二氫楊梅素對鐵過載導致的海馬神經元細胞損傷的保護作用及其機制

［摘要］ 目的

探討二氫楊梅素（DMY）對枸櫞酸鐵銨（FAC）導致的原代海馬神經元細胞損傷的保護作用及其機制。

方法 取出生24 h SD乳鼠的原代海馬神經元進行體外培養，使用CCK-8法檢測不同濃度DMY處理后的原代海馬神經元細胞的活性，確定DMY給藥濃度。將原代海馬神經元細胞分為對照組（H組）、100 mmol/L濃度的DMY處理組（I組）、250 mmol/L濃度的FAC處理組（J組）、100 mmol/L濃度的DMY與250 mmol/L濃度的FAC共處理組（K組），使用流式細胞術檢測各組細胞中活性氧（ROS）的含量，使用比色法檢測各組細胞中丙二醛（MDA）的含量，采用Western blot方法檢測各組細胞中的NF-E2相關因子2（Nrf2）、血紅素加氧酶-1（HO-1）和谷胱甘肽過氧化酶4（GPX4）蛋白的表達水平。

結果 CCK-8檢測結果顯示，在DMY濃度為100 mmol/L時，原代海馬神經元細胞的存活率最高（F=9.95，Plt;0.05），故以該濃度用于后續實驗。與H組相比，J組細胞中ROS和MDA含量明顯升高（F=176.81、5 523.35，Plt;0.05）；與J組相比，K組細胞中ROS含量和MDA含量明顯降低（F=18.21、412.96，Plt;0.05）。與H組相比，J組細胞中Nrf2、HO-1、GPX4蛋白相對表達量明顯降低（F=27.35～81.32，Plt;0.05）；與J組相比，K組細胞中的Nrf2、HO-1、GPX4蛋白相對表達量明顯升高（F=8.74～21.46，Plt;0.05）。

結論 DMY可以緩解鐵過載導致的原代海馬神經元氧化應激損傷，其機制可能與其激活了原代海馬神經元中的Nrf2-HO-1/GPX4通路有關。

［關鍵詞］ 二氫楊梅素；鐵超負荷；海馬；神經元；氧化性應激；NF-E2相關因子2；血紅素加氧酶-1；谷胱甘肽過氧化酶

［中圖分類號］ R284；R589.9；R349.1

［文獻標志碼］ A

Protective effect of dihydromyricetin against hippocampal neuronal injury caused by iron overload and its mechanism

SUI Yunjie， MA Zegang

（Department of Physiology and Pathophysiology， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

; ［ABSTRACT］＼ Objective To investigate the protective effect of dihydromyricetin （DMY） against injury of primary hip-

pocampal neurons caused by ferric ammonium citrate （FAC） and its mechanism.

Methods Primary hippocampal neurons were collected from 24-hour neonatal Sprague-Dawley rats for in vitro culture， and CCK-8 assay was used to measure the viability of primary hippocampal neurons treated with different concentrations of DMY and determine the administration concentration of DMY. Primary hippocampal neurons were divided into control group （H group）， 100 mmol/L DMY treatment group （I group）， 250 mmol/L FAC treatment group （J group）， and 100 mmol/L DMY+250 mmol/L FAC treatment group （K group）. Flow cytometry was used to measure the content of reactive oxygen species （ROS） in each group; colorimetry was used to measure the content of malondialdehyde （MDA） in each group; Western blot was used to measure the protein expression levels of nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2）， heme oxygenase-1 （HO-1）， and glutathione peroxidase 4 （GPX4） in each group.

Results

CCK-8 assay showed the highest viability of primary hippocampal neurons at the concentration of 100 mmol/L for DMY （F=9.95，Plt;0.05）， and therefore， this concentration was used for subsequent experiments. Compared with the H group， the J group had significant increases in the content of ROS and MDA （F=176.81，5 523.35，Plt;0.05）， and compared with the J group， the K group had significant reductions in the content of ROS and MDA （F=18.21，412.96，Plt;0.05）. Compared with the H group， the J group had significant reductions in the relative protein expression levels of Nrf2， HO-1， and GPX4 （F=27.35-81.32，Plt;0.05）， and compared with the J group， the K group had significant increases in the relative protein expression levels of Nrf2， HO-1， and GPX4 （F=8.74-21.46，Plt;0.05）.

Conclusion DMY can alleviate oxidative stress damage in primary hippocampal neurons due to iron overload， possibly by activating the Nrf2-HO-1/GPX 4 pathway in primary hippocampal neurons.

［KEY WORDS］ Dihydromyricetin; Iron overload; Hippocampus; Neurons; Oxidative stress; NF-E2-related factor 2; Heme oxygenase-1; Glutathione peroxidase

鐵是人體必需的微量元素，但過量的鐵會引起鐵過載，從而導致不良反應［1］。隨著年齡的增長或不良飲食習慣等多種原因，鐵過載會發生在人體多個器官中，大腦中的海馬體是鐵過載的高發區域之一，鐵過載會引起海馬神經元發生氧化應激，進而引發癲癇、記憶衰退等，嚴重時甚至會引起阿爾茲海默癥（Alzheimer’s disease，AD）等一系列神經退行性疾病［1-2］。目前臨床治療鐵過載的方法主要有鐵螯合劑藥物治療或放血治療。鐵螯合劑藥物治療會使人體產生多種不良反應，如嘔吐、腹瀉、關節疼痛等，放血治療適用對象有限，僅適用于非貧血患者［3］，因此尋找安全且有效的治療手段是臨床治療鐵過載的迫切需要。大量研究表明，姜黃素、大黃素等天然物質可以有效抑制鐵過載造成的細胞損傷，維持機體鐵穩態［4-5］，其他植物來源的天然黃酮類化合物是否有類似的作用還有待驗證。

江西盛產的藤茶在我國藥用歷史悠久，其提取物二氫楊梅素（DMY）可以緩解包括帕金森綜合征（PD）和AD在內的多種神經退行性疾病的癥狀［6］。然而關于DMY對鐵過載導致的海馬神經元損傷是否具有保護作用尚不明確。本研究通過枸櫞酸鐵銨（FAC）構建SD大鼠原代海馬神經元鐵過載模型，觀察DMY對鐵過載致乳鼠海馬神經元氧化應激損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

出生24 h的健康SD乳鼠，體質量為3～6 g，總共60只，全部購買于青島大任富城畜牧有限公司。DMEM/F-12培養基購自美國Hyclone公司，青鏈霉素混合液購買于蘇州新賽美生物科技有限公司，CCK-8、B27無血清添加劑購自美國Gibco公司，DMY購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，FAC、二甲基亞砜（DMSO）、多聚賴氨酸購買于美國Sigma公司，兔抗NF-E2相關因子2（Nrf2）、兔抗血紅素加氧酶-1（HO-1）、兔抗谷胱甘肽過氧化酶4（GPX4）、兔抗β-actin及HRP標記山羊抗兔IgG購自杭州華安生物有限公司，三色預染蛋白Marker購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司，2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯（DCFH-DA）購買于安徽白鯊生物科技有限公司，SDS聚丙烯酰胺凝膠、ECL發光液購買于武漢塞維爾生物技術有限公司，丙二醛（MDA）檢測試劑盒購自北京索萊寶生物技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原代海馬神經元細胞的培養 取出生24 h SD乳鼠共10只，置于液氮中急凍5 s使其休克。隨后使用體積分數0.75乙醇溶液浸泡消毒后，浸入預冷的DMEM/F-12培養基中，完整地取出乳鼠全腦，分離出左右腦的海馬體并除去脈絡叢。剪碎10只小鼠的海馬體，置于胰蛋白酶中消化5 min，加入含體積分數0.1的FBS的DMEM/F-12培養基中終止消化。吹散組織，用70 μm網篩過濾后收集于離心管中，以1 000 r/min離心5 min，棄上清液。使用細胞計數板調整原代海馬神經元細胞密度為7×108個/L，置于混合培養液（DMEM/F-12培養基中加入含體積分數0.02的B27無血清添加劑和體積分數0.01的青霉素-鏈霉素）中，于37 ℃、含體積分數0.05的CO2的培養箱中培養，每3 d進行一次半換液。7 d之后通過顯微鏡進行觀察，當海馬神經元細胞胞體豐滿，光暈明顯，突起增粗、變長，并連接成錯綜復雜的神經網絡時，提示細胞成熟，可用于后續實驗。實驗重復6次，每次取10小鼠。

1.2.2 藥物配置 將DMY溶于DMSO中，配置濃度為10 mol/L的儲存液。FAC置于DMEM/F-12培養基中，配置濃度為10 mol/L的培養液。后續使用時再分別將DMY與FAC稀釋成所需濃度。

1.2.3 CCK-8實驗篩選DMY的適宜濃度 將濃度為10 mol/L的FAC稀釋至250 mmol/L，并將濃度為10 mol/L的DMY稀釋為0.1、1、10、100及200 mmol/L。將成熟的原代海馬神經元細胞接種于96孔板中，每孔約5 000個，分為A～G組。A組細胞在混合培養液中培養24 h，B組細胞在混合培養液中加入250 mmol/L濃度FAC培養24 h，C～G組細胞混合培養液中分別加入250 mmol/L濃度的FAC和0.1、1、10、100、200 mmol/L濃度的DMY，培養24 h。棄去原培養液以后，每孔加入200 μL 的CCK-8混合工作液（混合培養液與CCK-8工作液的比例為91），在培養箱中孵育2 h。將酶標儀的發射波長設為450 nm，使用雙蒸水調零，檢測每孔中CCK-8工作液的吸光度值，計算各組細胞的細胞存活率。細胞存活率=（各組細胞的吸光度值/A組細胞的吸光度值）×100%。根據各組的細胞存活率，選擇最適宜的濃度用于后續實驗。

1.2.4 細胞分組和處理 將成熟原代海馬神經元細胞接種于6孔板中，每孔約80 000個，分為H～K組。H組細胞在混合培養液之中培養24 h，I～K組細胞分別于混合培養液之中加入100 mmol/L濃度DMY、250 mmol/L濃度FAC、100 mmol/L濃度DMY+250 mmol/L濃度FAC，培養24 h。

1.2.5 細胞中ROS水平的檢測 將6孔板中培養24 h的H～K組細胞棄去原培養液，使用PBS清洗3次，每孔加入1 mL含10 mmol/L DCFH-DA的PBS，移至培養箱中避光孵育30 min，吸去原培養液，再以PBS清洗3次后，每孔中加入1 mL PBS制成細胞懸液，以200目網篩過濾后，置于流式試管中渦旋振蕩，充分混合均勻。將流式細胞儀的激發波長設為495 nm，發射波長設為529 nm，設置檢測細胞數量為10 000個，使用流式細胞術檢測各組細胞的ROS水平。先將H組細胞相對熒光強度設置為25%，隨后使用流式細胞儀檢測I～K組細胞的相對熒光強度，以此計算各組細胞的ROS水平。

1.2.6 細胞中MDA水平的檢測 將6孔板中培養24 h的H～K組細胞棄去原培養液，使用PBS清洗3次，每孔中加入300 μL提取液制成細胞懸液，移至EP管中，使用超聲破碎儀（功率200 W）進行破碎，重復30次，每次時長3 s，兩次破碎間隔10 s。然后4 ℃下8 000 r/min離心10 min，取上清液100 μL置于另一EP管中，加入100 μL檢測液。以100 μL蒸餾水＋100 μL檢測液為空白組。將空白組和各樣本組均100 ℃加熱60 min，冰上冷卻后，常溫10 000 r/min離心10 min，取上清液，使用酶標儀測定波長532 nm和600 nm處的吸光度（A）值，并采用相關的公式計算各組細胞當中MDA的含量。MDA含量（nmol/107 cell）=107.5×△A，其中△A=（A532測定－A532空白）－（A600測定－A600空白）。

1.2.7 Western blot實驗檢測細胞中Nrf2、HO-1、GPX4蛋白的含量 取H～K組培養24 h的原代海馬神經元細胞，使用RIPA裂解液將細胞充分裂解后，收集裂解液，然后4 ℃下12 000 r/min離心30 min。將上清液轉移至新的離心管中，加入1/4體積的5×loading buffer，充分振蕩混勻，煮沸10 min，收集蛋白樣本。通過SDS-PAGE電泳分離蛋白，并轉移到PVDF膜上。用體積分數0.05的脫脂牛奶在室溫下封閉膜2 h，一抗4 ℃下孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min。再用辣根過氧化物酶標記的二抗在室溫下與膜孵育1 h，洗膜，隨后在暗室中曝光顯影。利用Image J軟件分析蛋白灰度值，并以β-actin作為內參，計算各目的蛋白的相對表達量。

1.3 統計學處理

使用 SPSS 27.0軟件對數據進行統計分析。計量資料以x-±s表示。細胞存活率的比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較使用Turkey法。不同分組間比較采用2×2析因設計的方差分析。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結" 果

2.1 不同濃度DMY對FAC處理的原代海馬神經元細胞活力的影響

A～G組原代細胞的存活率分別為（90.59±31.56）%、（37.06±9.99）%、（40.02±12.47）%、（59.62±25.20）%、（63.43±20.91）%、（67.78±22.89）%、（46.68±17.74）%。單因素方差分析的結果顯示，各組比較差異具有顯著意義（F=9.95，Plt;0.05），其中F組的細胞存活率顯著高于B組（Plt;0.05）。各實驗組中F組原代海馬神經元細胞的細胞存活率最高，以該濃度用于后續實驗。

2.2 DMY對FAC處理的原代海馬神經元ROS水平的影響

H～K組的ROS陽性細胞數量占細胞總數的比例分別為（24.78±2.16）%、（23.17±4.23）%、（65.03±4.32）%、（43.86±9.03）%。2×2析因設計的方差分析結果顯示，FAC、DMY及DMY與FAC的交互作用均對細胞內ROS的含量差異有顯著影響（FFAC=176.81，FDMY=24.73，F交互=18.21，Plt;0.05）。單獨效應結果顯示，用FAC處理時，DMY處理與不處理差別有統計學意義（F=42.68，Plt;0.05），不用FAC處理時，DMY處理與不處理差異無統計學意義（Pgt;0.05）；用DMY處理時，FAC處理與不處理差異具有統計學意義（F=40.77，Plt;0.05），不用DMY處理時，FAC處理與不處理差異有統計學意義（F=154.25，Plt;0.05），DMY可明顯降低FAC導致的ROS積累。

2.3 DMY對FAC處理的原代海馬神經元MDA水平的影響

H～K組神經元細胞當中MDA含量分別為（2.08±0.14）、（2.00±0.04）、（6.48±0.07）、（4.51±0.16）nmol/107 cell。2×2析因設計方差分析結果顯示，FAC、DMY及DMY與FAC交互作用均對細胞內MDA的含量均有顯著影響（FFAC=5 523.35，FDMY=484.87，F交互=412.96，Plt;0.05）。單獨效應結果顯示，用FAC處理時，DMY處理與不處理差別有統計學意義（F=896.39，Plt;0.05），不用FAC處理時，DMY處理與不處理差別無統計學意義（Pgt;0.05）；用DMY處理時，FAC處理與不處理差別有統計學意義（F=1 457.88，Plt;0.05），不用DMY處理時，FAC處理與不處理差別有統計學意義（F=4 478.44，Plt;0.05），DMY可明顯降低FAC導致的MDA積累。

2.4 DMY對FAC處理的原代海馬神經元細胞中Nrf2、HO-1、GPX4蛋白相對表達量的影響

2×2析因設計的方差分析結果顯示，FAC對細胞內Nrf2、HO-1、GPX4相對表達量有顯著影響（FFAC=27.36～81.32，Plt;0.05），DMY對細胞內Nrf2、HO-1、GPX4相對表達量有顯著影響（FDMY=9.71～15.69，Plt;0.05），DMY與FAC對細胞內Nrf2、HO-1、GPX4的相對表達量的影響存在交互效應（F交互=8.74～21.46，Plt;0.05）。單獨效應結果顯示，用FAC處理時，DMY處理與不處理差異有統計學意義（F=23.92～30.02，Plt;0.05），不用FAC處理時，DMY處理與不處理差異無統計學意義（Pgt;0.05）；用DMY處理時，FAC處理與不處理Nrf2、HO-1相對表達量差異具有統計學意義（F=12.87，9.62，Plt;0.05），不用DMY處理時，FAC處理與不處理差異有統計學意義（F=33.51～93.16，Plt;0.05），DMY顯著緩解了FAC導致的原代海馬神經元細胞中Nrf2、HO-1、GPX4表達量的降低。見圖1、表1。

3 討" 論

鐵參與了細胞中許多正常的生理過程，但當細胞中的鐵過多時，多余的鐵會通過芬頓反應導致細胞產生氧化應激反應［2］。海馬體是神經系統中最重要的結構之一，具有形成記憶和定位方向的功能［7］。鐵是海馬體發揮功能所必需的微量元素，但過量鐵會對海馬體中的海馬神經元產生神經毒性。研究證

實，鐵過載所致海馬神經元氧化應激與包括AD在

內的多種神經系統疾病的產生與惡化有關［8］。

目前治療鐵過載的方法均存在不同程度的局限性，因此尋找新的治療鐵過載的方法是臨床的迫切需要［3］。隨著近年來對中藥資源的不斷開發與利用，相關研究發現許多植物來源的天然化合物治療鐵過載效果良好［4-5］。DMY是一種具有天然活性的黃酮類化合物，具有抗氧化特性，可通過調節細胞和機體的氧化應激反應預防和治療中樞神經系統相關的多種疾病［9-10］。如研究發現，DMY可以通過調節氧化應激和抑制乙酰膽堿酯酶的活性緩解D-半乳糖誘導的衰老小鼠的認知障礙；DMY還可以通過調節Akt/GSK-3β通路降低多巴胺能神經元的氧化應激，緩解PD的癥狀［11-12］。但DMY能否對鐵過載致海馬神經元氧化應激產生影響以及相關機制尚不明確。

本研究首先使用CCK-8實驗檢測了不同濃度DMY對FAC處理后的海馬神經元細胞活力的影響，結果表明DMY能以濃度依賴的方式緩解鐵過載致海馬神經元細胞活性的降低，在DMY的濃度為100 mmol/L時，對于鐵過載致海馬神經元細胞活性降低的緩解作用最強，因此選用100 mmol/L DMY進行后續研究。

當細胞發生氧化應激時，線粒體會在短時間內生成大量ROS，過多的ROS會損傷細胞中的膜結構，產生大量的MDA［13-14］。本研究結果顯示，鐵過載導致了海馬神經元細胞中ROS水平和MDA含量升高，DMY的處理抑制了鐵過載導致的海馬神經元中ROS水平和MDA含量的升高，提示DMY可能是緩解了鐵過載致海馬神經元細胞氧化應激，從而減輕了鐵過載對海馬神經元細胞損傷。

Nrf2是細胞抵御氧化應激的重要因子，可調節細胞內的氧化-抗氧化系統，Nrf2可直接影響細胞內的超氧化物歧化酶和體內一系列與抗氧化有關的因子，維持機體氧化平衡［15-17］。HO-1在血紅素代謝中至關重要，可將血紅素分解成膽綠素，并且參與細胞中的鐵代謝和氧化應激反應［18-19］。GPX4具有清除膜脂過氧化氫產物、調節脂質代謝和預防氧化應激的能力，是細胞中參與氧化應激反應的重要調節因子［20-22］。細胞中的Nrf2-HO-1/GPX4通路與氧化應激密切相關，Nrf2是細胞抗氧化系統的主要調控因子，在介導鐵代謝、脂質代謝和谷胱甘肽合成方面也發揮著關鍵的作用，HO-1和GPX4均受到Nrf2的調控［23-25］。有證據表明，Nrf2-HO-1/GPX4通路廣泛存在于神經系統中，對神經系統正常運行具有重要意義，如激活Nrf2-HO-1/GPX4通路可促進腦源性神經營養因子的表達，維持神經元形態，抑制氧化應激反應及鐵死亡致神經系統疾病［26-29］。為進一步明確DMY對鐵過載致海馬神經元氧化應激的影響，本研究通過Western blot實驗檢測了H～K組細胞中Nrf2、HO-1和GPX4蛋白的相對表達量，結果顯示，FAC的處理顯著降低了海馬神經元細胞中的Nrf2、HO-1和GPX4蛋白的表達量，而DMY抑制了鐵過載導致的海馬神經元中Nrf2以及HO-1、GPX4表達量的降低。本研究結果提示DMY可緩解鐵過載致原代海馬神經元氧化應激，其機制可能是DMY激活了海馬神經元細胞中的Nrf2-HO-1/GPX4通路。

本研究結果顯示，J組細胞中的Nrf2和HO-1的相對表達量與H組相比顯著降低，這表明在海馬神經元細胞中，鐵過載會抑制Nrf2和HO-1的表達。有研究顯示，小鼠體內發生鐵過載會激活肝細胞中Nrf2和HO-1的表達［30］。分析兩項研究不一致的原因，可能與海馬神經元細胞與肝細胞的結構和功能不同有關，但具體原因還需要進一步驗證。

綜上所述，天然活性物質DMY可通過抑制鐵過載致海馬神經元細胞的氧化應激反應，減輕鐵過載對原代海馬神經元的損傷，其機制可能與激活了海馬神經元細胞中的Nrf2-HO-1/GPX4通路有關。本研究為DMY治療海馬體鐵過載的研究提供了細胞實驗支持，但是否在動物或人體內也具有同樣的作用，還有待進一步深入探討。

倫理批準和動物權利聲明：本研究涉及的所有動物實驗已通過青島大學醫學部倫理委員會的審核批準（文件號QDU-AEC-2024451）。所有實驗過程均遵照科技部《實驗動物管理條例》的條例進行。

作者聲明：所有作者均參與了研究的設計、論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯 耿波）