物的作用機制類似，主要通過激活機體鳥苷酸環化酶的活性以舒張血管平滑肌，從而降低心臟負荷，擴張靜脈血管與冠狀小動脈，降低壁內壓，有效改善心肌缺血狀態，促進心功能的恢復。肺泡結構破壞是COPD形成肺氣腫的重要因素和重要病理狀態，浙貝母-瓜蔞配伍調控絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號轉導途徑介導的肺泡表面活性物質（PS）的合成和分泌，在維持肺泡結構穩定中發揮重要作用［7-8］；MAPK信號通路還與HF進展過程中心肌細胞凋亡與肥大存在密切聯系［8-9］。GO富集分析結果提示浙貝母-瓜蔞配伍調控COPD-HF細胞組分主要定位于內質體和細胞外囊泡（EVs）［10-11］。EVs通過向靶細胞運送不同物質（如microRNA、lncRNA、circRNA和mRNA）來介導細胞間的通信［12-13］，參與肺部細胞間的交流并調節肺部病理生理過程［14-15］，并可能與慢性呼吸道炎癥性疾病的發生有關［16］。

COPD患者在不完全可逆的氣流受限條件下機體長期缺氧，肺循環阻力逐漸增加，肺動脈血管內膜功能異常增強并伴隨血管纖維化和閉塞，肺循環結構發生重塑導致肺動脈高壓。肺動脈壓升高導致右心室功能失代償，右心室擴大、缺氧、血流量相對增加、持續性高碳酸血癥，誘發心室肥厚發展為肺心病；后期甚至出現右心衰竭，最終影響左心功能并發展為全心衰竭。因此，構建FTBTF-COPD-HF組織特異性PPI網絡，提出浙貝母-瓜蔞配伍可能通過調控ELAVL1-ENO1-NCL軸的表達影響COPD并發HF的進展，涉及肺部氣道重塑、肺血管內皮細胞功能障礙、肺損傷、肺纖維化及感染相關的炎癥途徑，心肌細胞相關損傷、糖代謝及心肌纖維化、心肌肥厚等。ELAV樣蛋白1（ELAVL1）是一種mRNA穩定蛋白，在COPD的肺組織中高度表達，影響COPD氣道重塑過程［17］；ELAVL1在衰竭心臟中表達下調，與HF過程中心律失常及房顫的風險相關［18］；調控ELAVL1表達能夠減輕過氧化氫誘導的心肌細胞損傷［19］。肺血管重塑是肺動脈高壓的核心環節， 其始動因素涉及肺動脈內皮細胞功能障礙，α烯醇酶（alpha enolase，ENO1）是肺血管內皮細胞表達的低氧應激蛋白，靶向ENO1-PI3K-Akt-mTOR軸改善低氧相關炎癥導致的線粒體功能障礙，調節內皮細胞功能紊亂和代謝重編程，減緩低氧性肺動脈高壓的進展［20］；而HF時由于能量供應減少和代謝重塑，心肌供能底物從脂肪酸轉向糖類等碳水化合物，同樣涉及糖代謝相關基因ENO1［21］；抑制ENO1轉錄通過影響糖酵解途徑減少心肌梗死后的心肌纖維化［22］。核仁是感染過程中炎癥 RNA 的衰變場所，核仁素（nucleolin，NCL）則是穿梭于細胞核、細胞漿與細胞膜之間的蛋白，在肺部病原微生物感染和自身免疫疾病中發揮一定作用，作為引導因子代表感染期間維持炎癥基因表達完整性和免疫穩態的核仁依賴性途徑［23］。肺泡巨噬細胞膜表面的NCL參與脂多糖內化，抑制NCL表達能夠減弱核因子活性進而減少TNF-α和IL-6表達，減輕肺損傷［24］；抑制NCL表達還減輕二氧化硅誘導的肺纖維化進展［25］。NCL在缺血-再灌注損傷大鼠心肌及氧化應激損傷的心肌細胞中表達下調且蛋白發生斷裂［26］；還參與壓力負荷增加相關的心肌肥厚的進展過程［27］。

分子對接證實瓜蔞酸與貝母新堿，與ELAVL1、ENO1、NCL靶蛋白的結合高度穩定，且貝母新堿與3種蛋白的結合力均強于瓜蔞酸。貝母新堿作為浙貝母“化痰散結”的主要活性成分，通過作用于M受體、拈抗內鈣釋放，從而達到舒張氣管平滑肌實現平喘的作用，同時明顯減輕脂多糖所致肺組織病理學變化，減少黏液分泌并降低肺泡灌洗液中總蛋白、白細胞總數及淋巴細胞和中性粒細胞數量；瓜蔞酸作為瓜蔞“寬胸散結”的主要活性成分，通過降低血小板凝聚、擴張冠狀動脈、增加冠脈血流量、并對垂體后葉素誘導的大鼠急性心肌缺血有明顯保護作用，有效延緩HF進展。這也恰好體現了兩者配伍后先治肺再調心，相須為用以實現心肺共治的作用特點。

綜上，本文的研究從系統藥理學的角度證明了浙貝母-瓜蔞配伍用于慢性阻塞性肺病的治療，可能通過調控ELAVL1-ENO1-NCL軸的表達，在治療COPD進展的同時進一步降低并發心臟衰竭的風險。這與慢性阻塞性肺病并發心臟衰竭的中醫治則理論不謀而合，浙貝母清熱化痰用于治療痰熱咳喘、咯痰黃稠之證，散結開郁用于治療痰熱互結所致的胸悶心煩之證及瘰疬痰核等；瓜蔞利氣開郁，將胸中濁湯下行而起到寬胸散結的功效，用于改善痰氣交阻、胸陽不振所引起的胸痹疼痛，兩者配伍相須為用先治肺再調心以實現心肺共治。

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