一種新型天然食品防腐劑桂花耳糖脂含量測定方法

摘要：桂花耳糖脂是通過匙蓋假花耳菌株在合適條件下發(fā)酵生產(chǎn)得到的長鏈糖脂，是一種天然、高效的新型食品防腐劑和添加劑，其優(yōu)于乳酸鏈球菌素、納他霉素、聚賴氨酸、丙酸鈣、苯甲酸鈉和山梨酸鉀的抑菌活性使它具備了廣闊的應(yīng)用前景。目的 建立一個準(zhǔn)確、高效的含量分析檢測方法，以保證桂花耳糖脂產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定。方法 將桂花耳糖脂樣品酸化水解和衍生處理得到木糖和葡萄糖，通過氣相色譜方法定量檢測木糖和葡萄糖衍生物含量，從而得到桂花耳糖脂的含量。結(jié)果 木糖衍生物濃度在0.3009～0.7022 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9996，線性方程為y=1.4406x－0.0162；葡萄糖衍生物濃度在0.3001～0.7003 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.9997，線性方程為y=1.4255x+0.0050；在80%～120%范圍內(nèi)，總糖脂的回收率為99.30%～99.69%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.10%～0.17%，精密度相對平均偏差為0.14%。結(jié)論 該分析方法穩(wěn)定，定量準(zhǔn)確，專屬性強，可滿足桂花耳糖脂的含量測定。

關(guān)鍵詞：桂花耳糖脂；抑菌；防腐劑；衍生；氣相色譜法；分析方法驗證

中圖分類號：R917 文獻標(biāo)志碼：A" " " " "文章編號：1001-8751（2024）05-0353-06

Content Determination Method of a New Natural Food Preservative

Named Osmanthus Ear Glycolipids

Zhang Jun，Li Yu-xi，Pan Zi-jun，Yang Kai-li，Shao Wu-jun

（Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co.， LTD.， Tazhou" "Zhejiang 318000）

Abstract： A kind of Long-Chain Glycolipids named Osmanthus ear glycolipids is produced by Dacryopinax spathularia by fermentation under suitable culture conditions. It is a new kind of natural and efficient food preservative. The bacteriostatic activity of Osmanthus ear glycolipids produced by fermentation was studied. The result showed that it has a better bacteriostatic ability than Nisin， Natamycin， Polylysine， Calcium propionate， Sodium benzoate and Potassium sorbate. Objective To establish an accurate and efficient analysis method of content to ensure the stability of the quality of osmanthus ear glycolipids. Methods Osmanthus ear glycolipids can be converted to xylose and glucose by acidizing hydrolysis and derivatization. By counting the content of derivatives of xylose and glucose by high performance gas chromatography， the content of osmanthus ear glycolipids can be calculated. Result The xylose derivative had a good linear relationship（r=0.9996） within 0.3009 μg/mL～0.7022 μg/mL， and the linear equation is y=1.4406x－0.0162. The glucose derivative's linear equation is y=1.4255x+0.0050， and it showed an excellent linear relationship （r=0.9997） between 0.3001 μg/mL and 0.7003 μg/mL. In the content ranges from 80% to 120%， the recovery of total glycolipids is 99.30%～99.69% and RSD is 0.10%～0.17%. In the precision testing， the RSD of content is 0.14%. Conclusion This analysis method is stable， accurate in quantification， and has strong specificity， which can meet the content determination of sugar and lipid in Osmanthus fragrans ear.

Key words： osmanthus ear glycolipids;" "bacteriostatic;" "preservative;" "derivation;" "gas chromatography;" "method validation

桂花耳糖脂是一種新型的天然食品防腐劑[1]，可通過匙蓋假花耳菌株（Dacryopinax spathularia）在合適的培養(yǎng)條件下發(fā)酵產(chǎn)生，典型分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。

桂花耳糖脂產(chǎn)品無異味，不會產(chǎn)生令人不愉快的口感。其生產(chǎn)工藝簡單，產(chǎn)率高，適合大規(guī)模生產(chǎn)。2021年5月，澳大利亞聯(lián)邦公報網(wǎng)站發(fā)布F2021C00408號公告，該公告批準(zhǔn)一種天然糖脂－桂花耳糖脂用作非酒精飲料中的防腐劑[2]，2021年12月，加拿大衛(wèi)生部發(fā)布了關(guān)于允許在各種不含酒精的飲料中使用來自桂花耳產(chǎn)長鏈糖脂作為防腐劑的提案[3]，2022年6月10日，加拿大衛(wèi)生部發(fā)布NOM/ADM-0184號文件，擬修訂允許使用的防腐劑清單，批準(zhǔn)來自匙蓋假花耳的長鏈糖脂用于各種非酒精飲料中[4]，引起了各個領(lǐng)域?qū)υ摦a(chǎn)品的研究熱潮。我公司自2015年已經(jīng)在進行該產(chǎn)品的研究、生產(chǎn)及檢測，已研究出一種高產(chǎn)出的發(fā)酵工藝流程（如圖2所示）。

桂花耳糖脂可視為生物表面活性劑[5]，可以通過改變微生物細(xì)胞膜的通透性，使胞內(nèi)物質(zhì)外泄，從而導(dǎo)致微生物死亡[6-7]。作為天然防腐劑，桂花耳糖脂克服了化學(xué)防腐劑帶來的安全和毒性問題，同時對造成食物和飲料變質(zhì)的微生物顯示出很強的抑菌活性[8-12]，其抑菌范圍比較廣，對細(xì)菌、酵母菌、霉菌和其他耐熱、嗜酸微生物及孢子顯示較強的抑菌能力。通過與乳酸鏈球菌素（Nisin）、納他霉素、聚賴氨酸、苯甲酸鈉和山梨酸鉀等五種防腐劑[13-15]對藤黃八疊球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌的抑菌效果對比，證實了桂花耳糖脂優(yōu)于其他5種防腐劑的抑菌活性。如圖3所示桂花耳糖脂比其他5種防腐劑效果都要好。綜合來看，桂花耳糖脂對細(xì)菌和真菌均有較好的抑制效果，是一種有前景的防腐劑和食品添加劑。

為保證生產(chǎn)桂花耳糖脂產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定，一種可靠的含量分析方法至關(guān)重要。糖脂類產(chǎn)品的含量檢測一般以衍生處理為主[16-19]，通過將桂花耳糖脂樣品酸化水解和衍生化處理得到木糖和葡萄糖衍生物，以阿拉伯糖醇作為內(nèi)標(biāo)物，對木糖和葡萄糖衍生物的含量進行定量測定，以得到準(zhǔn)確的桂花耳糖脂含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 7890B型高效氣相色譜儀（配備FID檢測器），電子天平（美國梅特勒公司），MTN-2800W型氮吹蒸發(fā)儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司），H1650型離心機（湖南湘儀離心機儀器有限公司），ThermoMixer C型恒溫箱[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]，Vortex Mixer XW-80A型旋渦混合器（其林貝爾儀器制造有限公司）。

鹽酸羥胺（滬試化學(xué)試劑），三氟乙酸（美國默克公司），乙酸酐（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），吡啶（江蘇強盛功能化學(xué)股份有限公司），乙酸乙酯（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），乙腈（美國默克公司），去離子水（Milli Q，浙江海正藥業(yè)股份有限公司），葡萄糖（美國默克公司），木糖（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），阿拉伯糖醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），乳糖（美國默克公司）。

1.2 衍生過程

酸性水解：移取60 μL分析溶液于2 mL離心管中，加入200 μL 4 mol/L三氟乙酸水溶液，95 ℃震搖4 h，50 ℃氮吹至溶液完全干燥。

衍生步驟：向吹干后的水解產(chǎn)物中加入150 μL 0.2 mol/L鹽酸羥胺吡啶溶液，90 ℃震搖40 min，再加入250 μL乙酸酐，95 ℃震搖60 min，在60 ℃條件下，氮吹3 h至溶液完全干燥。向吹干后的衍生產(chǎn)物中加入100 μL乙酸乙酯，旋渦振蕩1 min，6000 r/min離心1 min后取上清液至進樣小瓶中。

1.3 溶液配制

稀釋劑：50%乙腈水溶液。

阿拉伯糖醇內(nèi)標(biāo)物溶液（IS標(biāo)準(zhǔn)溶液）：取阿拉伯糖醇對照品適量，加稀釋劑溶解并定量制成濃度為2.5 mg/mL的阿拉伯糖醇溶液。

對照溶液：分別精密稱取木糖和葡萄糖各50 mg置于20 mL容量瓶中，用稀釋劑溶解并稀釋至刻度后混勻；精密移取5.0 mL于25 mL容量瓶中，加入5.0 mL IS標(biāo)準(zhǔn)溶液，用稀釋劑稀釋至刻度后混勻；按照“1.2 衍生過程”項下描述進行酸性水解和衍生，平行制備2份。

樣品溶液：精密稱取桂花耳糖脂樣品250 mg置于20 mL容量瓶中，用稀釋劑超聲溶解并稀釋至刻度后混勻；精密移取5.0 mL于25 mL容量瓶中，精密加入5.0 mL IS標(biāo)準(zhǔn)溶液，用稀釋劑稀釋至刻度后混勻；按照“1.2 衍生過程”項下描述進行酸性水解和衍生，平行制備2份。同法制備空白溶液。

線性儲備溶液：精密稱取木糖和葡萄糖各100 mg于同一40 mL容量瓶中，用稀釋劑溶解并稀釋至刻度后混勻。精密移取線性儲備溶液3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL和7.0 mL于5個25 mL容量瓶中，分別精密加入5.0 mL IS標(biāo)準(zhǔn)溶液，用稀釋劑稀釋至刻度后混勻；按照“1.2 衍生過程”項下描述進行酸性水解和衍生；作為60%、80%、100%、120%、140%線性系列溶液。

準(zhǔn)確度溶液：精密稱取桂花耳糖脂樣品200 mg、250 mg和300 mg于3個20 mL容量瓶中，用稀釋劑溶解并稀釋至刻度后混勻；精密移取5.0 mL于3個25 mL容量瓶中，分別精密加入5.0 mL IS標(biāo)準(zhǔn)溶液，用稀釋劑稀釋至刻度后混勻；按照“1.2 衍生過程”項下描述進行酸性水解和衍生，作為80%、100%和120%準(zhǔn)確度溶液，每個濃度點平行配制3份。

1.4 色譜條件

色譜柱：HP-5MS（30 m×250 μm×0.25 μm）；載氣：N2；載氣流速：1.0 mL/min；分流比：20：1；進樣量：1.0 μL；進樣口溫度：250 ℃；檢測器溫度：300 ℃/FID；柱溫：90 ℃保持1 min，25 ℃/min升至140 ℃，5 ℃/min升至220 ℃，10 ℃/min升至300 ℃，保持5 min；空氣流量：300 mL/min；氫氣流量：30 mL/min；尾吹流量：30 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸性水解時間的確定

實驗考察了不同水解時間（1 h、2 h、3 h、4 h和5 h）對糖脂含量的影響，結(jié)果如圖4所示。糖脂含量檢測結(jié)果隨水解時間增加而增加，最終在4 h時達(dá)到最大值，此后增加水解時間，糖脂含量保持恒定。因此本文優(yōu)化后的水解時間為4 h。

2.2 衍生時間的確定

實驗考察了不同衍生時間（20 min、30 min、

40 min、50 min和60 min）對糖脂含量的影響。結(jié)果如圖5所示，糖脂含量檢測結(jié)果隨衍生時間增加而增加，最終在40 min時達(dá)到最大值，此后增加衍生時間，糖脂含量保持恒定。因此本文優(yōu)化后的衍生時間為40 min。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1 系統(tǒng)適用性和專屬性

木糖/內(nèi)標(biāo)峰面積比值（RSD）為0.06%，葡萄糖/內(nèi)標(biāo)RSD為0.05%；木糖系統(tǒng)適用性溶液（STD）2相對于STD1的回收率為99.42%，葡萄糖STD2相對于STD1的回收率為99.73%。同法配制等濃度的木糖單個專屬性溶液、葡萄糖單個專屬性溶液和專屬性混合溶液，空白溶液在木糖衍生峰、葡萄糖衍生峰保留時間處無干擾，空白溶液中阿拉伯糖醇衍生峰保留時間為15.881 min，專屬性混合溶液中木糖衍生峰保留時間為13.266 min，阿拉伯糖醇衍生峰保留時間為15.871 min，葡萄糖衍生峰保留時間為17.450 min，如圖6所示；單個專屬性溶液中木糖衍生峰保留時間為13.253 min，葡萄糖衍生峰保留時間為17.451 min，保留時間一致；樣品溶液中阿拉伯糖醇衍生峰與木糖衍生峰分離度為29.79，葡萄糖衍生峰與阿拉伯糖醇衍生峰分離度為18.29，大于1.5，符合標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.2 線性

對不同濃度的線性溶液進行測定，以木糖衍生物和葡萄糖衍生物濃度作為橫坐標(biāo)（x， mg/mL），以木糖衍生物和葡萄糖衍生物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積之比作為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見表1、圖7和圖8），木糖衍生峰線性曲線相關(guān)系數(shù)r=0.9996，線性方程y=1.4406x－0.0162，在0.3009～0.7022 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；葡萄糖衍生峰線性曲線相關(guān)系數(shù)r=0.9997，線性方程y=1.4255x+0.0050，在0.3001～0.7003 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度

精密度實驗中，以木糖衍生物和葡萄糖衍生物的含量分別算得桂花耳糖脂總糖脂含量，以二者的含量平均值作為總糖脂含量。總糖脂含量的相對偏差和RSD均滿足認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)，精密度良好，結(jié)果見表2。

2.3.4 準(zhǔn)確度

在桂花耳糖脂總糖脂含量80%～120%范圍內(nèi)，其平均回收率為99.30%～99.69%，RSD為0.10%～0.17%，證明該方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表3。

2.3.5 溶液穩(wěn)定性

樣品溶液在室溫條件下放置24 h，總糖脂含量相當(dāng)于0 h結(jié)果的百分含量為99.79%，說明桂花耳糖脂樣品溶液中總糖脂含量在室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定，結(jié)果見表4。

3 結(jié)論

本研究開發(fā)了一種穩(wěn)定、可靠的樣品前處理的衍生方法，通過高效氣相色譜法對其含量的檢測方法進行了包括系統(tǒng)適用性、專屬性、線性、精密度、準(zhǔn)確度和溶液穩(wěn)定性在內(nèi)的分析方法驗證。該方法穩(wěn)定可靠，具有較為廣闊的應(yīng)用前景，對于桂花耳糖脂的大規(guī)模生產(chǎn)具有不可或缺的意義。

參 考 文 獻

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