脂溶性貝類毒素檢測技術(shù)研究進(jìn)展

摘 要：脂溶性貝類毒素是一類在貝類脂肪組織中富集，具有熱穩(wěn)定性，易溶于有機(jī)溶劑的毒素。由于其具有脂溶性特征，所以易在生物體中蓄積，且不易被代謝和破壞，會給消費(fèi)者帶來潛在危害。因此，高效、準(zhǔn)確地檢測這類毒素，對保證貝類食用安全是十分必要的。本文對脂溶性貝類毒素常用的檢測技術(shù)進(jìn)行了綜述和對比評估，旨在發(fā)現(xiàn)更高效、靈敏和準(zhǔn)確的檢測方法，為脂溶性貝類毒素檢測技術(shù)的改良和創(chuàng)新提供支撐和借鑒。

關(guān)鍵詞：脂溶性貝類毒素；檢測技術(shù)；貝類

Research Progress on Detection Techniques for Lipophilic Shellfish Toxins

JIANG Diyao1，2， WU Xiaoxiao1，2， XU Jingjing1，2

（1.Nanjing Institute of Product Quality Inspection （Nanjing Institute of Quality Development and Advanced Technology Application）， Nanjing 210019， China;"2.Key Laboratory of Biotoxin Analysis amp; Assessment for State Market Regulation， Nanjing 210019， China）

Abstract： Lipophilic shellfish toxins are a class of shellfish toxins that accumulate in the adipose tissue of shellfish and exhibit thermal stability and solubility in organic solvents. Due to its lipophilic properties， it is prone to accumulate in living organisms and is not easily metabolized or destroyed， thereby posing potential risks to consumers. Therefore， efficient and accurate detection of such toxins is essential to ensure the safety of shellfish consumption. This paper provides a review and comparative evaluation of commonly used detection techniques for lipophilic shellfish toxins， aiming to discover effective， sensitive， and precise detection methods， to support advancements and innovations in lipophilic shellfish toxin detection technologies in the future.

Keywords： lipophilic shellfish toxins; detection techniques; shellfish

貝類產(chǎn)品因豐富的營養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的風(fēng)味口感深受消費(fèi)者喜愛。然而，貝類以藻類為食，內(nèi)臟和肌肉組織中存在蓄積的藻類毒素，這些毒素經(jīng)食物鏈進(jìn)入人體后會迅速產(chǎn)生毒性。貝類毒素結(jié)構(gòu)復(fù)雜且種類繁多，根據(jù)其溶解性可分為脂溶性貝類毒素和水溶性貝類毒素，其中脂溶性貝類毒素主要是指含有特殊聚醚結(jié)構(gòu)且易溶解于有機(jī)溶劑的毒素，包括原多甲藻酸毒素、短裸甲藻毒素、環(huán)亞胺類毒素、大田軟海綿酸毒素、扇貝毒素和蝦夷扇貝毒素等。由于脂溶性貝類毒素毒性大、致毒反應(yīng)快，且難以被加熱破壞，易給食用者帶來安全威脅。此外，脂溶性貝類毒素的危害還具有突發(fā)性和廣泛性。因此，該成分的定性、定量檢測與含量控制對于保障消費(fèi)者的食用安全至關(guān)重要。本文總結(jié)了脂溶性貝類毒素常見的檢測技術(shù)及應(yīng)用，以期為該類毒性物質(zhì)檢測方法的選擇和脂溶性貝類毒素檢測技術(shù)的發(fā)展提供參考。

1 小鼠生物法

小鼠生物法是將樣品提取液注射入小鼠腹腔，通過觀察小鼠的反應(yīng)來計(jì)算樣品毒力的一種生物學(xué)檢測方法。TAKESHI等[1]最早使用小鼠生物法對貝類進(jìn)行毒性研究，結(jié)果在貝類的肝胰腺中發(fā)現(xiàn)了一種新型的脂溶性毒素。由于能夠真實(shí)反映貝類毒素在生物體內(nèi)的情況，小鼠生物法已被美國、歐盟、日本和中國等多個(gè)國家和組織認(rèn)定為貝類毒素檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，該方法的準(zhǔn)確度大幅提升，覆蓋的目標(biāo)物種類也越來越多，檢出限可達(dá)到ng·mL-1級別。

小鼠生物法的結(jié)果對毒素危害性分析和建立其安全性評價(jià)體系有直接的指導(dǎo)意義，且使用范圍廣，無須借助大型分析儀器，目前仍然作為貝類毒素的常規(guī)監(jiān)控分析技術(shù)。然而，該方法存在不能確定毒素結(jié)構(gòu)，靈敏度有限、假陽性高，檢測結(jié)果受小鼠的品系、體重、批次等影響較大，小鼠選育和培育成本高和實(shí)驗(yàn)時(shí)間長等問題，且動物實(shí)驗(yàn)在動物福利等方面爭議較大，因此，小鼠生物法已逐漸被其他操作簡便、可比性強(qiáng)、費(fèi)用較低的檢測方法替代。

2 細(xì)胞毒性測試

細(xì)胞毒性測試是將毒性物質(zhì)加入選定的細(xì)胞中，通過細(xì)胞生長和存活等情況對毒素進(jìn)行定量測試。研究者可通過細(xì)胞存活率或融合度等體現(xiàn)細(xì)胞活力的變化指標(biāo)來反映脂溶性貝類毒素對細(xì)胞的毒性作用。FLANAGAN等[2]基于細(xì)胞毒性測試原理，將混合毒素與HepG2或ECV-34細(xì)胞系接觸，建立一種雙終點(diǎn)檢測方法。該方法可通過暴露于樣品3 h后的形態(tài)學(xué)檢查檢測大田軟海綿酸類毒素，再通過相同細(xì)胞暴露于樣品24 h后的存活率測試檢測原多甲藻酸毒素，可用于兩類脂溶性貝類毒素的鑒定。黃海燕等[3]利用大田軟海綿酸能破壞細(xì)胞F-肌動蛋白的聚合，探討大田軟海綿酸對HL-7702細(xì)胞的毒性效應(yīng)，并根據(jù)被標(biāo)記的F-激動蛋白熒光強(qiáng)度的變化，建立間接檢測大田軟海綿酸毒素的方法。結(jié)果表明，檢測數(shù)據(jù)在2.5～40.0 nmol·L-1時(shí)線性關(guān)系良好，檢測限值可達(dá)到20.1 μg·kg-1，方法加標(biāo)回收率在92.76%～96.49%，可用于有毒貝類的篩查與檢測。

細(xì)胞毒性測試相較于小鼠生物法，檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度得到提升。同時(shí)，用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)替代動物實(shí)驗(yàn)，也符合國際3R原則。細(xì)胞毒性測試法除了能檢測毒性大小，還可以作為研究毒素致毒機(jī)理的良好模型。但是，細(xì)胞毒性測試也存在一定的局限性。例如，細(xì)胞培養(yǎng)需要額外的培養(yǎng)室和專業(yè)的培養(yǎng)人員進(jìn)行無菌操作，實(shí)驗(yàn)周期長；細(xì)胞的差異和培養(yǎng)條件等會影響細(xì)胞毒性測試的準(zhǔn)確性；該方法特異性和重現(xiàn)性較差。

3 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法是一種基于抗原抗體反應(yīng)的定量檢測方法，具有高通量、靈敏度高、特異性好、重復(fù)性強(qiáng)和檢測快速等優(yōu)點(diǎn)，是國際通用的一類免疫學(xué)檢測方法。SAMDAL等[4]制備了羊多克隆抗體，建立了用于貝類、藻類細(xì)胞和培養(yǎng)上清液中原多甲藻酸毒素的酶聯(lián)免疫吸附定量法，總原多甲藻酸毒素檢出限為57 μg·kg-1，低于歐盟安全限量。SASSOLAS等[5]使用酶標(biāo)大田軟海綿酸建立的直接競爭酶聯(lián)免疫吸附法檢出限為0.006 mg·L-1，靈敏度比基于間接標(biāo)記的常規(guī)免疫測定法高10倍。酶聯(lián)免疫吸附法檢測脂溶性貝類毒素已被世界多國采用，市場上也有多種商品化試劑盒。

與生物分析測試相比，酶聯(lián)免疫吸附法檢測的靈敏度與特異性高于生物分析測試，且實(shí)驗(yàn)周期短、操作簡便、設(shè)備簡單，更適合現(xiàn)場檢測。但在實(shí)際檢測時(shí)，抗體往往只針對單一組分，如果同組貝類毒素?cái)?shù)量多且結(jié)構(gòu)相似，就很容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性較差。此外，該方法依賴高質(zhì)量抗體，檢測結(jié)果無法提供具體的成分信息。綜上，該方法在脂溶性貝類毒素檢測中的應(yīng)用存在較大局限性。

4 儀器分析法

近年來，高效液相色譜-紫外檢測、高效液相色譜-熒光檢測和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）等化學(xué)儀器分析法被廣泛應(yīng)用于脂溶性貝類毒素的檢測中。與小鼠生物法與酶聯(lián)免疫法相比，高效液相色譜-熒光檢測雖然更靈敏準(zhǔn)確，但操作前處理過程煩瑣，操作要求較高，且結(jié)構(gòu)相似的毒素不易進(jìn)行色譜分離。此外，由于多數(shù)脂溶性貝類毒素?zé)o法自身產(chǎn)生熒光，且紫外吸收弱甚至無吸收，導(dǎo)致高效液相色譜-紫外檢測和高效液相色譜-熒光檢測方法的應(yīng)用受到較大限制。

隨著質(zhì)譜技術(shù)的快速發(fā)展，HPLC-MS/MS因分析速度快、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)勢，進(jìn)入脂溶性貝類毒素檢測領(lǐng)域。該方法前處理無須衍生，相同保留時(shí)間的目標(biāo)物可以根據(jù)質(zhì)荷比差異定量分析，還可通過質(zhì)譜碎片實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物結(jié)構(gòu)的確認(rèn)。

2012年，歐盟制定了HPLC-MS/MS測定軟體動物中脂溶性海洋生物毒素的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)操作程序。2016年，中國也將HPLC-MS/MS納入國家檢測方法標(biāo)準(zhǔn)。為了達(dá)到更好的分離效率，實(shí)現(xiàn)更多目標(biāo)物同時(shí)檢測，提高回收率與重復(fù)性，許多研究人員也基于HPLC-MS/MS陸續(xù)開發(fā)出更多的檢測方法。陳劍剛等[6]優(yōu)化了前處理與儀器檢測條件，樣品經(jīng)甲醇溶液提取和固相萃取凈化后，使用高效液相色譜分離貝類產(chǎn)品中6種脂溶性貝類毒素，并用串聯(lián)質(zhì)譜檢測，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校正，外標(biāo)法定量。建立的HPLC-MS/MS檢測方法在各目標(biāo)物對應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性系數(shù)良好，定量限為0.2～1.0 μg·kg-1，方法的選擇性好、準(zhǔn)確度高。劉青等[7]采用QuEChERS凈化技術(shù)對4種脂溶性貝類毒素富集凈化后，用乙腈與水溶液梯度洗脫，C18柱分離，多反應(yīng)監(jiān)測模式掃描，外標(biāo)法定量，平均回收率大于80%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%，方法線性關(guān)系良好，快速簡便，靈敏度高，回收率、精密度和重現(xiàn)性較好，可用于進(jìn)出口食用貝類中原多甲藻酸毒素等4種脂溶性貝類毒素的檢測。萬嘉峻等[8]采用純甲醇提取，正己烷除油脂，富集凈化后使用HPLC-MS/MS法檢測，建立了同時(shí)定量分析10種脂溶性貝類毒素的檢測方法。該方法基質(zhì)干擾小，檢出限為0.104～3.870 μg·kg-1，回收率和精密度高，可用于脂溶性貝類毒素的痕量檢測。

5 結(jié)語

我國貝類毒素中毒事件時(shí)有發(fā)生，多種新型脂溶性貝類毒素不斷出現(xiàn)，這使我國面臨越來越嚴(yán)峻的海洋貝類食品安全風(fēng)險(xiǎn)。開發(fā)高效、準(zhǔn)確的脂溶性貝類毒素檢測技術(shù)成為當(dāng)前研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。隨著各種檢測方法的研究和實(shí)踐，脂溶性貝類毒素的檢測技術(shù)在小鼠生物法、細(xì)胞毒性測試、酶聯(lián)免疫吸附法、儀器分析法等方面進(jìn)展較快，特別是在高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜領(lǐng)域，已發(fā)展出多種靈敏、高效、穩(wěn)定的檢測方法，為脂溶性貝類毒素檢測技術(shù)的發(fā)展提供了有力支持。

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